本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及地鱉酶解提取物在制備預(yù)防和/或治療四氯化碳肝損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝臟是機體最重要的臟器之一，承擔(dān)著物質(zhì)代謝和生物轉(zhuǎn)化的功能，易受到體內(nèi)外各種致病因素和刺激因子的侵襲，引起肝臟的損傷與炎癥反應(yīng)。肝損傷是各種有害因素如病毒、細(xì)菌、藥物、酒精、缺血、肝臟部分切除等，直接或間接損傷肝臟，造成肝細(xì)胞的炎癥、壞死、甚至凋亡和纖維化等一系列病變，是各種肝病共同的病理基礎(chǔ)。因此，研究具有護肝保肝功能的保健食品或藥物，對保護人體健康是非常必要的。
四氯化碳有輕度麻醉作用，對肝、腎有嚴(yán)重?fù)p害作用，其可在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂苫?，擾亂肝細(xì)胞膜上類脂質(zhì)的代謝，引起肝細(xì)胞壞死，是常用的致肝損傷化合物，利用其構(gòu)建的肝損傷動物模型是目前研究化學(xué)性肝損傷和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷的首選實驗動物模型之一，也是開發(fā)保肝護肝類藥物的常用模型之一。
地鱉是我國傳統(tǒng)活血化瘀類中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究及臨床試驗證明，地鱉具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗衰老、抗突變、耐缺氧等功效，其含生物堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、酚類、糖類、甾體、油質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，有著極高的藥用及保健價值。目前有關(guān)地鱉生物學(xué)功能的化學(xué)(組分)基礎(chǔ)和生物學(xué)機理尚未完全闡明。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供地鱉酶解提取物的一種藥物新用途。
本發(fā)明所提供的地鱉酶解提取物的新用途是其在制備預(yù)防和/或治療四氯化碳肝損傷藥物中的應(yīng)用。
所述地鱉酶解提取物是通過包括下述步驟的方法制備得到的：
將地鱉粉溶于水中，加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)體系的pH值至6.0-7.0，酶解反應(yīng)，離心，收集上清液，即可。
上述方法中，地鱉粉與水的料水比為1g:15mL-1g:25mL，具體可為1g:15mL。
所述水具體可為蒸餾水。
地鱉粉與木瓜蛋白酶的配比為1g:500U-1g:700U，具體可為1g:500U。
所述酶解反應(yīng)的反應(yīng)溫度為55℃，時間為3-5h，具體可以4h。
所述離心的條件為：10000r/min下離心15min。
上述方法在對酶解體系進行離心之前還包括將所述酶解體系置于100℃沸水中10min以終止酶解反應(yīng)的操作。
包含上述地鱉酶解提取物的藥物制劑也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述藥物制劑可制成各種形式的口服制劑，包括：膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、滴丸劑、緩控釋制劑、口服液、合劑和糖漿劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明采用小鼠CCl4致肝損傷模型進行動物實驗，通過分光光度法檢測急性肝損傷小鼠血清中AST、ALT活力，與模型組比較，地鱉酶解提取物組血清中ALT、AST活力均極顯著降低，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中的CAT活力極顯著升高，中高劑量組SOD、GSH-Px活力顯著升高，而低高劑量組MDA的含量明顯降低，另外，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量及基因相對表達(dá)量均顯著降低。綜上說明，地鱉酶解提取物能顯著減低CCl4對小鼠肝細(xì)胞的損傷，增強急性肝損傷小鼠的抗氧化能力，可能成為一種非常優(yōu)秀的預(yù)防和/或治療四氯化碳肝損傷的候選藥物。
附圖說明
圖1示出了地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
1材料與方法
1.1試驗材料
四氯化碳(CCl4)購自北京化工廠，水飛薊素膠囊購自德國馬博士大藥廠，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、總蛋白定量試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司， Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR420A)購自日本TaKaRa公司，所用引物由華大科技公司合成，地鱉酶解提取物由本實驗室制備。
健康昆明小鼠，雄性，體重20-22g，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK-(軍)2012-0004】。
1.2方法
1.2.1地鱉酶解物的提取
取地鱉粉按料水比為1g:15mL的比例溶于蒸餾水，根據(jù)1g:500U的料酶比(W/U)加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為6.0，將上述溶液置于55℃水浴鍋內(nèi)水浴4h后再置于100℃沸水中10min以終止酶解反應(yīng)，然后10000r/min離心15min，吸取上清即得到地鱉酶解液。
1.2.2試驗分組
取60只健康小鼠隨機分為Ⅰ組(溶劑組)、Ⅱ組(模型組)、Ⅲ組(水飛薊素100mg/kg)、Ⅳ～Ⅵ組(地鱉酶解提取物50、100、200mg/kg)，每組10只。溶劑組和模型組每天灌服生理鹽水，陽性對照組灌服水飛薊素，地鱉酶解提取物組灌服不同劑量酶解物，每天一次，連續(xù)7d，末次給藥2h后，除溶劑組外(橄欖油)，模型組及各給藥組均腹腔注射0.1％CCl4橄欖油溶液10ml/kg，禁食不禁水，18h后眼眶采血，離心制備血清，分離肝組織，取小鼠肝左葉作HE染色進行組織學(xué)檢查，其余部分制成10％組織勻漿備用。
1.2.3肝功能指標(biāo)檢測
根據(jù)ALT、AST試劑盒說明，檢測血清中ALT、AST含量。
1.2.4抗氧化能力的測定
根據(jù)SOD、CAT、GSH-Px和MDA試劑盒說明，檢測肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量。
1.2.5肝中TNF-α、IL-6和iNOS含量及mRNA相對表達(dá)量測定
根據(jù)TNF-α、IL-6和iNOS試劑盒說明，檢測肝中TNF-α、IL-6含量及iNOS活性。Trizol法提取肝組織中總RNA，將RNA用Oligo(dT)18Primer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進行PCR擴增。最后采用與熒光定量PCR儀配套Step OneSoftware v2.1分析PCR數(shù)據(jù)。
1.2.6肝組織切片觀察
將小鼠肝組織用4℃生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，浸泡于體積分?jǐn)?shù)4％多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。
1.3統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism6.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時進行LSD各組間多重比較，P<0.05為差異顯著。2結(jié)果
2.1地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝功能的影響
轉(zhuǎn)氨酶是反映肝功能的一項重要指標(biāo)，通過分光光度法檢測急性肝損傷小鼠血清中AST、ALT活力，結(jié)果如表1所示，與溶劑組比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST含量顯著升高(P<0.01)，說明CCl4致小鼠肝損傷造模成功。與模型組比較，陽性對照組和地鱉酶解提取物組血清中ALT、AST活力均極顯著降低(P<0.01)。
表1地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝功能的影響
注：與溶劑組相比，**P<0.01；與模型組相比，++P<0.01。
2.2地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠抗氧化能力的影響
由表2可知，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中的SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，而MDA含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中的CAT活力極顯著升高(P<0.01)，中高劑量組SOD、GSH-Px活力顯著升高(P<0.01或P<0.05)，而低高劑量組MDA的含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。
表2地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響
注：與溶劑組相比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比，++P<0.01，+P<0.05。
2.3地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS含量及mRNA相對表達(dá)量的影響
由表3可知，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組對比，陽性對照組和地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量均極顯著降低(P<0.01)。
通過熒光定量PCR檢測小鼠肝組織TNF-α、IL-6及iNOS mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果如表4所示，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。與模型組對比，陽性對照組和地鱉酶解提取物組肝組織中TNF-α、IL-6mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，iNOS mRNA相對表達(dá)量有一定程度的降低，但差異不顯著(P>0.05)。
表3地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS含量的影響
注：與溶劑組相比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比，++P<0.01。
表4地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS mRNA相對表達(dá)量的影響
注：與溶劑組相比，**P<0.01；與模型組相比，++P<0.01。
2.4地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響
圖1示出了地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響。
如圖1所示，溶劑組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索結(jié)構(gòu)清晰可辨，未見肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯變性、壞死等病理變化。模型組小鼠肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞體積增大，呈現(xiàn)氣球樣病變。與模型組比較，陽性對照組和地鱉酶解提取物組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，CCl4誘導(dǎo)肝損傷過程中產(chǎn)生的肝細(xì)胞水腫、壞死等現(xiàn)象均有不同程度地減弱，正常肝細(xì)胞數(shù)目增多。