背景技術：

本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測的生物技術領域，特別是針對高ige綜合征stat3基因突變的檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術

高ige綜合征(hies)是一種罕見而復雜的原發(fā)性免疫缺陷病，臨床以頑固濕疹樣皮疹、反復細菌感染引起的皮膚及肺部膿腫，并伴有血清ige水平顯著升高為特征?？煞譃?型，ⅰ型為常染色體顯性遺傳(ad-hies)，為stat3基因突變所致；ⅱ型為常染色體隱性遺傳(ar-hies)，為tyk-2或dock8基因突變所致。stat3是一種信號轉錄因子，可被多種細胞因子和生長因子激活，包括il-6、il-10、il-22、il-23及巨噬細胞集落刺激因子。ad-hies中stat3突變干擾以上細胞因子激活的信號轉導途徑，從而導致免疫反應的改變。研究發(fā)現(xiàn)stat3突變的ad-hies患者th17分化發(fā)育障礙，不能分泌il-17來抵御胞外菌和真菌。急性炎癥因子il-6信號通路受損或許可以解釋hies“冷膿腫”，有學者指出hies是炎癥反應過強和過弱的矛盾體，肺大泡是炎癥過剩的表現(xiàn)，而冷膿腫是炎癥反應不足的表現(xiàn)。目前尚無根治hies的手段，治療的重點是積極預防感染和加強皮膚護理。hies發(fā)病率＜10^-6，發(fā)病無性別和種族差異，多為散發(fā)，表現(xiàn)為ad-hies，而ar-hies少見。

stat3基因位于染色體17q21，含24個外顯子，編碼770個氨基酸的stat3蛋白，包括n端保守序列、卷曲螺旋區(qū)、dna結合域(dbd)、連接區(qū)、sh2區(qū)和轉錄活性區(qū)域，是th17細胞發(fā)育必須的轉錄因子和多種細胞因子信號途徑的中心因子。熱點突變位于stat3蛋白的dbd和sh2結構域，dbd是stat3與靶基因dna結合部位，dbd區(qū)的突變使stat3的dna結合活性降低75％，sh2區(qū)與受體招募和stat磷酸化二聚體的形成有關。最常見的錯義突變是r328w/q和v637m，也有剪接位點突變，缺失突變，沒有無義突變。

研究表明，病人體內stat3等位基因中的一條發(fā)生了突變，從而引起突變stat3蛋白對野生stat3蛋白的顯性負效應，導致病人細胞內jak-stat3信號通路的受阻，最終引起病人體內抵抗外界細菌和病毒入侵的th17細胞分化受阻以及分泌免疫球蛋白e(ige)的b淋巴細胞分泌失調。提示stat3基因的突變情況的檢測對高ige綜合征的診斷和預后觀察有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測stat3基因多態(tài)突變熱點的引物，采用pcr技術，可用于快速檢測高ige綜合征患者體內stat3基因多態(tài)位點的突變情況。所述檢測stat3基因多態(tài)熱點突變情況的引物，包括：

擴增stat3基因的引物，其堿基序列為：

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進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：

檢測stat3基因的測序引物堿基序列為：

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進一步地，引物序列st-e1-f和st-e1-r是擴增stat3基因第1外顯子序列的引物，引物序列st-e2-f和st-e2-r是擴增stat3基因第2外顯子序列的引物，引物序列st-e3-f和st-e3-r是擴增stat3基因第3外顯子序列的引物，引物序列st-e4-f和st-e4-r是擴增stat3基因第4外顯子序列的引物，引物序列st-e5/6-f和st-e5/6-r是擴增stat3基因第5、6外顯子序列的引物，引物序列st-e7/8-f和st-e7/8-r是擴增stat3基因第7、8外顯子序列的引物，引物序列st-e9/10-f和st-e9/10-r是擴增stat3基因第9、10外顯子序列的引物，引物序列st-e11-f和st-e11-r是擴增stat3基因第11外顯子序列的引物，引物序列st-e12/13/14-f和st-e12/13/14-r是擴增stat3基因第12、13、14外顯子序列的引物，引物序列st-e15/16-f和st-e15/16-r是擴增stat3基因第15、16外顯子序列的引物，引物序列st-e17/18-f和st-e17/18-r是擴增stat3基因第17、18外顯子序列的引物，引物序列st-e19/20-f和st-e19/20-r是擴增stat3基因第19、20外顯子序列的引物，引物序列st-e21-f和st-e21-r是擴增stat3基因第21外顯子序列的引物，引物序列st-e22/23-f和st-e22/23-r是擴增stat3基因第22、23外顯子序列的引物，引物序列st-e24-1-f和st-e24-1-r、st-e24-2-f和st-e24-2-r、st-e24-3-f和st-e24-3-r、st-e24-4-f和st-e24-4-r是擴增stat3基因第24外顯子序列的引物。

本發(fā)明還提供了檢測stat3基因全外顯子突變情況的方法，包括以下步驟：

1.抽提血液/中的dna；

2.用pcr擴增步驟1中提取的dna；

3.對步驟2中的擴增產物進行測序；

4.對測序結果進行判斷，確定stat3基因是否發(fā)生突變；

其中pcr擴增引物為：

擴增stat3基因的引物，其堿基序列為：

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進一步地，測序引物堿基序列為：

檢測stat3基因的測序引物堿基序列為：

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本發(fā)明還提供了一種檢測stat3基因多態(tài)突變位點的試劑盒，包括：

(i)血液dna抽提試劑；

(ii)檢測體系pcr擴增反應液；

(iii)測序體系試劑；

其中pcr擴增反應液引物為：

(ⅰ)擴增stat3基因的引物，其堿基序列為：

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進一步地，測序引物堿基序列為：

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有益效果：本發(fā)明設計了擴增stat3全部24個外顯子序列的引物。通過加接頭，使所有18對引物的pcr產物均可以用一種測序引物進行測序。采用pcr技術，構建了穩(wěn)定的擴增體系。通過調整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。stat3基因的突變類型種類繁多且遍布整個基因，因此本發(fā)明所述引物既能將所述stat3全外顯子序列都擴增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會出現(xiàn)漏檢的情況。相比較熒光定量pcr法降低了檢測的成本和難度。熒光定量pcr法要針對不同的突變類型設計多個探針，成本高，檢測難度大。

附圖說明

圖1為stat3基因在染色體上定位圖

圖2-4為18對引物擴增24個外顯子pcr產物電泳圖，m為markerdl2000，1-3為送檢的血液樣本1-3號，如圖2-4所示，引物擴增有效，且條帶單一。

圖5-19分別為樣本1的stat3第1-24號外顯子野生型測序截圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

一種檢測stat3基因多態(tài)突變位點的引物，該引物的設計是針對stat3全外顯子設計的擴增引物，包括：

擴增stat3基因全外顯子序列的引物，其堿基序列為：

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一種檢測stat3基因多態(tài)突變位點的試劑盒，包括

(i)血液dna抽提試劑；

(ii)檢測體系pcr反應液；

(iii)測序體系試劑；

其中，組織dna抽提試劑可購自天根dna抽提試劑盒等商品化試劑。

檢測體系pcr擴增反應液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；stat3基因6個外顯子序列的上、下游引物st-e1-f/r、st-e2-f/r、st-e3-f/r、st-e4-f/r、st-e5/6-f/r、st-e7/8-f/r、st-e9/10-f/r、st-e11-f/r、st-e12/13/14-f/r、st-e15/16-f/r、st-e17/18-f/r、st-e19/20-f/r、st-e21-f/r、st-e22/23-f/r、st-e24-f/r引物濃度均為10μm。

測序體系試劑包括：測序純化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、無水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去離子甲酰胺)、測序引物：檢測stat3基因全外顯子序列的上、下游引物分別為m13-f(3.2μm)、m13-r(3.2μm),以及bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)。

實施例2

血液/細胞/組織基因組dna抽提試劑盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的組織dna：1)抽取300μl血液加入900μl紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12,000rpm離心1min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200μl緩沖液ga，振蕩至徹底混勻。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻。3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液。9)將吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。10)將吸附柱cb3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5分鐘，12，000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

(2)試劑配置：按檢測人份數(shù)配置檢測體系pcr反應液各xμl，每人份19μl分裝：

x＝19μl反應液×(n份標本+1份空白對照)

n為檢測標本數(shù)。

(3)加樣：加入檢測體系pcr反應液中1μldna；空白對照加1μl生理鹽水或不加任何物質。

(4)擴增：檢測在常規(guī)pcr儀上進行，可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。反應條件如下：

pcr擴增體系試劑配制方法如下：

其中，引物序列為：

(5)電泳：1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110v，25min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

如圖2-4所示，即為3例血液樣本以st-e1-f/r、st-e2-f/r、st-e3-f/r、st-e4-f/r、st-e5/6-f/r、st-e7/8-f/r、st-e9/10-f/r、st-e11-f/r、st-e12/13/14-f/r、st-e15/16-f/r、st-e17/18-f/r、st-e19/20-f/r、st-e21-f/r、st-e22/23-f/r、st-e24-1-f/r、st-e24-2-f/r、st-e24-3-f/r、st-e24-4-f/r引物擴增后所得產物的電泳圖譜。本發(fā)明擴增的片段長度分別為498bp、773bp、241bp、516bp、985bp、617bp、923bp、405bp、572bp、386bp、811bp、954bp、424bp、922bp、742bp、785bp、931bp、541bp，通過電泳圖的分析表明本發(fā)明所述st-e1-f/r、st-e2-f/r、st-e3-f/r、st-e4-f/r、st-e5/6-f/r、st-e7/8-f/r、st-e9/10-f/r、st-e11-f/r、st-e12/13/14-f/r、st-e15/16-f/r、st-e17/18-f/r、st-e19/20-f/r、st-e21-f/r、st-e22/23-f/r、st-e24-1-f/r、st-e24-2-f/r、st-e24-3-f/r、st-e24-4-f/r擴增有效，且條帶單一。

(6)sanger測序：

取9μlpcr產物與2μl純化體系。按照以下程序進行純化：

將1μl純化產物分別與上、下測序引物按照如下體系進行混合：

測序反應程序：

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測序反應的產物中加入2μl125mmol的edta，靜置5min；加入15μl無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50μl70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhi-di后進行變性試驗。變性程序：

變性程序結束后，上測序儀(abi3730)測序。

(7)結果判斷：分別將測序結果與stat3野生型參考序列(genbank：nc_000017.11)進行比對，根據(jù)實際突變情況對結果進行報告。

實施例3

取3例的臨床樣本(樣本編號為1-3)按實施例1和2的試劑和方法提取基因組、配制試劑、擴增和測序。每份樣本加入檢測體系pcr反應液中1μl。電泳結果如圖2-4所示，表明本發(fā)明所述引物st-e1-f/r、st-e2-f/r、st-e3-f/r、st-e4-f/r、st-e5/6-f/r、st-e7/8-f/r、st-e9/10-f/r、st-e11-f/r、st-e12/13/14-f/r、st-e15/16-f/r、st-e17/18-f/r、st-e19/20-f/r、st-e21-f/r、st-e22/23-f/r、st-e24-1-f/r、st-e24-2-f/r、st-e24-3-f/r、st-e24-4-f/r對血液樣本能有效擴增，且條帶單一。

樣本1的部分檢測結果如圖5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19所示：

圖5顯示是樣本1的stat31號外顯子野生型測序截圖，

圖6顯示是樣本1的stat32號外顯子野生型測序截圖，

圖7顯示是樣本1的stat33號外顯子野生型測序截圖，

圖8顯示是樣本1的stat34號外顯子野生型測序截圖，

圖9顯示是樣本1的stat35、6號外顯子野生型測序截圖，

圖10顯示是樣本1的stat37、8號外顯子野生型測序截圖，

圖11顯示是樣本1的stat39、10號外顯子野生型測序截圖，

圖12顯示是樣本1的stat311號外顯子野生型測序截圖，

圖13顯示是樣本1的stat312、13、14號外顯子野生型測序截圖，

圖14顯示是樣本1的stat315、16號外顯子野生型測序截圖，

圖15顯示是樣本1的stat317、18號外顯子野生型測序截圖，

圖16顯示是樣本1的stat319、20號外顯子野生型測序截圖，

圖17顯示是樣本1的stat321號外顯子野生型測序截圖，

圖18顯示是樣本1的stat322、23號外顯子野生型測序截圖，

圖19顯示是樣本1的stat324號外顯子野生型測序截圖。

從檢測結果可以看出，本發(fā)明所述引物已經把外顯子序列包括在內了，能夠擴展出stat3基因全部24個外顯子，并且測序結果完全準確。本發(fā)明所述引物可以準確的擴展出stat3基因全外顯子，無論是野生型還是突變型。

sequencelisting

<110>濟南艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司

<120>檢測高ige綜合征stat3基因突變的試劑盒和方法

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<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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aacagctatgaccatgtgcccaagtaaatgaggtcca37

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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