本發(fā)明屬于熒光檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測半胱氨酸的熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術：

半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中唯一具有還原性基團巰基(-sh)的氨基酸。醫(yī)學研究表明半胱胺酸與很多疾病有關，比如腎功能衰竭、老年癡呆癥等，它們在生物體內(nèi)的含量變化可以作為這些疾病診斷的依據(jù)，因此開發(fā)選擇性地檢測半胱氨酸的檢測方法尤其重要。

目前測定氨基酸含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循環(huán)法、毛細管電泳法和hplc法等，這些方法各有優(yōu)點，但也都有不足之處。

比色法是以生成有色化合物的顯色反應為基礎的，一般包括兩個步驟：首先是選擇適當?shù)娘@色試劑與待測組分反應，形成有色化合物，然后再比較或測量有色化合物的顏色深度，在此過程中，溶液的酸度、顯色劑的用量、溫度、溶劑等對顯色反應都有影響，測量的靈敏度和準確度較差；

碘量法是氧化還原滴定法中，應用比較廣泛的一種方法，但對樣品溶液的酸度和溫度反應敏感，不易操作；

酶循環(huán)法是利用酶的底物特異性來放大被測物質(zhì)的測定方法，但使用的工具酶用量大，成本較高；

毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，毛細管直徑小，使光路太短，靈敏度較低，而且電滲會因樣品組成而變化，進而影響分離的重現(xiàn)性，這些弊端都會導致疾病診斷的誤差；

hplc法準確性高，樣品處理簡單，但受色譜柱局限，且耗費時間很長。

而熒光探針檢測法以無損、可視化原位檢測等優(yōu)點備受研究者重視，但是能夠與半胱氨酸特異性響應的熒光探針尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種用于檢測半胱氨酸的熒光探針及其制備方法和應用。

本發(fā)明采用如下技術方案：

一種用于檢測半胱氨酸的熒光探針，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

上述用于檢測半胱氨酸的熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺反應得到化合物1，其結(jié)構(gòu)式如下：

(2)以銅鹽作催化劑，將步驟(1)所得化合物1與甲醇鈉反應得到化合物2，其結(jié)構(gòu)式如下：

(3)將步驟(2)所得化合物2與濃hbr反應得到化合物3，其結(jié)構(gòu)式如下：

(4)將步驟(3)所得化合物3與六次甲基四胺和多聚甲醛反應得到化合物4，其結(jié)構(gòu)式如下：

(5)將化合物4與tcf和乙酸銨反應得到化合物5，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，tcf(2-(2-cyano-3,4,4-trimethylcyclopent-2-en-1-ylidene)malononitrile)的結(jié)構(gòu)式如下：

tcf的具體合成方法如下：將1g乙醇鈉溶解在10-15ml無水乙醇中，室溫下加入9g3-羥基-3-甲基-2丁酮(市售購得)與12g丙二腈，攪拌1-2h后，加入30ml無水乙醇，加熱回流反應1-3h，冷卻后，置于冰箱中冷凍過夜，抽濾得固體，2-5ml冰乙醇洗滌后，干燥得到灰白色固體10-13g，即為tcf，不經(jīng)純化可直接用于下一步反應。

(6)將化合物5與丙烯酰氯反應即得所述熒光探針。

優(yōu)選地，所述步驟(1)的具體合成方法如下：將摩爾比為1：6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺加入到乙醇中，氮氣保護下回流反應至反應液澄清，濃縮后冷卻析出晶體，乙醇重結(jié)晶后即得所述化合物1。

優(yōu)選地，所述步驟(2)的具體合成方法如下：取步驟(1)所得化合物1溶于甲醇中，然后加入甲醇鈉和硫酸銅，回流反應11-15h后，濃縮后冷卻析出晶體，去離子水洗滌后即得化合物2；

化合物1與甲醇鈉的摩爾比為1：8-12。

優(yōu)選地，所述步驟(3)的具體合成方法如下：將步驟(2)所得化合物2約1.0-2.0g加入到20-40ml濃hbr中，回流反應12-24h后，冷卻后過濾，乙醚洗滌后即得化合物3。

優(yōu)選地，所述步驟(4)的具體合成方法如下：將步驟(3)所得化合物3、六次甲基四胺和多聚甲醛加入到乙酸中，回流反應1-3h后，降溫至80-90℃并加入過量濃鹽酸繼續(xù)反應35-40min，冷卻，去離子水稀釋，過濾取濾液，二氯甲烷萃取得粗產(chǎn)品，所得粗產(chǎn)品利用柱色譜分離，得到所述化合物4；

化合物3與六次甲基四胺的摩爾比為1：1-1.5；六次甲基四胺和多聚甲醛的質(zhì)量比為1：1-1.5。

優(yōu)選地，所述步驟(5)的具體合成方法如下：將步驟(4)所得化合物4、tcf和乙酸銨加入混合溶劑中，避光攪拌反應22-24h，反應結(jié)束后將反應液旋蒸，然后柱色譜分離得到所述化合物5；

化合物4、tcf和乙酸銨的摩爾比為1：1-5.1：1-1.2；

所述混合溶劑為體積比為4：1的四氫呋喃和乙醇。

優(yōu)選地，所述步驟(6)的具體合成方法如下：將步驟(5)所得化合物5和丙烯酰氯加入到乙腈中，避光攪拌反應2-3h，反應結(jié)束后將反應液旋蒸，然后柱色譜分離得到所述熒光探針；

化合物5和丙烯酰氯摩爾比為1：1-1.5。

上述用于檢測半胱氨酸的熒光探針的應用，用于待測樣品中半胱氨酸含量的熒光檢測、目視定性檢測和細胞成像檢測，其中細胞成像檢測的具體操作過程為本領域所公知，本發(fā)明不再贅述。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明以新型萘酰亞胺染料，設計并合成了萘酰亞胺-丙烯酸酯熒光探針，在乙醇體系中，所述熒光探針整體分子呈淡黃色、弱黃色的熒光，隨著體系中特定分析物半胱氨酸濃度的不斷增加，誘導丙烯酸酯與半胱氨酸反應，使丙烯酸酯和半胱氨酸成環(huán)，熒光探針釋放出萘酰亞胺染料分子單體，熒光強度顯著增強并伴隨明顯的顏色變化，選取的干擾離子等對檢測效果幾乎無影響，因而實現(xiàn)了對半胱氨酸的特異性識別響應，而且直接肉眼觀察就能判斷半胱氨酸的存在與否，在生物分子檢測領域具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述熒光探針的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明所述熒光探針的核磁氫譜圖；

圖3為本發(fā)明所述熒光探針的核磁碳譜圖；

圖4為本發(fā)明所述熒光探針的質(zhì)譜圖；

圖5為本發(fā)明所述熒光探針與10當量的半胱氨酸隨反應時間的增加熒光光譜的變化結(jié)果；

圖5中的點狀圖為669nm處熒光強度隨反應時間增加的變化情況(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

圖6為本發(fā)明所述熒光探針與不同當量的半胱氨酸反應后的熒光光譜的變化結(jié)果；點狀圖為669nm處熒光強度隨半胱氨酸加入當量的變化情況(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

圖7為本發(fā)明所述熒光探針與不同氨基酸及離子反應后的熒光光譜的變化結(jié)果(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

圖8為本發(fā)明所述熒光探針與不同氨基酸及離子反應后669nm處的熒光強度的柱狀圖結(jié)果(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

圖8中：1：空白對照、2：半胱氨酸cys、3：谷胱甘肽gsh、4：ch3coo^-、5：脯氨酸、6：i^-、7：no2^-、8：f^-、9：co3^2-、10：hco3^-、11：纈氨酸、12：so3^2-、13:hso3^-、14：br^-、15：cl^-、16：亮氨酸、17：同型半胱氨酸hcy；

圖9為本發(fā)明所述熒光探針與半胱氨酸反應前后的溶液在日光燈下的顏色變化；

圖10為本發(fā)明所述熒光探針與半胱氨酸反應前后的溶液在紫外燈下的顏色變化。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的技術目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術方案作出進一步的說明。

實施例1

一種用于檢測半胱氨酸的熒光探針，其合成路線圖如下：

具體制備方法包括以下步驟：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺反應得到化合物1，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述步驟(1)的具體合成方法如下：將摩爾比為1：6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺加入到乙醇中，氮氣保護下回流反應至反應液澄清，濃縮后冷卻析出晶體，乙醇重結(jié)晶后即得所述化合物1。

(2)以硫酸銅作催化劑，將步驟(1)所得化合物1與甲醇鈉反應得到化合物2，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述步驟(2)的具體合成方法如下：取步驟(1)所得化合物1溶于甲醇中，然后依次加入甲醇鈉和硫酸銅，回流反應11-15h后，濃縮后冷卻析出晶體，去離子水洗滌后即得化合物2；

化合物1與甲醇鈉的摩爾比為1：8-12。

(3)將步驟(2)所得化合物2與濃hbr反應得到化合物3，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述步驟(3)的具體合成方法如下：將步驟(2)所得化合物2(1.5g)加入到30ml濃hbr(質(zhì)量分數(shù)為40％)中，回流反應約10-24h(此時tlc監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，化合物2已反應完全)，冷卻過濾，乙醚洗滌后即得化合物3。

(4)將步驟(3)所得化合物3與六次甲基四胺和多聚甲醛反應得到化合物4，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述步驟(4)的具體合成方法如下：取化合物3200.4mg(0.744mmol)、六次甲基四胺(通用名為烏洛托品)104.3mg(0.744mmol)、多聚甲醛104.3mg于50ml圓底燒瓶中，加入過量乙酸(15ml左右)回流1h，降溫至85℃，加入過量濃鹽酸(質(zhì)量分數(shù)為37.5％，15ml左右)反應35min；將反應液冷卻到室溫，加入去離子水稀釋，過濾取濾液，用二氯甲烷萃取得粗產(chǎn)品，然后用硅膠柱進行分離得到化合物4，硅膠顆粒大小為200-300目，柱分離洗脫劑配比為石油醚：乙酸乙酯＝3：1，產(chǎn)率：80.69％；

(5)將化合物4與tcf和乙酸銨反應得到化合物5，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述步驟(5)的具體合成方法如下：取化合物4(260mg,0.8745mmol)、tcf(191.4mg，0.9620mmol)、乙酸銨(80.3mg,1.0417mmol)于50ml圓底燒瓶中，加入體積比為4：1的四氫呋喃和乙醇的混合溶劑15ml使其溶解，避光攪拌反應24小時，反應結(jié)束后將反應液旋蒸，并用二氯甲烷：甲醇(20：1)的洗脫劑(洗脫劑也可選用純二氯甲烷)進行柱色譜提純，得到化合物5，所述硅膠顆粒大小為200-300目，產(chǎn)率：61.6％；

(6)將化合物5與丙烯酰氯反應即得所述熒光探針。

所述步驟(6)的具體合成方法如下：取化合物5(41.3mg,0.086mmol)、丙烯酰氯(8μl，0.094mmol)于50ml圓底燒瓶中，加入乙腈(5ml)使其溶解，避光攪拌反應3小時，反應結(jié)束后將反應液旋蒸，并用二氯甲烷：甲醇(200：1)的洗脫劑(洗脫劑也可選用純二氯甲烷)進行柱色譜提純得到目標化合物熒光探針，所述硅膠顆粒大小為200-300目，產(chǎn)率：53.25％；

根據(jù)圖2至圖4的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果，其中碳譜數(shù)據(jù)為：¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ175.10,172.44,163.53,163.30,163.08,151.51,138.78,136.46,133.30,130.26,128.79,128.75,127.73,126.11,125.83,125.00,123.37,121.78,117.41,111.29,110.51,99.97,98.20,40.54,30.18,25.78,20.34,13.83，綜合上述數(shù)據(jù)可以判斷，得到了預期結(jié)構(gòu)的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

熒光檢測應用試驗

(1)試劑準備

a.熒光探針溶液(1.00×10^-3mol·l^-1)的配制：

取實施例1所制備的本發(fā)明所述熒光探針溶于二甲基亞砜中，配制成濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的熒光探針溶液；

b.各種氨基酸及陰離子的標準溶液的配制

各種氨基酸及陰離子的標準品均用去離子水配置成為濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的標準溶液，此外半胱氨酸再配制一份濃度為1.00×10^-2mol·l^-1的標準溶液；

從步驟a所配制的熒光探針溶液中取出30μl加入到比色皿中，再加入濃度為1.00×10^-2mol·l^-1的半胱氨酸(簡稱為cys)標準溶液，用乙醇稀釋至3ml，然后每隔1min測量其熒光性質(zhì)一次，直到其熒光強度不再增強為止(ex＝615nm，em＝625-850nm,ex.slit/em.slit＝5/10)，所得熒光光譜如圖5所示，由圖5可見，隨反應時間的增加，熒光強度逐漸增強，說明探針與半胱氨酸作用存在一定的時間效應，為探針其他響應性研究中提供可靠的作用時間。

從步驟a所配制的熒光探針溶液中取出36組30μl且依次加入到36支試管當中，其中1個試管作為空白對照，不再添加任何組分，余下35個試管中再依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.17、2.33、2.5、2.67、3、3.33、3.67、4、4.33、4.67、5、5.33、6、7當量的濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的半胱氨酸(簡稱為cys)標準溶液，然后用乙醇稀釋至3ml，測量其熒光性質(zhì)(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)，熒光光譜如圖6所示，由圖6可見，隨著加入的半胱氨酸cys當量的增加，熒光強度逐漸增強，且在一定范圍內(nèi)，熒光強度與半胱氨酸cys當量存在線性關系，由此可實現(xiàn)一定范圍內(nèi)的定量檢測，具體的定量檢測方法為本領域技術人員所公知，此處不再贅述。

從步驟a所配制的熒光探針溶液中取出17組30μl且分別加入到17個試管當中，其中1個試管作為空白對照，不再添加任何組分，余下16個試管中再依次加入步驟b配制的10當量的濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的以下標準溶液：gsh、hcy、cys、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、f^-、cl^-、br^-、i^-、ch3coo^-、co3^2-、hco3^-、hso3^-、so3^2-、no2^-，然后用乙醇稀釋至3ml，120min后檢測溶液的熒光發(fā)射光譜(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)，由圖7和圖8可以發(fā)現(xiàn)，其他離子和氨基酸與本發(fā)明所述熒光探針幾乎沒有熒光響應，而半胱氨酸cys溶液與本發(fā)明所述熒光探針存在顯著的熒光響應，說明本發(fā)明所述熒光探針對半胱氨酸的檢測有較高的選擇性，能夠用于半胱氨酸的檢測。

從步驟a所配制的熒光探針溶液中取出30μl加入到試管當中，再向試管中加入濃度為1.00×10^-2mol·l^-1的半胱氨酸標準溶液，然后用乙醇稀釋至3ml，如圖9所示，日光燈下，肉眼可見，半胱氨酸可以使熒光探針的乙醇溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從淡黃色變成藍色，再如圖10所示，紫外燈下，肉眼可視，半胱氨酸誘導熒光探針發(fā)出紅色熒光，說明本發(fā)明所述熒光探針是一種具有生色傳感功能的熒光探針，可用于半胱氨酸的目視定性檢測，極大地方便了半胱氨酸的快速定性檢測。

最后所應說明的是：上述實施例僅用于說明而非限制本發(fā)明的技術方案，任何對本發(fā)明進行的等同替換及不脫離本發(fā)明精神和范圍的修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明權利要求保護的范圍之內(nèi)。