本發(fā)明涉及魚類寄生蟲檢測領域，具體涉及一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物、熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：寄生于黃顙魚鰓上的黃顙四錨蟲(bychowskyellapseudobagriachmerov)分布很廣，東北、山東、浙江、湖北、廣東、江蘇、福建、云南、四川等均有記錄，而且宿主亦廣泛，它可寄生于多種黃顙屬魚類及鳠屬(hemibagrus)魚類鰓上。小型蟲體，體長0.210-0.588mm，體寬0.060-0.168mm。屬于一種單殖吸蟲，寄生于魚類鰓部時表現(xiàn)出明顯的“群居”現(xiàn)象，少量寄生黃顙四錨蟲時，養(yǎng)殖魚類并沒有明顯癥狀，多表現(xiàn)為吃食量下降或暗浮頭現(xiàn)象。大量寄生時，病魚呼吸困難，游動緩慢，鰓部明顯浮腫，鰓蓋張開，鰓上粘液增多，鰓絲腫脹或粘連，嚴重時發(fā)生變性或壞死，鰓因貧血而呈現(xiàn)蒼白色或花鰓狀。黃顙四錨蟲流行與春末夏初，對魚苗和魚種的危害較大，大量寄生蟲常引起苗種的大批死亡。寄生于大規(guī)格魚種或成魚時常引起養(yǎng)殖魚類繼發(fā)細菌寄生而產(chǎn)生大量死亡。黃顙四錨蟲由于體型小，小量寄生時無癥狀，因此傳統(tǒng)的檢測方法，并不適合該寄生蟲。而在檢測和診斷技術中，熒光定量聚合酶鏈反應(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,rtfq-pcr)因其具有的簡便、快速、敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測的優(yōu)點，已在該研究領域得到廣泛應用。目前對于黃顙四錨蟲的檢測國內(nèi)尚沒有熒光定量pcr檢測技術方面的研究報告。為了及時控制魚病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測魚鰓內(nèi)或環(huán)境水體中是否存在寄生蟲的技術。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對以上問題，提供了一對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測的專用引物，包含該引物的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的技術方案是：一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物，所述引物包括上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r，18s-ⅱ-f的序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，18s-ⅱ-r的序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。所述上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r的摩爾濃度比是1：1。一種黃顙四錨蟲的熒光定量pcr檢測試劑盒，包括以下組分：其中，上游引物為18s-ⅱ-f，序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，下游引物為18s-ⅱ-r，序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照包括7.5×107拷貝/μl的強陽性對照和469拷貝/μl的臨界陽性對照質粒；所述陰性對照為無菌水。所述陽性對照的核苷酸序列是：ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcatagcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatgctcctttaacg。所述陽性對照質粒的構建方法包括如下步驟：1)、制備黃顙四錨蟲的dna模板：將形態(tài)鑒定好的黃顙四錨蟲置于1.5ml的ep管中，加入180μl組織裂解液tl，20mg/ml的蛋白酶k20μl，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μl結合液cb和100μl異丙醇，13000rpm離心5min，將上清加入一個吸附柱ac中，13000rpm離心30-60s；加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm離心30s；加入600μl漂洗液wb，12000rpm離心30s，并重復該步驟一次；取出吸附柱ac，放入干凈的離心管中，加入100μl無菌水，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min，并將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，得到黃顙四錨蟲dna模板，在-20℃保藏備用；2)、pcr體系擴增：pcr體系為：黃顙四錨蟲dna模板5μl10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2×進口實時熒光pcr緩沖液12.5μl，depc水補充至25μl；pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)；3)、將步驟2)得到的黃顙四錨蟲的目的片段用2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到靶標條帶，用干凈的手術刀切下包含靶標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收靶標dna；4)、將回收的dna在16℃下加入到連接體系中，并于16℃下放置10h；5)、將步驟4)得到的連接產(chǎn)物轉化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落；6)、挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體通用引物及菌落pcr驗證并挑選陽性克隆子；7)、將陽性克隆子對應的細菌于lb液體培養(yǎng)基中，37℃下200rpm搖菌培養(yǎng)10h，并取1ml用質粒小提試劑盒提取質粒dna，從而得到陽性對照質粒，測定提取的陽性對照質粒dna的濃度，稀釋后作為陽性對照用于pcr檢測。一種黃顙四錨蟲的檢測方法，使用上述的試劑盒進行檢測，包括如下步驟：1)、制備dna模板：取樣品一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸，充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板；2)、實時熒光定量pcr擴增：配置pcr反應體系，每25μl的pcr反應體系具體包括：其中，12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液包括2.5μl的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)；3)、結果判斷：觀察實時熒光定量pcr擴增曲線，若獲得的熒光擴增曲線ct值低于臨界對照ct值，則樣品患有黃顙四錨蟲病。本發(fā)明的有益效果是：1)首次提供了黃顙四錨蟲18s基因熒光定量pcr檢測中的專用引物，使利用熒光定量pcr對待測樣本中18s可變區(qū)基因檢測成為可能；2)本檢測方法與黃顙四錨蟲其他常規(guī)檢測方法，如顯微鏡觀察法和普通pcr相比，靈敏度和特異性極高，具有操作程序簡單易用的特點，本試劑盒可用于操作程序化，適合大面積推廣和應用，檢測效率得到了很大的提高；3)本檢測方法不僅能夠評價魚體的黃顙四錨蟲寄生情況，同時也可用于水體中黃顙四錨蟲的檢測。本發(fā)明能為快速、準確地檢測出黃顙四錨蟲提供保證，為預防疾病，科學用藥和保障魚類健康提供了保障。依據(jù)本發(fā)明專用引物的檢測方法及試劑盒可用于魚類鰓及水體中黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因的核苷酸檢測。附圖說明圖1是采用三對引物分別對于黃顙四錨蟲的目標靶基因進行擴增后的電泳圖；圖2是采用三對引物對六種非靶標魚類寄生蟲的目標靶基因進行擴增后的電泳圖；圖3是利用第二對引物18s-ⅱ-f/r進行的陽性對照標準品實時熒光定量pcr擴增曲線圖；圖4是利用第二對引物18s-ⅱ-f/r對魚dna樣本進行的實時熒光定量pcr擴增曲線圖。具體實施方式本發(fā)明的一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物，包括上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r，18s-ⅱ-f的序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，18s-ⅱ-r的序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。所述上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r的摩爾濃度比是1：1。一種黃顙四錨蟲的熒光定量pcr檢測試劑盒，包括以下組分：其中上游引物為18s-ⅱ-f，序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，下游引物為18s-ⅱ-r，序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照包括7.5×107拷貝/μl的強陽性對照和469拷貝/μl的臨界陽性對照質粒；所述陰性對照為無菌水。所述陽性對照的核苷酸序列是：ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcatagcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatgctcctttaacg。所述陽性對照質粒的構建方法包括如下步驟：1)、制備黃顙四錨蟲的dna模板：將形態(tài)鑒定好的黃顙四錨蟲置于1.5ml的ep管中，加入180μl組織裂解液tl，20mg/ml的蛋白酶k20μl，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μl結合液cb和100μl異丙醇，13000rpm離心5min，將上清加入一個吸附柱ac中，13000rpm離心30-60s；加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm離心30s；加入600μl漂洗液wb，12000rpm離心30s，并重復該步驟一次；取出吸附柱ac，放入干凈的離心管中，加入100μl無菌水，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min，并將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，得到黃顙四錨蟲dna模板，在-20℃保藏備用；2)、pcr體系擴增：pcr體系為：黃顙四錨蟲dna模板5μl10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2×進口實時熒光pcr緩沖液12.5μl，depc水補充至25μl；pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)；3)、將步驟2)得到的黃顙四錨蟲的目的片段用2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到靶標條帶，用干凈的手術刀切下包含靶標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收靶標dna；4)、將回收的dna在16℃下加入到連接體系中，并于16℃下放置10h；5)、將步驟4)得到的連接產(chǎn)物轉化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落；6)、挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體通用引物及菌落pcr驗證并挑選陽性克隆子；7)、將陽性克隆子對應的細菌于lb液體培養(yǎng)基中，37℃下200rpm搖菌培養(yǎng)10h，并取1ml用質粒小提試劑盒提取質粒dna，從而得到陽性對照質粒，測定提取的陽性對照質粒dna的濃度，稀釋后作為陽性對照用于pcr檢測。一種使用上述試劑盒檢測黃顙四錨蟲的檢測方法，包括如下步驟：1)、制備dna模板：取樣品一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸，充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板；2)、實時熒光定量pcr擴增：配置pcr反應體系，每25μl的pcr反應體系具體包括：其中，12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液包括2.5μl的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)；3)、結果判斷：觀察實時熒光定量pcr擴增曲線，若獲得的熒光擴增曲線ct值低于臨界對照ct值，則樣品患有黃顙四錨蟲病。下面結合實施例對本發(fā)明作具體說明。本發(fā)明的實驗方法均參照《精編分子生物學實驗指南》(f.m.奧斯伯等主編，科學出版社2005年出版)所建議的實驗條件。實施例1用于對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因進行熒光定量pcr檢測的引物設計及篩選1、生物信息學方法設計引物及進行引物篩選根據(jù)文獻信息，對中科院水生生物研究所篩選并獲得的黃顙四錨蟲18s(genbank登錄號：ky680236)可變區(qū)進行分析，同時下載12種近源寄生蟲18s基因序列作為參考序列，請見下表。參考序列物種名稱(拉丁名)genbankmizelleusindicuskr296800bychowskyellatchangikt852455bychowskyellafossilisikt852454mizelleuslongicirruskr296801hamatopedunculariaelongatakt252896thysanotohaptorrexkt252903neocalceostomoidesspinivaginaliskt252904hamatopedunculariathalassinikt252900chauhanelluschauhanikt252897euzetremaknoepffleriaj564212pseudomurraytremaardensaj228793lamellodiscusdonatellaefn296214通過clustalx進行比對后，選擇合適區(qū)域設計引物，該區(qū)域在黃顙四錨蟲18s基因可變區(qū)，是分辨黃顙四錨蟲的特異性序列，但相對于參考序列至少存在10％-30％的差異，選定區(qū)域后采用abiprimerexpress3.0實時熒光定量pcr引物設計軟件，設計合成引物。將所提取的備選引物按以下要求進行篩選：1)引物在可變區(qū)內(nèi)設計并具有特異性；2)產(chǎn)物不能形成二級結構(自由能小于58.61kj/mol)；3)引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大；4)g+c含量在40％～60％之間；5)堿基要隨機分布，盡量均勻；6)引物自身不能有連續(xù)超過4個堿基的互補；7)引物之間不能有連續(xù)超過4個堿基的互補；8)引物5’端可以修飾；9)3’端不可修飾，而且要避開at,gcrich的區(qū)域(2-3個)；10)引物整體設計自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9kj/mol；11)引物設計避免dna污染，最好跨外顯子接頭區(qū)；12)引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源；13)查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的dna序列，與需要擴增的目的片段長度相似；14)tm值在55-65℃之間。所用pcr引物由上海生工公司合成，引物要求page純化，到貨時為引物干粉，用無菌水復溶后，對干粉進行含量測定，引物至100pmol/μl貯存液后備用。針對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因，共設計了3組上下游引物，序列如下：18s-ⅰ(154bp)上游引物18s-ⅰ-f：5’-caaatcaaacgcttcggcgtg-3’；下游引物18s-ⅰ-r：5’-tccccgttacccgtcataatc-3’；18s-ⅱ(131bp)上游引物18s-ⅱ-f：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’；下游引物18s-ⅱ-r：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’；18s-ⅲ(181bp)上游引物18s-ⅲ-f：5’-acctccatgtcgttaccttg-3’；下游引物18s-ⅲ-r：5’-accaggcaaatcatgctcac-3’。2、分子生物學實驗進行引物檢測2.1實驗材料及試劑材料：魚類常見致病黃顙四錨蟲，6個陰性對照，即黃顙華指環(huán)蟲(sinidactylogyruspseudobagrus)，黃顙偽錨盤蟲(pseudoancylodiscoidesgigi)，月斧偽錨盤蟲(pseudoancylodiscoidesstrelkowi)，河鱸錨首蟲(ancyrocephalusmogurndae)，東方車輪蟲(trichodinaorientalis)和鯉斜管蟲(chilodonellacyprini)。七個寄生蟲均來自中科院武漢水生生物研究所。用動物dna提取試劑盒(tiangen)提取寄生蟲基因組dna。同時分別提取患病魚的鰓、及混合有黃顙四錨蟲的水體中微生物的基因組dna，用于評價pcr體系的特異性和靈敏度。試劑：5u/μltaqdnapolymerase(promega，含10×reactionbuffer和25mmmg2+)、10mmdntps(promega)、dnamarkeri(tiangen)；milliporeh2o(millipore公司生產(chǎn)的超純水)高壓滅菌后分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2引物、寄生蟲測試用常規(guī)pcr測試所設計的引物及供試寄生蟲，pcr反應體系(10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進口實時熒光pcr緩沖液12.5μl；所述12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水的混合物；pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán))根據(jù)各組分的濃度配制，擴增程序根據(jù)引物的tm值及產(chǎn)物的大小編寫。常規(guī)pcr擴增在bio-radmycycler梯度擴增儀上進行，瓊脂糖凝膠電泳結合凝膠成像系統(tǒng)檢測所得到的pcr產(chǎn)物，結果如圖1所示。2.3黃顙四錨蟲常規(guī)pcr方法檢測三對引物結果2.3.1常規(guī)pcr測試寄生蟲及設計的引物設計的三對引物序列如下：18s-ⅰ上游引物18s-ⅰ-f：5’-caaatcaaacgcttcggcgtg-3'；下游引物18s-ⅰ-r：5’-tccccgttacccgtcataatc-3'；18s-ⅱ上游引物18s-ⅱ-f：5’-ctggtcatggctctgctgac-3'；下游引物18s-ⅱ-r：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3'；18s-ⅲ上游引物18s-ⅲ-f：5’-acctccatgtcgttaccttg-3'；下游引物18s-ⅲ-r：5’-accaggcaaatcatgctcac-3'.從圖1可以看出，對于黃顙四錨蟲，病魚鰓部組織以及混有黃顙四錨蟲的水體，所設計的三對引物均可擴增出靶標條帶，表明黃顙四錨蟲、自行設計的引物以及使用的pcr擴增體系均可用于后續(xù)的實驗。2.3.2常規(guī)pcr檢測體系的特異性對于常見的六種非靶標魚類寄生蟲，使用建立的常規(guī)pcr檢測體系(如2.2中所述)均為檢測陰性，對黃顙四錨蟲為檢測陽性，這表明所建立的常規(guī)pcr檢測體系具有極好的特異性，可以用于黃顙四錨蟲的快速檢測(如圖2所示)。3、實時熒光定量檢測引物擴增效率3.1陽性對照質粒及標準模板的制備用建立的常規(guī)pcr體系擴增黃顙四錨蟲的目的片段，2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到特定的靶標條帶。用干凈的手術刀切下包含靶標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶標dna。將回收的部分dna16℃下加入到連接體系中(10μl，含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，并在16℃下放置10h后將全部的連接產(chǎn)物轉化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落。挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落pcr驗證并挑選陽性克隆子。將陽性克隆子對應的細菌于lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并取1ml提取質粒dna(普通質粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，從而得到陽性對照物。測定提取的質粒dna的濃度，稀釋到一定倍數(shù)作為陽性對照用于pcr檢測。3.2引物pcr擴增效率檢測引物的篩選原則為：在目的可變區(qū)中選擇pcr擴增效率較高(90～110％的擴增效率比較合適)的引物作為候選引物。3.2.1梯度模板準備將陽性對照物dna(上述3.1所得)，用無菌水以20倍梯度稀釋，作為熒光定量pcr反應體系優(yōu)化用模板。取20×、400×、8000×、160000×、3200000×稀釋度，編號依次對應為l1、l2、l3、l4、l5。分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2熒光定量pcr緩沖液及pcr程序pcr反應體系為：10pmol/μl的上游引物2.0μl，10pmol/μl的下游引物2.0μl，樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進口實時熒光pcr緩沖液12.5μl；所述12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水的混合物；所述pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)。結果如表1所示。3.2.3結果表1不同引物擴增效率引物l1l2l3l4l5擴增效率18s-i18.2321.4024.5827.7530.92157.23％18s-ii14.9419.1522.7127.1331.78101.72％18s-iii13.9519.2524.5529.8535.1576.02％注：表格中注明值為ct值。根據(jù)擴增效率來看，選擇ii號引物對18s-ii-f/r繼續(xù)后續(xù)實驗(因為90～110％的擴增效率比較合適)。實施例2：熒光定量pcr引物用量的優(yōu)化1、熒光定量pcr引物用量的第一次優(yōu)化用稀釋好的l1(20×)和l2(400×)陽性對照質粒作為引物量優(yōu)化的模板，分別對引物的上下游的用量進行梯度優(yōu)化，引物工作液濃度10pmol/μl，pcr反應體系為：上下游引物量見表2，樣品(模板)dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(2.5μl的thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)。結果如表2所示，從結果可以分析出，pcr引物在以下梯度組合可以正常工作，其中引物組合(2.0μl×10pmol/μl、2.0μl×10pmol/μl)、(1.5μl×10pmol/μl、1.5μl×10pmol/μl)擴增效率高于引物組合(2.5μl×10pmol/μl、2.5μl×10pmol/μl)的擴增效率，這三組引物組合的擴增效率又明顯高于其他幾組的擴增效率，因此將上游引物量1.5-2.0μl×10pmol/μl、下游引物量1.5-2.0μl×10pmol/μl作為引物用量進行第二次篩選。表2實時熒光定量pcr引物用量的第一次優(yōu)化結果注：表格中注明值為ct值，“1.0,1.5,2.0,2.5”為25μlpcr體系中引物(濃度為10pmol/μl)的用量(μl)。2、熒光定量pcr引物用量的第二次優(yōu)化為測試不同引物用量組合對于試劑靈敏度的影響，選用濃度更低的dna模板進行測試。使用陽性對照提取的dna(實施例l中擴增得到)進行梯度稀釋取l3(8000×)、l4(160000×)，l5(3200000×)作為第二次引物量優(yōu)化的模板，對各組引物在第一次優(yōu)化基礎上進一步進行優(yōu)化。pcr反應體系為：上下游引物量見表3，樣品(模板)dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)。結果如表3所示，本次優(yōu)化上游引物在2.0μl，下游引物在2.0μl時pcr擴增效率最高，選擇此體積為本發(fā)明實時熒光定量pcr引物的使用體積。表3實時熒光定量pcr引物用量的第二次優(yōu)化結果注：表格中注明值為ct值，“1.5,2.0”為25μlpcr體系中引物(濃度為10pmol/μl)的用量(μl)?；谝陨蟽?yōu)化結果，本發(fā)明黃顙四錨蟲實時熒光定量pcr檢測試劑的基本組成和各組分含量基本如表4所示。表4黃顙四錨蟲實時熒光定量pcr檢測試劑的基本組成和各組分含量組份規(guī)格用量實時熒光定量pcr反應緩沖液2×12.5μldna模板5μl引物用量10pmol/μl上游2.0μl，下游2.0μltaqdna聚合酶5u0.6μl無菌水補充至25μl實施例3標準曲線的建立1、陽性對照質粒熒光定量pcr檢測將陽性對照質粒dna作為模板進行熒光定量pcr檢測，建立標準曲線。具體操作如下：將質粒dna進行20倍系列稀釋成1：3.0×1010拷貝/μl；2：1.5×109拷貝/μl；3：7.5×107拷貝/μl；4：3.75×106拷貝/μl；5：1.88×105拷貝/μl；6：9.38x103拷貝/μl。每個稀釋度重復平行試驗3次。標準品檢測pcr反應體系為：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，質粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)。標準品實時熒光定量pcr擴增曲線如圖3所示(圖3，橫坐標為ct值，縱坐標為熒光值，1：3.0×1010拷貝/μl；2：1.5×109拷貝/μl；3：7.5×107拷貝/μl；4：3.75×106拷貝/μl；5：1.88×105拷貝/μl；6：9.38x103拷貝/μl)2、標準曲線的繪制根據(jù)所得ct值與其對應的標準品的對數(shù)值繪制標準曲線，實時熒光定量pcr檢測陽性對照的線性范圍是3×1010～1×104拷貝/μl反應體系，標準曲線的相關系數(shù)r平方值為0.9989(y＝-3.2813x+44.668)，熒光定量pcr反應的擴增效率為101.72％。標準曲線顯示：本發(fā)明建立的黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因實時熒光定量pcr檢測方法有至少6個數(shù)量級的線性檢測范圍，進一步說明該檢測方法具有非常高的靈敏度。實施例4黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒包括各自獨立包裝的反應液1ml/管和taq聚合酶(5u，每個反應0.6μl)30μl/管，兩試劑管再共同組裝在一外包裝盒中。其中，反應液為2×buffer(每12.5μl用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)。實施例2確定的組合2.0μl上游引物、2.0μl下游引物和2.9μl的無菌水按比例混合，配制時將每一組分乘以一個系數(shù)(如10000，根據(jù)生產(chǎn)量定)，混勻后，分裝，每支1ml為方便檢測。試劑盒還包括另外各自獨立包裝的強陽性對照7.5×107拷貝/μl(400×稀釋度的陽性對照l2)、臨界陽性對照469拷貝/μl(64000000×稀釋度的陽性對照品l6)、dna提取液((用于提取待測魚鰓或水體內(nèi)的dna)(配方為：chelex-100)及陰性對照品(無菌水)，并與反應液和taq聚合酶試劑管共同組裝在外包裝盒中。pcr反應體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，樣品dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)。分別取5μl陽性對照l2、l6于pcr反應體系中反應，反應體系包括：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)。結果(如表5所示)表明，經(jīng)過5次重復測定結果比較穩(wěn)定，確定為本發(fā)明試劑盒的陽性對照。表5陽性對照的測試結果重復12345l218.818.518.718.518.9l636.136.536.436.836.3實施例5黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒的性能評估為對本發(fā)明試劑盒的性能進行評估，按照產(chǎn)品優(yōu)化后的工藝多次配制出產(chǎn)品小樣對試劑盒的靈敏度、特異性、精確度以及穩(wěn)定性，用試生產(chǎn)的產(chǎn)品進行臨床試驗，以考查產(chǎn)品的性能。1、試劑盒檢測的線性范圍和靈敏度測試將黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因人工構建質粒pblue-18s-ii用depc水稀釋液進行20倍系列梯度稀釋至1280000000×，即靈敏度質控品(取l1(20×稀釋度)、l2(400×稀釋度)、l3(8000×稀釋度)、l4(160000×稀釋度)、l5(3200000×稀釋度)、l6(64000000×稀釋度)、l7(1280000000×稀釋度)作為評價試劑盒靈敏度的質控品，編號l1-l7，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。使用本發(fā)明試劑盒進行檢測。pcr反應體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照質粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)。結果(如表6所示)顯示，在l6(64000000×稀釋度)時試劑盒多數(shù)情況下可檢出，對不同批次的產(chǎn)品小樣進行靈敏度及線性分析，結果顯示引物均可穩(wěn)定測出l6(64000000×稀釋度)的陽性對照質粒dna樣品，對于l7(1280000000×稀釋度)樣品，本發(fā)明試劑盒不能檢出，所以本發(fā)明試劑盒最低可檢出含l6(64000000×稀釋度)的人工構建質粒，具有較高的靈敏度。故設l6(64000000×稀釋度)為最低檢出值。表6本發(fā)明試劑盒線性范圍的測試結果稀釋梯度l1l2l3l4l5l6l7ct值14.8319.1522.6927.1431.7236.03noct2、試劑盒檢測的特異性分析采用不同批次的產(chǎn)品小樣對六種主要魚類寄生蟲(n1：黃顙華指環(huán)蟲，n2：黃顙偽錨盤蟲，n3：月斧偽錨盤蟲，n4：河鱸錨首蟲，n5：東方車輪蟲，n6：鯉斜管蟲)進行檢測。pcr反應體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，寄生蟲樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進口實時熒光pcr緩沖液的12.5μl；12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer，2μl的10mmdntp、10000×sybrgreeni0.0025μl以及8μldepc水的混合物配制而成。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)。結果(表7)n1-n6均未檢出ct值，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的特異性。表7本發(fā)明試劑盒特異性的測試結果樣品n1n2n3n4n5n6ct值noctnoctnoctnoctnoctnoct3、試劑盒批內(nèi)檢測的精密性使用精密性質控品(將人工構建的pblue-18s-ii質粒稀釋至8000×作為精密性質控品用于對陽性對照質粒dna檢測試劑盒的質量控制。對反應體系分別進行10次重復檢測，pcr反應體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照質粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實時熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μl。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個循環(huán)。10個精密度質控品ct值的cv％<10％(如表8所示，cv表示變異系數(shù))，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的精密性。表8本發(fā)明試劑盒的精密度測試結果樣品12345678910cv％ct值22.722.722.622.722.722.622.722.622.822.70.274、試劑盒的準確性測定采用測序方法進行確認本發(fā)明試劑盒的準確性。對擴增產(chǎn)物進行測序，序列與預期結果完全一致，證明本發(fā)明試劑盒的檢測結果是準確的。5、試劑盒的穩(wěn)定性測定5.1試劑盒的穩(wěn)定性產(chǎn)品的穩(wěn)定性取決于各個組成成份的穩(wěn)定性。本發(fā)明中配制實時熒光定量pcr反應液、taqdna聚合酶、陽性對照質粒在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最長保存一周仍未見性能下降。在為臨床試驗準備的產(chǎn)品運輸中，全套產(chǎn)品(包括實時熒光定量pcr反應液、taqdna聚合酶、試劑盒對照品)，在先后經(jīng)歷為期3天的-20℃冷凍、4℃長途運輸、-20℃冷凍、復融等一系列往返過程后，使用質控品檢測，檢測結果未見有顯著差異。表明本發(fā)明試劑盒的各組份相當穩(wěn)定。5.2對照品的穩(wěn)定性對照品的穩(wěn)定性對試驗結果的分析判斷有很大影響，本試劑盒的對照品主要是對反應體系進行質量控制。本試劑盒使用了一份強陽性對照(l2)、一份臨界陽性(l6)和一份陰性對照(h2o)，對其進行凍融檢測。實驗結果如表9所示，結果表明本發(fā)明試劑盒中的對照品也具有良好的穩(wěn)定性。表9陽性對照品的凍融試驗結果實施例6黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測1、提取魚取樣組織的dna采集了3份患病及7份健康魚樣品，使用chelex-100(bio-rad)煮沸法快速提取dna。方法如下：取一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸。充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板，用建立的常規(guī)pcr檢測體系進行檢測。剩余的模板于-20℃保存以備復檢。2、用實施例1、2中建立的方法檢測魚dna樣本檢測pcr反應體系為：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，魚dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進口實時熒光pcr緩沖液的12.5μl；12.5μl的2×進口實時熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer，2μl的10mmdntp、10000×sybrgreeni0.0025μl以及8μldepc水的混合物配制而成。pcr反應條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個循環(huán)。標準品實時熒光定量pcr擴增曲線如圖4所示(圖中橫坐標為ct值，縱坐標為熒光值)，圖中的橫線為熒光閾值，當每個樣品pcr反應管內(nèi)熒光信號達到此閾值時，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為該樣品的ct值。各樣本的ct值與該樣本的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。強陽性對照的ct值為19.15，說明實驗操作正確。10份樣本的熒光定量實驗結果顯示，只有3份患病魚樣本熒光信號達到閾值，ct分別為14.9,15.1,15.1，低于臨界對照(36.03)；而剩下7份健康魚樣本的熒光信號未達到閾值，因此無對應的ct值(結果顯示為na)。sequencelisting<110>揚州宏盛水產(chǎn)科技有限公司<120>一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物、熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法<130>2017<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ctggtcatggctctgctgac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cgttaaaggagcatcagctg20<210>3<211>131<212>dna<213>人工序列<400>3ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcata60gcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatg120ctcctttaacg131<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4caaatcaaacgcttcggcgtg21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5tccccgttacccgtcataatc21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6acctccatgtcgttaccttg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7accaggcaaatcatgctcac20當前第1頁12