本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種taq酶的制備方法，特別是一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈鎖反應(yīng)(pcr)，是一種生物體外擴(kuò)增特定dna片段的技術(shù)，是目前分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要工具。pcr使用的dna聚合酶主要是taq酶，隨著pcr技術(shù)的推廣和應(yīng)用，對(duì)taq酶性質(zhì)的研究日漸重要。

taq酶是一種耐熱的dna聚合酶，從一種水生棲熱菌(thermusaquaticus)中分離得到。該酶具有熱穩(wěn)定性，但在20℃～37℃下仍有一定聚合酶活性，容易產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增及產(chǎn)生引物二聚體。為解決這些問(wèn)題，人們發(fā)明了熱啟動(dòng)pcr，通過(guò)多種途徑提高taq酶的最適反應(yīng)溫度，達(dá)到pcr反應(yīng)熱啟動(dòng)的目的，以最大程度地減少非特異性的擴(kuò)增。

常用的熱啟動(dòng)pcr有以下幾種方式：化學(xué)封閉法，需預(yù)加熱，易損傷dna；肝素鹽法，需預(yù)加熱，易損傷dna；物理隔絕法，易對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物造成污染；單鏈dna結(jié)合蛋白抑制法，多次高低溫循環(huán)易使肽鍵斷裂；肽抑制法，多次高低溫循環(huán)易使肽鍵斷裂。此外，中國(guó)專利申請(qǐng)201610737135公開(kāi)了一種利用taq酶與其ssdna適配子結(jié)合達(dá)到熱啟動(dòng)pcr的方法。該方法通過(guò)selex技術(shù)篩選與taq酶具有親和性的ssdna適配子。但是，與抗體相比，高親和性的ssdna適配子尚未被廣泛篩選出來(lái)，親和力不高，勢(shì)必會(huì)影響熱啟動(dòng)pcr的特異性。

抗原抗體結(jié)合抑制法也是一種常見(jiàn)的途徑來(lái)提高taq酶的最適反應(yīng)溫度。用taq酶免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得抗taq酶的單抗或者多抗。通過(guò)此方法，在pcr反應(yīng)中，低溫下酶與抗體形成抗原抗體復(fù)合物，使得聚合酶暫時(shí)失活；而在較高溫度下時(shí)，抗體變性，使得taq酶得以釋放發(fā)揮活性，從而實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)。

常規(guī)的抗原抗體結(jié)合抑制法同樣具有多次高低溫循環(huán)易使肽鍵斷裂導(dǎo)致抗體失活的缺點(diǎn)。但是，隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，小型抗體不斷出現(xiàn)。其中，單域抗體是指保留了較好的抗原結(jié)合能力和專一性的重鏈可變區(qū)(vh)小分子抗體片段?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，亞洲的西亞駱駝、非洲的單峰駝、南美洲的大羊駝、原駝、羊駝和小羊駝等偶蹄目胼足亞目駱駝科動(dòng)物的抗體天然缺失輕鏈，從其重鏈可變區(qū)克隆得到的只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為單域重鏈抗體(vhh)，是最小的功能性抗原結(jié)合片段，又可稱作納米抗體(nanobody)。由于獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，與普通抗體相比，納米抗體體積小、親和力高、對(duì)熱和ph有較強(qiáng)的抵抗力；與常規(guī)單域抗體相比也具有更好的構(gòu)象穩(wěn)定性。

因此，利用taq酶和taq酶納米抗體形成抗原抗體復(fù)合物，能大大提高pcr擴(kuò)增效率和特異性，達(dá)到熱啟動(dòng)pcr的目的。

曾有碩士學(xué)位論文描述了從羊駝天然噬菌體文庫(kù)中采用生物親和淘選的方法獲取taq酶納米抗體，再結(jié)合分子克隆技術(shù)，表達(dá)和純化taq酶納米抗體的方法(唐笑.耐熱dna聚合酶的定點(diǎn)誘變及應(yīng)用于熱啟動(dòng)pcr的納米抗體的淘選.南昌,南昌大學(xué),2015)。該方法篩選得到了自制taq酶的5個(gè)納米抗體，外源表達(dá)僅得到了3個(gè)可溶性的納米抗體。將這3個(gè)可溶性納米抗體進(jìn)一步純化后，ellisa鑒定發(fā)現(xiàn)僅1個(gè)納米抗體與自制taq酶有高親和力，但并未結(jié)合在taq酶活性中心，發(fā)揮不了阻止酶活性的作用，不能應(yīng)用于熱啟動(dòng)pcr?？傊ㄟ^(guò)生物親和淘選獲得taq酶納米抗體的方法存在特異性差、親和力不高等問(wèn)題，成功率低，實(shí)用性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)時(shí)熱啟動(dòng)taq酶及其制備方法，以解決pcr反應(yīng)中易出現(xiàn)克隆錯(cuò)配、非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種熱啟動(dòng)taq酶及其制備方法。

一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種熱啟動(dòng)taq酶，所述的熱啟動(dòng)taq酶是taq酶和taq酶納米抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成的抗原抗體復(fù)合物。

所述的taq酶納米抗體的來(lái)源包括但不限于通過(guò)taq酶免疫可產(chǎn)生納米抗體的動(dòng)物得到。

另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：

(1)獲得taq酶；

(2)制備taq酶納米抗體：將步驟(1)得到的taq酶作為抗原，加入佐劑，注射免疫可產(chǎn)生納米抗體的動(dòng)物，待抗體產(chǎn)量穩(wěn)定時(shí)停止免疫，采血分離得到抗血清，測(cè)定抗血清的特異性和效價(jià)后，分離純化抗血清，得到抗taq酶的納米抗體；

(3)制備熱啟動(dòng)taq酶：步驟(1)得到的taq酶與步驟(3)得到的taq酶納米抗體，按比例在30～40℃孵育1～2h，使抗原抗體形成復(fù)合物，即得到熱啟動(dòng)taq酶。

進(jìn)一步地，步驟(1)中taq酶的獲得方法可以為商業(yè)途徑獲得、通過(guò)來(lái)源生物分離純化、基因重組技術(shù)制備等。

進(jìn)一步地，步驟(2)中可產(chǎn)生納米抗體的動(dòng)物包括但不限于駱馬、羊駝、小羊駝、亞洲的西亞駱駝、非洲的單峰駝、南美洲的大羊駝、原駝。

進(jìn)一步地，步驟(2)中所用佐劑包括但不限于費(fèi)氏佐劑。

進(jìn)一步地，步驟(2)中抗血清的分離純化方法可以為親和層析法、吸附劑法等。

進(jìn)一步地，步驟(3)中所述taq酶與taq酶納米抗體的比例為摩爾比為0.9～1.1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)通過(guò)形成taq酶抗原抗體復(fù)合物，在pcr反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)，使taq酶的特異性、可靠性和靈敏度得到提升，對(duì)比同類產(chǎn)品，能很大程度上減少克隆錯(cuò)配，適用于各類pcr反應(yīng)。

(2)本發(fā)明用于形成taq酶抗原抗體復(fù)合物的所使用的抗體不同于普通抗體，其為納米抗體，具有體積小、親和力高、對(duì)熱和ph有較強(qiáng)的抵抗力、構(gòu)象更穩(wěn)定的特點(diǎn)。且通過(guò)直接免疫可得到納米抗體的動(dòng)物的方法制備得到的taq酶納米抗體，特異性強(qiáng)，純度高，親和力高。憑借以上特點(diǎn)，taq酶和taq酶納米抗體所形成的抗原抗體復(fù)合物能大大提高基因擴(kuò)增的特異性、靈敏性和擴(kuò)增效率。綜上，本發(fā)明提供了一種通過(guò)形成taq酶和taq酶納米抗體復(fù)合物，制備熱啟動(dòng)taq酶的方法，可實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)pcr的目的。且由于使用的是納米抗體，其高親和力和高穩(wěn)定性，可大大提高熱啟動(dòng)pcr的特異性、靈敏性和擴(kuò)增效率。

(3)利用本發(fā)明所述的方法，通過(guò)免疫駱馬制備的熱啟動(dòng)taq酶，與免疫羊駝、小羊駝等其他可產(chǎn)生納米抗體的動(dòng)物制備的熱啟動(dòng)taq酶相比，抗凍融能力相對(duì)最強(qiáng)，耐低溫保存能力也相對(duì)最強(qiáng)，實(shí)用性更高。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶用于pcr反應(yīng)的擴(kuò)增結(jié)果和陰性對(duì)照組擴(kuò)增結(jié)果。1表示本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶的擴(kuò)增曲線；2表示陰性對(duì)照組擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的熱啟動(dòng)taq酶與商業(yè)rtaq酶、商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶實(shí)驗(yàn)效果比對(duì)圖。1表示本發(fā)明實(shí)施例2制備的熱啟動(dòng)taq酶的擴(kuò)增曲線；2表示商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶的擴(kuò)增曲線；3表示商業(yè)rtaq酶的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的下述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范圍。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

實(shí)施例1一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法

一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法，其步驟如下：

(1)獲得taq酶：本實(shí)施例所用的taq酶為genbank編號(hào)為gi|155128的taq酶，其獲得方法為：

1)設(shè)計(jì)引物：根據(jù)其dna序列設(shè)計(jì)如下pcr擴(kuò)增引物

上游引物，其序列如seqidno：1所示：5’-ggcgatgctgcccctc-3’，

下游引物，其序列如seqidno：2所示：5’-gtcgacatcactccttggcg-3’；

2)pcr擴(kuò)增：以水生棲熱菌(thermusaquaticus)為模板，利用步驟1)所述上游引物和下游引物，通過(guò)常規(guī)pcr擴(kuò)增獲得taq酶的編碼基因；

所用的pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘；

3)將獲得的taq酶的編碼基因克隆連接至表達(dá)載體pet-32a-bmea-a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)，擴(kuò)大培養(yǎng)后，0.2mm異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)，25度表達(dá)；

4)6h后收集大腸桿菌菌體，使用超聲破碎儀裂解菌體，離心后上清采用鎳柱純化，得到taq酶；

(2)制備taq酶納米抗體：將步驟(1)所得的taq酶作為抗原，加入費(fèi)氏佐劑，注射免疫駱馬，待抗體產(chǎn)量穩(wěn)定時(shí)停止免疫，采血分離得到抗血清；包被抗原，使用westernblot和elisa試驗(yàn)鑒定抗體的特異性及其效價(jià)后，親和層析方法純化采血分離得到的抗血清，得到抗taq酶的納米抗體；分光光度計(jì)測(cè)定taq酶納米抗體濃度，分裝于-70℃凍存?zhèn)溆茫?/p>

(3)制備熱啟動(dòng)taq酶：將步驟(1)得到的taq酶與步驟(3)得到的taq酶納米抗體，按摩爾比1:1的比例混合后，在30℃孵育1h，使抗原抗體形成復(fù)合物，即得到熱啟動(dòng)taq酶。

實(shí)施例2一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法

一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法，其步驟如下：

(1)獲得taq酶：同實(shí)施例1；

(2)制備taq酶納米抗體：同實(shí)施例1；

(3)熱啟動(dòng)taq酶的制備：步驟(1)得到的taq酶與步驟(3)得到的taq酶納米抗體，按摩爾比0.9:1的比例混合后，在40℃孵育2h，使抗原抗體形成復(fù)合物，即得熱啟動(dòng)taq酶。

實(shí)施例3一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法

一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法，其步驟如下：

(1)獲得taq酶：購(gòu)自深圳菲鵬生物股份有限公司(貨號(hào)md001)；

(2)制備taq酶納米抗體：同實(shí)施例1；

(3)熱啟動(dòng)taq酶的制備：步驟(1)得到的taq酶與步驟(3)得到的taq酶納米抗體，按摩爾比1:1.1的比例混合后，在35℃孵育1.5h，使抗原抗體形成復(fù)合物，即得熱啟動(dòng)taq酶。

實(shí)施例4熱啟動(dòng)taq酶應(yīng)用于pcr反應(yīng)

以大豆gdna為模板，以本發(fā)明實(shí)施例1所制備的熱啟動(dòng)taq酶為pcr擴(kuò)增聚合酶，以以下引物f和引物r為pcr擴(kuò)增引物，進(jìn)行pcr反應(yīng)。陰性對(duì)照組采用生理鹽水替代大豆gdna作為模板。

pcr擴(kuò)增引物為：

引物f，其序列如seqidno：3所示：5’-ctggagaacttggagtgctgaatg-3’；

引物r：其序列如seqidno：4所示：5’-aacaggaactgtcctagcagaca-3’。

pcr反應(yīng)體系為：

其中，sybrgreenreal-timepcrmastermix使用時(shí)，預(yù)先經(jīng)過(guò)1小時(shí)的高壓滅菌(121℃)，徹底滅活其中包含的taqdna聚合酶。

待所有組分加入后，將反應(yīng)體系用移液槍混合均勻，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1分鐘；95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃延伸45秒。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1的結(jié)果可知，采用本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶，擴(kuò)增曲線好，說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶擴(kuò)增效率高；同時(shí)，陰性對(duì)照組沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶特異性強(qiáng)。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)1

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶與rtaq酶應(yīng)用于pcr反應(yīng)的比較

使用本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，以本發(fā)明實(shí)施例1的步驟(1)制備得到的taq酶為對(duì)照組，兩組均以生理鹽水為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。

pcr擴(kuò)增所用的引物同實(shí)施例4，為引物f和引物r。

pcr反應(yīng)體系為：

其中，sybrgreenreal-timepcrmastermix使用時(shí)，預(yù)先經(jīng)過(guò)1小時(shí)的高壓滅菌(121℃)，徹底滅活其中包含的taqdna聚合酶。其中實(shí)驗(yàn)組的熱啟動(dòng)taq酶和對(duì)照組的taq酶濃度相同。

待所有組分加入后將反應(yīng)體系用移液槍混合均勻，并進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，pcr反應(yīng)程序同實(shí)施例4。

分析擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的熱啟動(dòng)taq酶，其pcr反應(yīng)的效果更好，擴(kuò)增特異性更好，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增；而普通的taq酶，即本發(fā)明實(shí)施例1步驟(1)獲得的taq酶，其pcr結(jié)果中有明顯的擴(kuò)增，特異性不強(qiáng)。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)2

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶與rtaq酶應(yīng)用于pcr反應(yīng)的比較

使用本發(fā)明實(shí)施例3制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，以本發(fā)明實(shí)施例3的步驟(1)得到的taq酶，即購(gòu)自深圳菲鵬生物股份有限公司(貨號(hào)md001)的rtaq酶為對(duì)照組，兩組均以生理鹽水為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。

pcr擴(kuò)增所用的引物同實(shí)施例4，為引物f和引物r。

pcr反應(yīng)體系為：

其中，sybrgreenreal-timepcrmastermix使用時(shí)，預(yù)先經(jīng)過(guò)1小時(shí)的高壓滅菌(121℃)，徹底滅活其中包含的taqdna聚合酶。其中實(shí)驗(yàn)組的熱啟動(dòng)taq酶和對(duì)照組的taq酶濃度相同。

待所有組分加入后將反應(yīng)體系用移液槍混合均勻，并進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，pcr反應(yīng)程序同實(shí)施例4。

分析擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明實(shí)施例3制備得到的熱啟動(dòng)taq酶，其pcr反應(yīng)的效果更好，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增；而商業(yè)rtaq酶，其pcr結(jié)果中有明顯的擴(kuò)增，特異性不強(qiáng)。即利用本發(fā)明所述的方法將商業(yè)rtaq酶制備成熱啟動(dòng)taq酶后，擴(kuò)增效果高，擴(kuò)增特異性好。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)3

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶與商業(yè)rtaq酶、商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶應(yīng)用于pcr反應(yīng)

使用本發(fā)明實(shí)施例2制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，以商業(yè)rtaq酶和商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶為對(duì)照組，進(jìn)行pcr反應(yīng)。

商業(yè)rtaq酶以購(gòu)自深圳菲鵬生物股份有限公司(貨號(hào)md001)的為例，商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶以購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號(hào)p401)的為例。

pcr擴(kuò)增所用的引物同實(shí)施例4，為引物f和引物r。

pcr反應(yīng)體系為：

其中，sybrgreenreal-timepcrmastermix使用時(shí)，預(yù)先經(jīng)過(guò)1小時(shí)的高壓滅菌(121℃)，徹底滅活其中包含的taqdna聚合酶。其中本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶、商業(yè)rtaq酶及商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶的濃度相同。

待所有組分加入后將反應(yīng)體系用移液槍混合均勻，并進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，pcr反應(yīng)程序同實(shí)施例4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2的結(jié)果可知，采用本發(fā)明實(shí)施例2制備的熱啟動(dòng)dna聚合酶，從擴(kuò)增圖上看沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，其pcr反應(yīng)的效果更好，擴(kuò)增特異性更好；而對(duì)照商業(yè)rtaq酶和商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶，從擴(kuò)增圖上看有明顯的非特異性擴(kuò)增，pcr特異性不強(qiáng)。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)4

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶與商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶應(yīng)用于pcr反應(yīng)

以本發(fā)明實(shí)施例1所制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，以商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶為對(duì)照組，均以大豆gdna為模板。

商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶以購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號(hào)p401)的為例。

pcr擴(kuò)增所用的引物同實(shí)施例4，為引物f和引物r。

pcr反應(yīng)體系為：

其中本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶與商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶的濃度相同。

擴(kuò)增程序同實(shí)施例4。擴(kuò)增結(jié)束后，采用天根生化科技有限公司的普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行純化，然后利用thermofisher公司的nanodrop2000測(cè)純化后的pcr產(chǎn)物濃度，其中，實(shí)驗(yàn)組pcr產(chǎn)物濃度為180ng/μl而對(duì)照組pcr產(chǎn)物濃度為80ng/μl。由該結(jié)果可得出，與商業(yè)熱啟動(dòng)taq酶相比，擴(kuò)增體系與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)完全相同情況下，本發(fā)明實(shí)施例1所制備的熱啟動(dòng)taq酶擴(kuò)增效率更高。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)5

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶冷凍保存穩(wěn)定性對(duì)比

(1)制備對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶：方法基本同實(shí)施例1，僅將被免疫的動(dòng)物改為羊駝、小羊駝、亞洲的西亞駱駝、非洲的單峰駝、南美洲的大羊駝、原駝，得到的熱啟動(dòng)taq酶作為對(duì)照組；

(2)以本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶濃度相同；

(3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶放入-20℃冰箱，保存一年；

(4)一年后取出，檢測(cè)游離的taq酶抗體的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組熱啟動(dòng)taq酶凍存一年后，僅7％的taq酶納米抗體與抗原分離；而對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶凍存一年后，25％～37％的taq酶抗體與抗原分離。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)6

本發(fā)明的熱啟動(dòng)taq酶抗反復(fù)凍融能力對(duì)比

(1)制備對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶：方法基本同實(shí)施例1，僅將被免疫的動(dòng)物改為羊駝、小羊駝、亞洲的西亞駱駝、非洲的單峰駝、南美洲的大羊駝、原駝，得到的熱啟動(dòng)taq酶作為對(duì)照組；

(2)以本發(fā)明實(shí)施例1制備的熱啟動(dòng)taq酶作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶濃度相同；

(3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶在相同情況下分別凍融20次；

(4)凍融后檢測(cè)游離的taq酶抗體的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組熱啟動(dòng)taq酶凍融20次后，僅10％的taq酶納米抗體與抗原分離；而對(duì)照組熱啟動(dòng)taq酶酶凍融20次后，32％～45％的taq酶抗體與抗原分離。

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<110>廣州海力特生物科技有限公司

<120>一種熱啟動(dòng)taq酶的制備方法

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