本發(fā)明屬于中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用分子身份證鑒定土荊皮飲片的方法。

背景技術(shù)：

土荊皮(pseudolariciscortex)，又稱土槿皮或者金錢松樹皮，為金錢松科金錢松屬金錢松(pseudolarixamabilis(nelson)rehd.)的干燥根皮或近根樹皮。土荊皮主要功效為殺蟲除真菌，臨床常用于治療手癬，腳癬，體癬，止癢等常見疥癬瘙癢。根據(jù)研究得知，土荊皮有毒性，含有多種抗真菌的土荊皮酸，對(duì)十幾種致病真菌都有抗菌功效。目前市面上與土荊皮名稱相似的藥材還有錦葵科木槿hibiscussyriacusl.的干燥莖皮根皮，木蘭科南五味子kadsuralongipedunculatafinetetgagnep.干燥根皮(也稱川槿皮)，以及曾經(jīng)為習(xí)用藥材的大戟科余甘子(又稱紫荊皮)phyllanthusemblical.的干燥樹皮，這幾種藥材與土荊皮相比較無毒，成分功能主治也均有差異，所以并不能作為代用藥材，鑒于這些藥材經(jīng)過高溫干燥加工后形態(tài)相似，混淆情況也時(shí)常發(fā)生，且現(xiàn)階段對(duì)于土荊皮的鑒定方式除了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定之外就是薄層掃描法和色譜法等，本發(fā)明則從分子角度出發(fā)，對(duì)土荊皮進(jìn)行鑒定。如今分子鑒定已廣泛應(yīng)用于中藥材中，而針對(duì)經(jīng)過高溫干燥或者加工處理過后的土荊皮而言，dna的提取會(huì)更加困難，擴(kuò)增長序列存在一定的難度，或者擴(kuò)增質(zhì)量不佳影響鑒定結(jié)果。邵鵬柱等人的研究表明人參在煎煮兩小時(shí)后只能擴(kuò)增獲得短片段，該結(jié)果可以作為藥材土荊皮dna質(zhì)量不佳的佐證。土荊皮來源于單種屬的金錢松，序列更為保守，因此具有極高的特異性。本發(fā)明基于土荊皮的該特性開發(fā)了一段土荊皮獨(dú)有的，具有極高特異的分子身份證，片段長度為25bp，以此彌補(bǔ)土荊皮飲片分子鑒定的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)鑒別技術(shù)中存在的上述缺陷并提供一種結(jié)果準(zhǔn)確靈敏，鑒定過程簡便快速的土荊皮鑒定方法。本發(fā)明所利用的分子身份證是根據(jù)土荊皮單屬單種的特性，在dna序列中經(jīng)過篩選和與blastn比對(duì)后確定了一段25bp的土荊皮分子身份證序列，該分子身份證具有種內(nèi)保守、種間變異較大的特點(diǎn)。經(jīng)過blast分析，證明該分子身份證為土荊皮特有，種內(nèi)序列相似度為100％(見圖1)，與其它物種的序列相似度較低。若未知樣品dna擴(kuò)增獲得此段分子身份證，則可判定樣品為土荊皮或含有土荊皮。

本發(fā)明提供了一種土荊皮飲片的分子鑒定方法，其中，所述方法包括檢測(cè)樣品基因組dna中是否存在本發(fā)明所述的分子身份證。當(dāng)存在所述分子身份證時(shí)，鑒定待測(cè)樣品中存在土荊皮。

可選的，所述方法包括如下步驟：

1)以待測(cè)樣品的基因組dna為模板，對(duì)所述分子身份證進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除引物區(qū)獲得擴(kuò)增片段，檢測(cè)擴(kuò)增片段中是否存在所述分子身份證，如果含有此分子身份證，則證明該飲片為土荊皮。

本發(fā)明對(duì)于pcr所使用的引物有特別的限制，因土荊皮為單屬單種，特異性較高，因此在pcr擴(kuò)增的過程中為了達(dá)到目的條帶的準(zhǔn)確性，采用專門設(shè)計(jì)的特異引物。所述pcr擴(kuò)增使用的引物為：

tjpf15’-ggcgtcgcatacaacaca-3’

tjpr15’-cggcagagaacatcggat-3’

上述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

可選的，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

pcrbuffer(10×)2.5μl，mg²⁺2μl(25mmol/l)，dntps混合物2μl(2.5mmol/l)，引物各1.0μl(2.5μmol/l)，模板dna1μl(-約30ng)，taqdna聚合酶1.0u，加滅菌雙蒸水至25μl，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

其中，所述待測(cè)樣品為土荊皮飲片。

附圖說明

圖1所示為土荊皮pseudolarixamabilis分子身份證5’-gatagcggggagcagcggacatggt-3’的比對(duì)結(jié)果。

圖2所示為土荊皮飲片及其混淆品(含有川槿皮，木槿皮，余甘子)的擴(kuò)增結(jié)果：利用特異性引物tjpf1/r1在土荊皮飲片和混淆品dna中擴(kuò)增含有土荊皮分子身份證片段，樣品共18個(gè)。其中第一條和最后一條泳道為dl2000marker。1-12泳道為土荊皮目的條帶(樣品編號(hào)依次為tjp1-tjp12)，泳道13-18為混淆品擴(kuò)增結(jié)果(13為川槿皮cjp1，14-16為木槿皮mjp1-3，17-18為余甘子ygz1-2)，ck為陰性對(duì)照。

圖3所示為在土荊皮dna序列中分子身份證查詢結(jié)果，序列標(biāo)黑部分即為土荊皮分子身份證。

序列表中列出的為土荊皮飲片(pseudolariciscortex)的分子身份證。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

實(shí)施例1用于說明土荊皮分子身份證鑒定的真實(shí)性

1)dna的獲取

從不同產(chǎn)地收集的土荊皮的基原樣本5份。分別取20mg，在mm400球磨儀(德國retsch)上進(jìn)行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組dna試劑盒提取總dna。

2)pcr擴(kuò)增

正向引物its2f5’-attcacaccaagtatcgcat-3’

反向引物its3r5’-attgtagtctggagaagcgtc-3’

由北京賽百盛生物工程公司合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μl。

25μl反應(yīng)體系：pcrbuffer(10×)2.5μl，mg2+2μl(25mmol/l)，dntps混合物2μl(2.5mmol/l)，引物各1.0μl(2.5μmol/l)，模板dna1μl(-約30ng)，taqdna聚合酶1.0u，加滅菌雙蒸水至25μl，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr反應(yīng)程序：在pcr儀上按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：

3)測(cè)序

pcr產(chǎn)物直接送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程實(shí)驗(yàn)室測(cè)序。測(cè)序引物為和。為確保dna條形碼序列的可靠性，需要進(jìn)行正反向測(cè)序或重復(fù)測(cè)序，然后將正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得dna條形碼序列。

4)序列拼接

本實(shí)施例采用應(yīng)用軟件codoncodealigner3.7.1(codoncodeco.，germany)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，具體方法是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的q值小于20，則刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)堿基q值小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止滑動(dòng)。

5)同屬近緣種序列比對(duì)

用mega5軟件對(duì)測(cè)序并拼接后的各個(gè)樣品以及genbank中土荊皮its2序列進(jìn)行比對(duì)，土荊皮樣品的its2序列包含5’-gatagcggggagcagcggacatggt-3’，且土荊皮為單屬單種，特異性很高(圖1)。

實(shí)施例2土荊皮飲片的鑒定

采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是以土荊皮飲片為樣品，以及擴(kuò)增引物為土荊皮特異性引物tjpf1/r1。本次所選擇的樣品來自安徽九華山、浙江臨安市、山東青島市，廣東省清平中藥材市場(chǎng)、北京同仁堂、河北安國中藥材市場(chǎng)。共計(jì)12批次，見表1。提取基因組dna，應(yīng)用特異引物tjpf1/tjpr1進(jìn)行擴(kuò)增(如圖2，泳道1-12)并測(cè)序，在序列中查找土荊皮分子身份證。研究結(jié)果表明：12/12份土荊皮飲片中均檢測(cè)到了土荊皮分子身份證。證明所購買的土荊皮飲片是正品。(以tjp7為例，圖3)

表1土荊皮飲片采樣表

實(shí)施例3利用土荊皮特異性引物對(duì)川槿皮等混淆藥材的鑒定

采用與實(shí)施1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是使用的藥材分別是川槿皮，木槿皮和余甘子為樣品。本次所選擇的樣品來自安徽亳州、江蘇蘇州、山東濟(jì)寧、河北保定、廣東梅州共計(jì)6個(gè)批次，見表2。提取基因組dna，應(yīng)用特異引物tjpf1/tjpr1進(jìn)行擴(kuò)增，通過電泳檢測(cè)沒有得到目的條帶，說明該方法適合于土荊皮及其混淆品的鑒定。(見圖2，泳道13-18)

表2混淆藥材采樣表

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。