本發(fā)明涉及毛絨制品分子鑒定
技術領域：
，具體涉及一種毛絨制品的快速分子鑒定方法。
背景技術：
：我國是毛絨制品生產(chǎn)、加工、出口大國，毛絨類纖維的總加工量居世界第一。羊絨作為重要的毛絨類產(chǎn)品之一，其細度均勻，手感滑糯柔軟而細膩，拉力強而富有彈性，使其質(zhì)感、手感、保暖性等明顯優(yōu)于其他毛絨制品，素有“軟黃金”之稱。一些不法生產(chǎn)廠商為達到降低成本提高利潤的目的，在加工羊絨制品過程中往往摻入價值相對較低的其他纖維，如綿羊絨、改性綿羊毛、拉細綿羊毛和羊駝絨等，這些摻假行為不僅損害了消費者的利益，更影響了我國毛絨產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。毛絨類纖維現(xiàn)有的鑒別方法，主要是根據(jù)gb/t16988-2013《特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定》的規(guī)定，使用投影顯微鏡對山羊絨、兔毛、羊駝毛等絨毛類型的各組分纖維含量的測定。該鑒別方法過分依賴于檢測人員的工作經(jīng)驗，而對羊絨、改性綿羊毛和羊駝絨等形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似的纖維，這種方法逐漸顯現(xiàn)出其局限性，已不能滿足毛絨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。近年來發(fā)展起來的圖像識別法、紅外光譜法、實時定量pcr法、基因探針法、靶向蛋白質(zhì)組技術和生物芯片法等雖各有千秋，卻均因各種原因難以推廣。隨著各種毛絨混紡織物的大量出口，毛絨類纖維的成份鑒定工作已成為維護商家與消費者權益，增加我國國際市場競爭力以及打擊假冒劣偽的重要一環(huán)，也一直是紡織檢測行業(yè)具有挑戰(zhàn)性的課題之一，已成為業(yè)界亟待解決的問題。本發(fā)明旨在利用基因擴增技術，對毛絨制品實現(xiàn)快速準確地定性鑒定。生物體所有的遺傳信息都貯存在dna分子中，每種動物都有其特定的dna堿基序列，利用這種特定標記的差別，設計特定的引物，通過聚合鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)擴增得到特異性片段，從而確定各自的種屬。由于動物毛纖維的基因組dna主要存在于毛囊部位，毛絨織物一般沒有毛囊，因而只能提取纖維中的線粒體dna，通過比較線粒體dna的特征堿基序列差異來定性鑒別羊絨、羊毛與羊駝纖維。線粒體是獨立于細胞核，存在于大多數(shù)真核細胞里的一種非常重要的、基本的細胞器。線粒體dna(mitochondrialdna，mtdna)被發(fā)現(xiàn)后，核外遺傳物質(zhì)的研究逐漸成為分子遺傳學和進化遺傳學的重要研究領域，受到越來越多的重視。mtdna為共價閉合環(huán)狀雙鏈螺旋分子。其進化速率是核dna的5-10倍，具有進化速度快、極少發(fā)生重組、多拷貝及嚴格母系遺傳等特征，在近緣種間及種內(nèi)具有豐富的多態(tài)性。因此，mtdna是研究近緣物種分類及動物起源與進化最重要的分子遺傳標記之一，被廣泛的用于動物系統(tǒng)發(fā)育分析中，并為動物的起源與進化研究提供了大量的分子生物學依據(jù)。cytb是編碼線粒體內(nèi)膜細胞色素b氧化酶基因的一個亞基，參與氧化磷酸化合成atp過程。cytb基因核苷酸序列總長為1140bp，編碼379個氨基酸，不同物種cytb基因的序列長度沒有明顯的差異。cytb基因進化速度適中，易用一些通用引物對所檢測的物種進行擴增測序，較小的一段基因片段包括了科間、屬間、種間乃至種內(nèi)的遺傳信息，適合于分析種間或者屬間的差異被認為是解決系統(tǒng)分類和進化問題最可信的遺傳標記之一，已被廣泛的應用到動物的分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和起源與進化的研究中。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種毛絨制品的快速分子鑒定方法，采用特定的羊絨、羊毛、羊駝絨的特異性引物進行pcr(聚合酶鏈式反應)擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，可以準確定性對毛絨制品中的羊絨、羊毛、羊駝絨成分進行鑒定。一種毛絨制品的快速分子鑒定方法，包括以下步驟：(1)從毛絨制品中提取線粒體dna(mtdna)；(2)采用羊絨特異性引物、羊毛特異性引物以及羊駝絨特異性引物進行pcr特異性擴增；所述的羊絨特異性引物為：上游引物為catcactaatcttctttcagcaatc，下游引物為tgtggaggaagggtacaagtact；所述的羊毛特異性引物：上游引物為cattgatctcccagctccatcaaatatt，下游引物為attgtcgcaaataggaggattactccg；所述的羊駝絨特異性引物：上游引物為attatgcaaatcatgacaggactatttc，下游引物為atatttcaagtttctaggaaggcgtagg；(3)將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)相應的條帶，則鑒定含有羊絨、羊毛、羊駝絨成分，不出現(xiàn)相應的條帶，則不含相應的成分。如果樣品中僅存在羊絨、羊毛或羊駝絨，那么用相應的引物可以擴增出目的條帶，但用其他引物則無擴增結(jié)果。步驟1)中，本發(fā)明研究和開發(fā)動物纖維的dna檢測，關鍵技術難點在于dna的提取。特別是經(jīng)過染色、整理等加工處理的毛絨制品，更難獲得高質(zhì)量的可用于進一步分析的dna片段，而pcr技術只需微量的dna樣品，很好地解決了上述問題，因此，基于線粒體dna片段的pcr技術是一種理想的選擇。從毛絨制品中提取線粒體dna具體包括：將毛絨制品用液氮研磨，然后采用biomiga試劑盒，按照biomiga試劑盒的步驟，得到線粒體dna。毛絨制品在冷凍干燥器用液氮研磨(6870spexsampleprepusa)加工成細小的顆粒。所述的液氮研磨的條件為：采用冷凍干燥器，先預冷3min～7min，然后以每秒5～15次的速率運行，0.5～3min內(nèi)運行1～3個循環(huán)，再冷卻0.5～3min。研磨時注意以下條件：先預冷5min，然后以每秒10次的速率運行，1min內(nèi)運行2個循環(huán)，再冷卻1min。選用biomiga試劑盒，按說明書步驟進行，將粉碎的毛絨制品進行蛋白酶，dtt預處理—高效裂解—柱分離—獲取線粒體dna等步驟，分別提取羊絨、羊毛，羊駝的線粒體dna，并以此為模板進行pcr特異性擴增。步驟2)中，羊絨，羊毛與羊駝絨cytb基因的序列相似度高達72.5％，本發(fā)明的重點在于找到三者cytb基因各自的特征序列，得到了三種特異性引物，分別擴增長度不同的cytb基因片段，通過擴增cytb片段長度的差異，達到定性鑒別的目的。所述的pcr特異性擴增的反應條件為：90℃～95℃預變性3～10min，90℃～99℃變性15s～1min，30℃～45℃復性30s～1min，65℃～80℃延伸30s～1min，經(jīng)過20～40個循環(huán)后，最后65℃～80℃延伸5～15min。進一步優(yōu)選，pcr反應條件為:95℃預變性5min，95℃變性30s，35℃復性45s，72℃延伸30s，經(jīng)過30個循環(huán)后，最后72℃延伸10min。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：1、基于cytb基因羊絨、羊毛和羊駝絨之間非同源性序列設計特異性引物，進行pcr擴增定性鑒別羊絨、羊毛和羊駝絨，只要樣品其含量≥0.5％，就可利用dna技術定性鑒別出羊絨、羊毛或羊駝絨組分的存在。2、對于羊絨、羊毛和羊駝絨的混合物，當羊絨含量≥0.5％，羊駝絨含量≥5％時，pcr擴增技術定性可同時鑒別羊絨、羊毛及羊駝絨纖維，避免了人為因素的影響，檢測準確性、靈敏度極高，對解決貿(mào)易糾紛，尤其是國際性貿(mào)易爭端必將發(fā)揮重要作用。3、分別針對羊絨、羊毛及羊駝絨纖維cytb基因設計特異性引物的擴增技術，有效提高了羊絨檢測的靈敏度，為pcr技術在毛絨制品方面的推廣應用奠定了基礎，同時為基于pcr技術的羊絨、羊毛及羊駝絨纖維定性測研究提供了有力的技術保障。附圖說明圖1為純羊絨樣品分別采用羊毛、羊絨及羊駝絨引物進行擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊毛特異性引物，2為采用羊絨特異性引物，3為采用羊駝絨特異性引物；圖2為純羊毛樣品采用羊毛特異性引物進行擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊毛特異性引物；圖3為純羊駝絨樣品采用羊駝絨特異性引物進行擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊駝絨特異性引物；圖4是羊絨含量分別為0.5％、1％、5％、10％、20％的5個樣品均采用羊絨特異性引物進行擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4、5為5個樣品；圖5是羊毛含量分別為0.5％、1％、5％、10％、20％的5個樣品均采用羊毛特異性引物進行擴增的結(jié)果圖；圖6是羊駝絨含量分別為0.5％、1％、5％、10％的4個樣品均采用羊駝絨特異性引物進行擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4為4個樣品；圖7是按不同比例混合的羊絨、羊毛和羊駝絨纖維采用三種引物進行pcr擴增的結(jié)果圖，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4為表1中的4個樣品。具體實施方式本發(fā)明具體實施方式中，出現(xiàn)的百分數(shù)，如無特別說明，均為質(zhì)量百分數(shù)。1、材料、試劑與儀器標準參考材料：從內(nèi)蒙古收集來的純羊絨，以及上海第一紡織有限公司的細羊毛，羊駝。一般沒有市售的參考纖維混合物、纖維混紡是由兩種或三種不同的參考材料(羊絨/羊毛+羊駝)定量混合制備，具體如表1所示，表1中的百分數(shù)為質(zhì)量百分數(shù)，這些參考混合物通過顯微鏡檢查進行了分析。試劑：biomiga試劑盒；儀器：pcr擴增儀(5331型eppendorf基因擴germany)；冷凍干燥器(6870spexsampleprepusa)表1編號羊絨比例(％)羊駝毛比例(％)羊毛比例(％)10.50.59921198355904101080本發(fā)明利用比對的羊絨、羊毛和羊駝絨之間非同源性序列設計特異性引物，并確保擴增的cytb基因片段長度不同，設計引物見表2。表2將毛絨制品在冷凍干燥器用液氮研磨(6870spexsampleprepusa)加工成細小的顆粒。研磨時注意以下條件：先預冷5min，然后以每秒10次的速率運行，1min內(nèi)運行2個循環(huán)，再冷卻1min。選用biomiga試劑盒(廠家：www.biomiga.com，型號：gd2512-01)，按說明書步驟，將粉碎的毛絨制品進行蛋白酶，dtt預處理—高效裂解—柱分離—獲取線粒體dna等步驟，分別提取羊絨、羊毛，羊駝的線粒體dna，并以此為模板進行pcr特異性擴增。pcr反應條件為:95℃預變性5min，95℃變性30s，35℃復性45s，72℃延伸30s，經(jīng)過30個循環(huán)后，最后72℃延伸10min。如果樣品中僅存在羊絨、羊毛或羊駝纖維，那么用相應的引物可以擴增出目的條帶，但用其他引物則無擴增結(jié)果。當毛絨制品為純羊絨樣品，分別采用羊毛、羊絨及羊駝絨引物進行擴增相應的毛絨，擴增結(jié)果見圖1所示，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊毛特異性引物，2為采用羊絨特異性引物，3為采用羊駝絨特異性引物，由于該樣品為純羊絨，因此，采用羊絨特異性引物可以擴增出目的條帶，采用羊毛特異性引物和羊駝絨特異性引物不能擴增出目的條帶。從圖1中可以看出，當模板為羊絨，僅羊絨的cytb基因得到特異性擴增。當毛絨制品為純羊毛樣品，采用羊毛特異性引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖2所示，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊毛特異性引物，由于該樣品為純羊毛，因此，采用羊毛特異性引物可以擴增出目的條帶，得到特異性擴增。當毛絨制品為純羊駝絨樣品，采用羊駝絨特異性引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖3所示，其中，m為marker，作為標記，1為采用羊駝絨特異性引物，由于該樣品為純羊駝絨，因此，采用羊駝絨特異性引物可以擴增出目的條帶，得到特異性擴增。當毛絨制品為混合毛絨制品，采用5個樣品，編號為1～5的5個樣品中，羊絨含量分別為0.5％、1％、5％、10％、20％，均采用羊絨特異性引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖4所示，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4、5為5個樣品，由于5個樣品均含有羊絨，因此，在圖4中，都可以擴增出目的條帶，得到特異性擴增。采用編號為1～5的5個樣品中，羊毛含量分別為0.5％、1％、5％、10％、20％，均采用羊毛特異性引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖5所示，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4、5為5個樣品，由于5個樣品均含有羊毛，因此，在圖5中，都可以擴增出目的條帶，得到特異性擴增。采用編號為1～4的4個樣品中，羊駝絨含量分別為0.5％、1％、5％、10％，均采用羊駝絨特異性引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖5所示，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4為4個樣品，由于4個樣品均含有羊駝絨，因此，在圖6中，都可以擴增出目的條帶，得到特異性擴增。由圖4、5和6可知，當混合樣品中羊絨比例、羊毛比例或羊駝絨的比例≥0.5％時，利用特異性引物，pcr擴增技術均能準確定性。將羊絨、羊毛和羊駝絨纖維按不同比例混合，具體詳見表1，采用表2中的三種引物，進行pcr擴增實驗，結(jié)果見圖7，其中，m為marker，作為標記，1、2、3、4為表1中的4個樣品對應的擴增結(jié)果圖。從圖7中可以看出，混合樣品中同時檢測多種成分時，羊絨含量僅為0.5％時，就有相應的擴增條帶，當混和樣品中羊駝絨的含量≥5％時，有相應的擴增條帶。當前第1頁12