本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為16.8％。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)癌癥globocan數(shù)據(jù)庫(kù)，2012年我國(guó)新發(fā)肺癌患者達(dá)65.28萬(wàn)，居所有惡性腫瘤之首，約占全球1/3。

基于組織病理學(xué)結(jié)果，肺癌可以劃分為小細(xì)胞肺癌(sclc)和非小細(xì)胞肺癌(nsclc)，其中80％為nsclc。多數(shù)(>70％)肺癌患者在確診時(shí)已處晚期，全身化療是主要治療選擇。近年來(lái)，隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌的治療已進(jìn)入到個(gè)體化分子靶向"精準(zhǔn)"治療的時(shí)代。間變性淋巴瘤激酶(alk)融合基因型肺癌已成為繼表皮生長(zhǎng)因子(egfr)突變型肺癌之后的又一個(gè)肺癌分子亞型，具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)及上市的靶向藥物。

肺癌中alk變異主要為alk基因與其他基因發(fā)生斷裂重排。其中，棘皮動(dòng)物微管結(jié)合樣蛋白4(eml4)-alk融合基因變異是其主要類(lèi)型。國(guó)內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)顯示，發(fā)生alk重排的非小細(xì)胞肺癌患者占3％～7％。eml4和alk兩個(gè)基因分別位于人類(lèi)2號(hào)染色體的p21和p23帶，相隔約12mb。eml4與微管形成密切相關(guān)，alk在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。這兩個(gè)基因片段的倒位融合[inv(2)(p21p23)]可以讓組織表達(dá)新的eml4-alk融合蛋白,形成非配體依賴(lài)性二聚體引起組成性的alk激活。alk信號(hào)可通過(guò)激活ras-mek-erk，jak3-stat3和pi3k-akt信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞增殖和生成。

克唑替尼是一種atp競(jìng)爭(zhēng)性酪氨酸激酶抑制劑，既可特異性靶向抑制alk，也可抑制c-met和ros1等信號(hào)通路?？诉蛱婺岱謩e于2011年和2013年被美國(guó)食品與藥品管理局(fda)和中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(cfda)批準(zhǔn)上市，用于治療eml4-alk表達(dá)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性nsclc患者。臨床試驗(yàn)顯示對(duì)于alk陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，一線單藥治療患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期(pfs)為10.9個(gè)月，有效率高達(dá)74％，二線單藥治療患者的中位pfs為7.7個(gè)月，有效率達(dá)到65.3％。2012年，據(jù)美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)(nccn)nsclc臨床指南推薦，晚期nsclc患者開(kāi)始治療前應(yīng)進(jìn)行eml4-alk檢測(cè)，并建議陽(yáng)性患者首先接受克唑替尼治療。

大約40％的alk陽(yáng)性nsclc患者對(duì)克唑替尼原發(fā)耐藥。新一代alk抑制劑色瑞替尼的i期臨床研究結(jié)果顯示其對(duì)克唑替尼耐藥及存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移病灶的患者具有較好的療效?；谝陨狭钊斯奈璧脑囼?yàn)數(shù)據(jù)，2014年4月，fda批準(zhǔn)色瑞替尼用于治療alk陽(yáng)性、經(jīng)克唑替尼治療疾病進(jìn)展或不能耐受的轉(zhuǎn)移性nsclc患者。alectinib是一種強(qiáng)效選擇性alk抑制劑，其ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，46例alk陽(yáng)性未經(jīng)克唑替尼治療患者的orr為93.5％。2014年7月aectinib在日本獲批使用。

目前針對(duì)alk融合基因檢測(cè)的常用方法有熒光原位雜交(fish)、免疫組織化學(xué)法(ihc)和熒光pcr方法。fish價(jià)格昂貴，操作規(guī)范要求較高，且不能區(qū)分alk融合類(lèi)型(fusionvariants)；ihc簡(jiǎn)便易行，但陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，也不能區(qū)分alk融合類(lèi)型。

cn102719525a公開(kāi)了用于檢測(cè)eml4-alk融合基因突變的引物、探針及檢測(cè)試劑盒，利用熒光pcr技術(shù)可以一次同時(shí)檢測(cè)eml4與alk基因的9種融合突變。隨著時(shí)間推移，新的eml4與alk基因的融合突變類(lèi)型逐漸被發(fā)現(xiàn)，cn102719525a檢測(cè)的9種eml4-alk融合突變已經(jīng)不能滿(mǎn)足臨床需求。且其公開(kāi)的方法中熒光pcr檢測(cè)需要90分鐘，逆轉(zhuǎn)錄pcr另需要65分鐘，整個(gè)步驟所需時(shí)間較長(zhǎng)。同時(shí)為保證臨床試驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好在產(chǎn)品中加入防污染體系，同時(shí)引入空白對(duì)照，對(duì)檢測(cè)試劑及環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)，防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，這一方面cn102719525a中未有提及。

因此需要有新的eml4-alk檢測(cè)方法來(lái)滿(mǎn)足以下要求：1)能涵蓋更多eml4-alk融合突變類(lèi)型；2)能節(jié)約檢測(cè)時(shí)間；3)體系設(shè)計(jì)中增加防污染體系及空白對(duì)照，防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)eml4-alk基因融合突變的引物組合，包括seqidno:1-seqidno:14所示的序列。該引物組合可以特異性識(shí)別13種eml4-alk融合突變類(lèi)型。

不僅如此，本發(fā)明還提供了與所述引物組合配合使用的特異性探針，其序列如seqidno:15所示，其5’端修飾有fam或vic，3’端修飾有nfq-mgb。

第二方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)eml4-alk基因融合突變的試劑盒，其含有前述的引物組合與特異性探針。

為了提高所述試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確度，所述試劑盒還含有質(zhì)控系統(tǒng)，陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液。

所述質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針，質(zhì)控引物的序列如seqidno:16和seqidno:17所示，所述質(zhì)控探針的序列如seqidno:18所示，所述質(zhì)控探針的5’端修飾有fam或vic，3’端修飾有nfq-mgb。

所述陽(yáng)性對(duì)照液為含有4種質(zhì)粒dna的混合液，所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列，所述空白對(duì)照為tris-hcl緩沖液。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括本領(lǐng)域其他熒光pcr試劑盒的必要成分，如pcr緩沖液，hotstarttaq酶和ung酶。

所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：

(1)提取檢測(cè)樣本中的rna，檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織或胸腔液；

(2)將提取的rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

(3)根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)反應(yīng)體系的fam和vic/hex熒光強(qiáng)度，以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，ct值大于等于38：陰性；ct值小于38：陽(yáng)性。

其中，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna的方法涉及反轉(zhuǎn)錄體系以及如下操作步驟：

反轉(zhuǎn)錄體系包括如下成分：

逆轉(zhuǎn)錄混合液(含逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl

rna3μl

加dnase/rnase-freeddh2o10μl。

操作步驟為：

a)將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混勻，置于冰上，取2μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液加入無(wú)菌無(wú)酶的離心管中，混勻。

b)加入待測(cè)樣品rna3μl，rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)，補(bǔ)水至10μl。

c)37℃保溫15分鐘。

d)85℃保溫5秒后冰上冷卻，得到cdna模板。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明采用arms引物特異性識(shí)別13種eml4-alk融合突變類(lèi)型，基于taqman探針?lè)ㄊ占療晒庑盘?hào)，特異性得到很好保障。本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)建立了實(shí)時(shí)熒光pcr體系，可同時(shí)檢測(cè)eml4-alk基因13種融合突變，與cn102719525a發(fā)明中3個(gè)反應(yīng)體系檢測(cè)9種突變類(lèi)型相比，本發(fā)明需要在一個(gè)反應(yīng)體系中涵蓋更多檢測(cè)位點(diǎn)，對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)要求更高；(2)靈敏度高，5拷貝的突變可以檢出；(3)僅使用14條引物、1條探針便實(shí)現(xiàn)13個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)，而cn102719525a中使用14條引物、5條探針實(shí)現(xiàn)9個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)，相比較而言，本發(fā)明的原材料組分更少，生產(chǎn)成本更低；(4)檢測(cè)速度快，本發(fā)明中逆轉(zhuǎn)錄pcr僅需15分鐘，熒光pcr僅需60分鐘，整個(gè)逆轉(zhuǎn)錄pcr及熒光pcr檢測(cè)過(guò)程只需要80分鐘即可完成；(5)樣本檢測(cè)范圍廣，樣本可以為新鮮病理組織，石蠟包埋組織或胸腔液；(6)本發(fā)明體系中引入ung酶-dutp防污染體系及空白對(duì)照系統(tǒng)，能更好的防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明非融合突變樣本檢測(cè)示意圖。

圖2為本發(fā)明融合突變樣本檢測(cè)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于eml4-alk融合基因檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括pcr緩沖液，13組特異性引物，1條特異性探針和質(zhì)控系統(tǒng)，hotstarttaq酶，ung酶。

所述pcr緩沖液中含有1.0～5.0mm的mgcl2，1.0～5.0mm的dntps，即datp、dutp、dgtp和dctp各1.0～5.0mm。

所述13組特異性引物序列的正向引物為seqidno:1-13，反向引物序列為seqidno:14。其中seqidno:1-13為arms引物，可以特異性識(shí)別13種對(duì)應(yīng)的eml4-alk融合突變類(lèi)型，其中seqidno:14是普通pcr引物。13條arms引物分別在3’模板堿基與待擴(kuò)增類(lèi)型的堿基配對(duì)，同時(shí)在其3’末端倒數(shù)第2-3位增加一個(gè)或者兩個(gè)堿基錯(cuò)配，以增強(qiáng)特異性。

各引物序列列舉如下：

eml4-alk-m1-f：cctgggaaaggacctaaagagt(seqidno:1)；

eml4-alk-m2-f:aactcgggagactatgaaatattgtactag(seqidno:2)；

eml4-alk-m3-f：cataaagatgtcatcatcaaccaagtct(seqidno:3)；

eml4-alk-m4-f：tcgcgaaaaaaacagccaagtat(seqidno:4)；

eml4-alk-m5-f：gaaagagaaatagagatatgctggatgtg(seqidno:5)；

eml4-alk-m6-f：cgaggaacatttaatgatgggtg(seqidno:6)；

eml4-alk-m7-f：cagtgaaaaaatcagtctcaagtaaagag(seqidno:7)；

eml4-alk-m8-f：tgaccacccacctgcagtct(seqidno:8)；

eml4-alk-m9-f：ctctgtgatgcgctactcaatagtct(seqidno:9)；

eml4-alk-m10-f：tgaccacccacctgcagag(seqidno:10)；

eml4-alk-m11-f：atgatctgaatcctgaaagagaaatagatc(seqidno:11)；

eml4-alk-m12-f：gaacgcactcaggcagtcc(seqidno:12)；

eml4-alk-m13-f：cattaaaaaatgtggaatgctgcta(seqidno:13)；

eml4-alk-m-r：ctccatctgcatggcttgc(seqidno:14)。

所述特異性探針5’端修飾有fam或vic，3’端修飾有非熒光淬滅基團(tuán)nfq(non-fluorescentquencher)，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生熒光，因此可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)該特異性探針上還連接有mgb修飾基團(tuán)，可以將該探針的tm值提高10℃左右，因此同樣的tm值，mgb探針可以比普通taqman探針設(shè)計(jì)的更短，特異性更強(qiáng)。

優(yōu)選地，所述1條特異性探針序列為seqidno:15，可特異性識(shí)別alk基因20號(hào)外顯子上的一段序列。

探針序列列舉如下：

eml4-alk-m-p：cgccggaagcaccag(seqidno:15)。

本發(fā)明實(shí)施例中，使用質(zhì)控系統(tǒng)監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量。rna容易降解，對(duì)樣本制備與保存、rna提取及逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程要求較高。采用表達(dá)量穩(wěn)定的基因構(gòu)建質(zhì)控系統(tǒng)，可以有效監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量，避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此本發(fā)明實(shí)施例中采用質(zhì)控系統(tǒng)來(lái)消除上述隱患，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針，本發(fā)明實(shí)施例中可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它質(zhì)控系統(tǒng)。優(yōu)選地，所述質(zhì)控系統(tǒng)包含質(zhì)控引物和質(zhì)控探針。質(zhì)控引物序列為seqidno:16和seqidno:17，所述質(zhì)控探針序列為seqidno:18，所述質(zhì)控探針5’端修飾有fam或vic，3’端修飾有nfq-mgb。

優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的質(zhì)控系統(tǒng)針對(duì)人b2m基因設(shè)計(jì)。其中包含的質(zhì)控引物序列如下所示：

b2m-f：atgagtatgcctgccgtgtg(seqidno:16)；

b2m-r：gcttacatgtctcgatcccact(seqidno:17)。

本發(fā)明實(shí)施例中的質(zhì)控探針5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，如fam、vic等，3′端標(biāo)記有不發(fā)光熒光淬滅基團(tuán)，如nfq-mgb等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著pcr的進(jìn)行，taq酶在dna鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板dna的拷貝數(shù)。

優(yōu)選地，所述質(zhì)控探針為：

b2m-p：ccatgtgactttgtcacagc(seqidno:18)。

優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的酶溶液中含有taq酶，其為pcr反應(yīng)所必需的且該酶溶液還含有ung酶，其中ung(uracil-n-glycosylase)酶為尿嘧啶-n-糖基化酶，其特點(diǎn)是最佳活性溫度為50℃，95℃滅活，其作用原理是選擇性水解斷裂含有du的雙鏈或單鏈dna中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的dna鏈。在pcr反應(yīng)中，使用ung酶可預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染。

優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的檢測(cè)試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照可監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)的正常進(jìn)行，所述陽(yáng)性對(duì)照液含有4種質(zhì)粒dna混合液，所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列，該質(zhì)粒可為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的質(zhì)粒，這4種質(zhì)粒濃度相同，均為2000copies/μl；所述空白對(duì)照液為tris-hcl(10mm)緩沖液。

本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種eml4-alk融合基因的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)并篩選特異性擴(kuò)增與檢測(cè)eml4-alk融合基因的引物組合和探針組合；制備本發(fā)明的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒。

(2)獲得待測(cè)樣品總rna；

(3)將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；

(3)以cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增：每個(gè)樣本分四個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)13種eml4-alk融合突變類(lèi)型，將上述獲得的cdna先后取相同的量加入所述四個(gè)反應(yīng)管中并同時(shí)進(jìn)行pcr反應(yīng)。

優(yōu)選地，以25μl反應(yīng)體系為例，向反應(yīng)管中加入待檢測(cè)樣品后得到的混合物中各組分終濃度及含量如下：

上述體系僅為例證性，在實(shí)際應(yīng)用中可以按照比例擴(kuò)大或縮小該混合物體積及其中各組分含量。

具體地，在上述25μl反應(yīng)體系中，所述各對(duì)引物包括上述步驟(1)中的13對(duì)特異性引物，1對(duì)質(zhì)控引物及質(zhì)控引物，所述各條探針包括上述步驟(1)中的特異性探針，所述樣品為cdna。

具體地，在步驟(3)中的熒光定量pcr反應(yīng)條件為：

37℃處理10分鐘，95℃預(yù)變性5分鐘，

40個(gè)循環(huán)：95℃15秒，60℃35秒并收集熒光信號(hào)。

在上述pcr反應(yīng)后，所得結(jié)果按以下步驟進(jìn)行結(jié)果判定：

根據(jù)弱陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，對(duì)試劑盒有效性判定：

根據(jù)質(zhì)控體系結(jié)果，進(jìn)行樣本有效性的判定，質(zhì)控pcr反應(yīng)液：fam通道ct值≤30，樣本rna質(zhì)量較好，加量適中。

對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，確定樣本是否存在融合。

樣本檢測(cè)ct值≥38或無(wú)ct值，則該樣本為非融合突變或?yàn)楸驹噭┖袡z測(cè)范圍外融合突變；

樣本檢測(cè)ct值＜38，則樣本為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的融合突變。

本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果真實(shí)可信的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單快速，能在80分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并且結(jié)果判讀簡(jiǎn)單客觀，便于分析。

以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。

實(shí)施例1

制備本發(fā)明的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒，包括以下步驟：

1、引物及探針合成：

設(shè)計(jì)并合成13組特異性引物，其中正向引物為seqidno:1-13，公用反向引物為seqidno:14，特異性探針為seqidno:15，探針5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記nfq-mgb不發(fā)光淬滅基團(tuán)。將引物、探針?lè)謩e制備成100μm的母液儲(chǔ)存。

2、制備質(zhì)控系統(tǒng)：

設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人b2m基因的1對(duì)質(zhì)控引物，該引物對(duì)序列為seqidno:16和seqidno:17；設(shè)計(jì)并合成質(zhì)控探針，該探針為seqidno:18。將該質(zhì)控引物和探針?lè)謩e配制成100μm的母液儲(chǔ)存。

3、制備其他試劑：

制備pcr緩沖液，其中含有1.0mm的mgcl2，datp、dutp、dgtp和dctp各1.0mm；制備酶混合液，其中含有taq酶0.5×10³u/ml，ung酶0.1×10³u/ml。

4、制備陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，該陽(yáng)性對(duì)照液中含有4種質(zhì)粒dna混合液，所述4種質(zhì)粒dna分別含有eml4-alk-m1、eml4-alk-m5、eml4-alk-m7和b2m序列，該質(zhì)粒的選擇及設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，均為2000copies/μl；該空白對(duì)照液為tris-hcl(10mm)緩沖液。

5、pcr反應(yīng)液配制：

按照下表進(jìn)行四個(gè)不同體系pcr反應(yīng)液配制

表1：pcr反應(yīng)液配制

6、組裝試劑盒：

試劑盒中包含4管pcr反應(yīng)液，根據(jù)pcr反應(yīng)體系各成分使用量，計(jì)算20人份規(guī)格各成分使用量，配制試劑盒各管中成分并組裝。

實(shí)施例2

用實(shí)施例1制備的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)施例中收集300例肺癌患者的ffpe樣本，從其中提取rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna后，用實(shí)施例1中得到的eml4-alk融合基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待檢樣品的eml4-alk融合突變情況。

1、ffpe樣本rna提取

(a)取上述各肺癌樣本，分別加入1ml二甲苯，混勻，室溫下13000rpm離心2分鐘，棄上清液，加入1ml無(wú)水乙醇到沉淀中，震蕩混勻(去除二甲苯)，室溫下13000rpm離心2分鐘棄上清液，打開(kāi)離心管蓋，37℃放置10分鐘，使殘留的乙醇蒸發(fā)干凈；

(b)在離心管中加240μlbufferpkd及10μl蛋白酶k，震蕩混勻，56℃孵育15分鐘，80℃孵育15分鐘，冰上孵育3分鐘，然后13,000rpm離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管。往上清中加入25μldnaseboosterbuffer和10μldnasei原液，室溫孵育15分鐘，后加入500μlbufferrbc，混勻；

(c)往上清液加入1200μl無(wú)水乙醇，混勻，取700μl樣品包括前面生成的沉淀轉(zhuǎn)移到帶有2ml收集管的rnaminelute離心柱里，大于10,000rpm離心15s，棄廢液，重復(fù)上一步直到樣品轉(zhuǎn)移到rnaminelute離心柱里。

(d)打開(kāi)蓋子加入500μlbufferrpe，蓋緊蓋子，大于10000rpm離心2分鐘，重復(fù)本步驟一次后，將柱子轉(zhuǎn)移到收集管中，向吸附膜中間部位滴加14-30μlrnase-freewater，離心1分鐘后收集rna。

2、rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna：

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna提取質(zhì)量及濃度，確定其濃度od260/od280為1.8-2.0。取0.1～5μg的rna作為其cdna合成的模板，采用武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司的試劑盒合成cdna，cdna合成體系如下：

逆轉(zhuǎn)錄混合液(含逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl

rna3μl

加dnase/rnase-freeddh2o10μl。

(a)將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混勻，置于冰上，取2μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液加入無(wú)菌無(wú)酶的離心管中，混勻。

(b)加入待測(cè)樣品rna3μl，rna總量在0.1～5μg范圍內(nèi)，補(bǔ)水至10μl。

(c)37℃保溫15分鐘。

(d)85℃保溫5秒后冰上冷卻，得到cdna模板。

3、樣本的熒光定量pcr檢測(cè)

取2μl步驟2中得到的cdna，加入四個(gè)反應(yīng)體系中，使反應(yīng)體系總體積均為25μl，并放入熒光定量pcr儀，按如下所示設(shè)置pcr反應(yīng)程序后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：

95℃5分鐘；

95℃15s，60℃35s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)后收集fam和vic/hex的熒光信號(hào)。

4、樣本的檢測(cè)結(jié)果分析:

檢測(cè)fam熒光信號(hào)ct值，根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷結(jié)果：檢測(cè)反應(yīng)體系的fam熒光強(qiáng)度，以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，ct值大于等于38：陰性；ct值小于38：陽(yáng)性。

檢測(cè)結(jié)果表明所檢測(cè)300例肺癌樣本中有23例發(fā)生有eml4-alk融合突變，突變率為7.6％，同時(shí)對(duì)上述所有樣本進(jìn)行ihc對(duì)比檢測(cè)，ihc結(jié)果表明突變有23例，兩種檢測(cè)方法的符合率為100％，進(jìn)一步證明了本發(fā)明體系檢測(cè)的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表4。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改

進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

表2eml4-alk基因13種融合突變

表3試劑盒的組成

表4臨床樣本檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司

<120>eml4-alk融合基因突變的檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)試劑盒

<130>khp171112142.0tq

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cctgggaaaggacctaaagagt22

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aactcgggagactatgaaatattgtactag30

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cataaagatgtcatcatcaaccaagtct28

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcgcgaaaaaaacagccaagtat23

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gaaagagaaatagagatatgctggatgtg29

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cgaggaacatttaatgatgggtg23

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cagtgaaaaaatcagtctcaagtaaagag29

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tgaccacccacctgcagtct20

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ctctgtgatgcgctactcaatagtct26

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tgaccacccacctgcagag19

<210>11

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

atgatctgaatcctgaaagagaaatagatc30

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gaacgcactcaggcagtcc19

<210>13

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

cattaaaaaatgtggaatgctgcta25

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ctccatctgcatggcttgc19

<210>15

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgccggaagcaccag15

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

atgagtatgcctgccgtgtg20

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

gcttacatgtctcgatcccact22

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

ccatgtgactttgtcacagc20