專利名稱：一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
近十多年的研究證實,血液中高濃度的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY)是冠狀動脈疾病、腦血管及外周血管疾病的獨立危險因素。HCY是由蛋氨酸去甲基生成的一種含硫氨基酸，它在體內(nèi)主要通過再甲基化、轉(zhuǎn)硫作用兩種途徑進行代謝其一，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以維生素B12為輔酶，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，HCY被甲基化生成蛋氨酸。此過程的關(guān)鍵酶是以維生素B2為輔酶的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，該酶使N5，NlO-亞甲基四氫葉酸還原為N5-甲基四氫葉酸，其作用非常重要；其二，HCY與絲氨·酸結(jié)合，在胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化作用下，以維生素Β6為輔酶，生成胱硫醚，后者再裂解為半胱氨酸和α -酮丁酸，參與代謝，形成轉(zhuǎn)硫化途徑。當上述代謝途徑受阻時，HCY在細胞內(nèi)蓄積，并進入血液循環(huán)，引起慢性病理損害。參與HCY代謝的酶(如MTHFR和CBS)如有遺傳缺陷可導(dǎo)致嚴重的高HCY血癥，而由于營養(yǎng)因素導(dǎo)致的維生素B6、B12和葉酸的缺乏同樣可產(chǎn)生高HCY血癥。除遺傳、營養(yǎng)因素外，年齡、種族、生活習慣(如吸煙、飲酒、高蛋氨酸食物等)、藥物和某些疾病因素等也可以不同程度地影響血漿HCY水平。血漿中約75%的HCY與白蛋白結(jié)合，形成結(jié)合型HCY，其余的則主要以二硫鍵結(jié)合的HCY-HCY、HCY-半胱氨酸化合物形式存在，游離型只有I 2%以還原型HCY存在于血漿中。通常測定的是血漿中所有形式HCY總和，即總HCY(total Homocysteine, tHCY)。一般認為，血漿tHCY正常值參考范圍為5 151111101/1(高效液相色譜法)，當血楽· tHCY ^ 15 μ mol/L 時，即為高 HCY 血癥(Hyperhomocysteinemia, HHcy);當血衆(zhòng)tHcyMOymol/L時即超出腎閾值，可出現(xiàn)同型半胱氨酸尿，這種情況主要見于遺傳病。研究發(fā)現(xiàn)，男性血漿tHCY濃度介于9. O 14. 9 μ mol/L者，其患冠心病的危險性是低于9. O μ mol/L者的2倍，而高于14. 9 μ mol/L者，其危險性則增加6倍，因此，1995年建議理想的血衆(zhòng)tHcy濃度應(yīng)低于10 μ mol/L2006年，美國高血壓協(xié)會(ASH)和腦卒中協(xié)會(ASA)發(fā)布了對于缺血性腦卒中和短暫腦缺血發(fā)作患者的卒中預(yù)防指南。在該指南里，高Hcy血癥被列為腦卒中的重要風險因子之一，并定義Hcy>10 μ mol/L即為高Hcy血癥，建議給予患者補充維生素B6、B12和葉酸。目前Hcy檢測方法有(I)同位素法通過14C標記的腺苷與tHcy縮合后，經(jīng)色譜分離，液體閃爍計數(shù)放射強度來測定tHcy濃度。該法靈敏度高、特異性強，但由于操作繁瑣且有放射污染，雖經(jīng)改良也未能推廣使用。(2)高效液相色譜法(HPLC)是目前比較成熟且可推廣使用的方法，方法學包括柱前衍生-HPLC-熒光檢測法，HPLC-柱后衍生-紫外檢測法或熒光檢測法和HPLC-電化學檢測法。目前已有tHcy全自動的HPLC-熒光檢測儀問世。但是操作較為復(fù)雜，不適用大樣本快速分析。(3)熒光偏振免疫檢測(FPLA)法，該方法靈敏度高，檢測速度快，但價格昂貴，故短時期內(nèi)不易普及。檢測時，首先用二巰基蘇糖醇將結(jié)合型HCY還原出來，然后通過特異性的S腺苷HCY合成酶催化HCY轉(zhuǎn)變?yōu)镾腺苷HCY，與作為示蹤物的熒光素標記S腺苷HCY類似物一起與特異性單克隆抗體競爭性結(jié)合，引起示蹤物偏光性改變，從而檢測出HCY濃度。(4)酶免疫測定法，這種方法也需要將HCY先轉(zhuǎn)化為S腺苷Hcy，然后加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，最后加入辣根過氧化物酶的底物，并在450nm處檢測。加入蛋氨酸與半胱氨酸對檢測結(jié)果均無影響，無交叉反應(yīng)。這種方法的檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)達O. 986。(5)循環(huán)酶法是近年發(fā)展起來、可用于自動生化分析儀的一種技術(shù)，它使tHCY檢測更加快速、方便。其原理是結(jié)合的HCY (氧化形式)被還原成游離的HCY，在胱硫醚-β -合成酶的催化下和絲氨酸反應(yīng)生成L-胱硫醚，后者被胱硫醚-β -裂解酶分解成HCY和丙酮酸，丙酮酸參與NADH顯色反應(yīng)，生成的HCY再次參與第一步反應(yīng)，如此循環(huán)。該方法與HPLC法相關(guān)性良好，無需樣本預(yù)處理，目前正被國內(nèi)外廣泛采用。但是顯色反應(yīng)，易受血液一些成分的干擾。本發(fā)明中應(yīng)用的酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y -裂解酶(Methionine gamma-lyase),同通過 基因改造，構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，經(jīng)純化制備而成，對HCY具有特異性，取名HCY特異性轉(zhuǎn)化酶(rHCYase)，經(jīng)色譜純化技術(shù)，制備了高純度的rHCYase，rHCYase穩(wěn)定性好，活性高，可用于HCY的檢測分析，反應(yīng)簡單，檢測試劑穩(wěn)定，適用于臨床HCY的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。本發(fā)明方法的HCY檢測其原理是利用HCY特異性轉(zhuǎn)化酶(rHCYase)分解血中的HCY產(chǎn)生H2S,生產(chǎn)的H2S與試劑二甲基對苯胺反應(yīng)生產(chǎn)甲基藍，通過檢測甲基藍生成量反應(yīng)血液中HCY的含量,如式(I)所示。
COOH
ICOCH
H2N-CHrHCYaseI-,
士H 十 H2Oγ=。 4* H2S + NH3
I,2CH2
CH2I
ICH^
SH“
TT,|)...........................III II
顧 +圓—、人
MICl—I式(I)一種血液中同型半胱氨酸的檢測方法，包括以下步驟(I)準備工作將HCY標準品用緩沖液溶解分別配置濃度為50 μ mol/L、25 μ mol/L、10 μ mol/L、5 μ mol/L、2· 5 μ mol/L,O μ mol/L 的 HCY 溶液，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制；將還原劑用緩沖液溶解配制成濃度為I μ mol/L還原劑工作液^fHCY特異性轉(zhuǎn)化酶用緩沖液配制成濃度為O. 4-0. 6mg/ml的HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作液；(2)檢測在96孔板中分別加入HCY標準品和樣品，加入還原劑工作液還原Ih ；加入HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作液反應(yīng)5min ;加入顯色液A，反應(yīng)5min ;加入顯色液B，反應(yīng)IOmin ；(3)標準曲線制備根據(jù)標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量；或根據(jù)標準品濃度溶液在激發(fā)波長615nm，發(fā)射波長685nm的熒光強度制備標準曲線，計算樣品中HCY含量。所述HCY特異性轉(zhuǎn)化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸Y-裂解酶。所述還原劑為二硫蘇糖醇。所述緩沖液為250mM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為8. 3，其中含磷酸吡多醛的濃度為 IOuM, Triton X-100的濃度為O. 05wt%，三羧乙基膦(TCEP)的濃度為ImM。所述顯色液A為濃度為I. 5M的H2SO4溶液，其中含二甲基對苯胺濃度為20mM。所述顯色液B為20mM磷酸緩沖液，其中含鐵氰化鉀濃度為5mM。根據(jù)上述檢測方法制備的血液同型半胱氨酸的檢測試劑盒，此試劑盒包括盒體以及在盒體內(nèi)的96孔板、HCY標準品、HCY特異性轉(zhuǎn)化酶、還原劑、緩沖液、顯色液A和顯色液B0上述的檢測試劑盒中，所述HCY特異性轉(zhuǎn)化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)的甲硫氨酸Y _裂解酶，所述還原劑為二硫蘇糖醇，所述緩沖液為250mM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為8. 3，其中含磷酸吡多醛的濃度為10uM，Triton X-100的濃度為0. 05wt%,三羧乙基膦(TCEP)的濃度為1禮，所述顯色液A為濃度為I. 5M的H2SO4溶液，其中含二甲基對苯胺濃度為20mM，所述顯色液B為20mM磷酸緩沖液，其中含鐵氰化鉀濃度為5mM。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的方法測試血液中HCY的含量，操作簡單，試劑穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，方法靈敏，其試劑盒適用于實驗室和臨床快速檢測HCY。


圖I為HCY檢測的顯色圖。圖2為HCY測定的吸收光譜和發(fā)射光譜圖。圖3為測定的熒光強度-HCY濃度的標準曲線。圖4為rHCYase的純化電泳鑒定圖；1為未經(jīng)純化的粗酶，2、4為經(jīng)DEAE離子交換層析純化后的蛋白，3、5為phenyl疏水層析純化后的蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例IHCY在重組的rHCYase催化下生成H2S, H2S與二甲基對苯胺在F3+氧化下反應(yīng)生成藍色甲基藍，藍色的深淺與HCY的濃度成正比，顏色越深，HCY濃度越高，由此原理制備試劑盒，如圖I所示，為HCY檢測的顯色圖，在孔板中加入濃度為O、10、15、20、25 μ M HCY和半胱氨酸，按顯色檢測方法進行檢測，上排半胱氨酸無顯色，下排顯色，隨著HCY濃度的升高，顯色越深，吸光度與HCY濃度成正比。熒光檢測法試劑盒組成一塊96孔黑板，HCY標準品27. 03 μ g，HCY特異性轉(zhuǎn)化酶3mg，稀釋液50ml,還原劑O. 771 μ g,顯色液AlOml,顯色液BlOml。操作步驟1)HCY標準品用稀釋液稀釋至1ml，其濃度為200 μ mol/L，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成 100 μ mol/L, 50 μ mol/L, 25 μ mol/L, 10 μ mol/L, 5 μ mol/L, 2. 5 μ mol/L, 0 μ mol/L，稀釋液直接作為標準濃度O μ mol/L,臨用前15分鐘內(nèi)配制。將還原劑用5ml稀釋液溶解配制成還原劑工作液。將HCY特異性轉(zhuǎn)化酶用5ml稀釋液配制成將HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作 液。2)在96孔黑板分別加入HCY標準品和樣品100 μ 1，加入還原劑工作液10 μ I還原Ih ；3)加入HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作液20 μ I反應(yīng)5min ；4)加入顯色液A50 μ I,反應(yīng)5min ；5)加入顯色液B30 μ I,反應(yīng)IOmin ；6)在激發(fā)波長為615nm，發(fā)射波長為685nm下測定熒光強度，根據(jù)熒光強度與標準品濃度制備標準曲線，如圖3所示，計算樣品中HCY含量。如圖2所示，在固定發(fā)射波長685nm，對吸收波長進行掃描，發(fā)現(xiàn)在615、685，745nm處有吸收峰，固定激發(fā)波長615nm，對發(fā)射波長進行掃描，發(fā)現(xiàn)只在685nm處有最大發(fā)生峰，所以突光檢測波長定為激發(fā)波長為615nm,發(fā)射波長為685nm。實施例2比色檢測法試劑盒組成一塊96孔透明酶標板，HCY標準品27. 03 μ g，HCY特異性轉(zhuǎn)化酶2mg,稀釋液50ml,還原劑0. 771 μ g,顯色液AlOml,顯色液BlOml。操作步驟I)將HCY標準品用稀釋液配制成Iml的溶液，其濃度為200 μ mol/L,做系列倍比稀釋后，分別稀釋成 100 μ mol/L, 50 μ mol/L, 25 μ mol/L, 10 μ mol/L, 5 μ mol/L, 2. 5 μ mol/L，0 μ mol//L，稀釋液直接作為標準濃度0 μ mol//L,臨用前15分鐘內(nèi)配制。將還原劑用5ml稀釋液溶解。2)在96孔透明酶標板分別加入HCY標準品和樣品100 μ 1，然后分別加入還原劑10 μ I 還原 Ih ；3)將HCY特異性轉(zhuǎn)化酶用5ml稀釋液溶解，然后加入HCY特異性轉(zhuǎn)化酶溶液20 μ I到上述反應(yīng)液中反應(yīng)5min ；4)加入顯色液A50 μ I,反應(yīng)5min ；5)加入顯色液B30 μ I,反應(yīng)IOmin ；6)根據(jù)標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量。實施例3用本發(fā)明的檢測方法測定血清樣品的HCY，并用其結(jié)果與高效液相色譜法(HPLC)測定結(jié)果進行比較。
選用HPLC方法測定過的血清樣品10份，用本發(fā)明的方法進行測定，測定結(jié)果與HPLC方法測定結(jié)果進行比較，結(jié)果如表I所示，計算符合率為O. 9998。表明本方法結(jié)果可
O表I測定結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種血液同型半胱氨酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)準備工作將HCY標準品用緩沖液溶解分別配置濃度為50μπιΟ1/1、25μπιΟ1/1、10 μ mol/L,5 μ mol/L,2. 5 μ mol/L,0 μ mol/L的HCY溶液，臨用前15分鐘內(nèi)配制；將還原劑用緩沖液溶解配制成濃度為I μ mol/L還原劑工作液^fHCY特異性轉(zhuǎn)化酶用緩沖液配制成濃度為O. 4-0. 6mg/ml的HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作液； (2)檢測在96孔板中分別加入HCY標準品和樣品，加入還原劑工作液還原Ih;力口入HCY特異性轉(zhuǎn)化酶工作液反應(yīng)5min ;加入顯色液A，反應(yīng)5min ;加入顯色液B，反應(yīng)IOmin ； (3)標準曲線制備根據(jù)標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量；或根據(jù)標準品濃度溶液在激發(fā)波長615nm，發(fā)射波長685nm的熒光強度制備標準曲線，計算樣品中HCY含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述HCY特異性轉(zhuǎn)化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y-裂解酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述還原劑為二硫蘇糖醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述緩沖液為250mM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為8. 3，其中含磷酸吡多醛的濃度為10uM，Triton X-IOO的濃度為0. 05wt%，三羧乙基膦的濃度為ImM。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述顯色液A為濃度為1.5M的H2SO4溶液，其中含二甲基對苯胺濃度為20mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述顯色液B為20mM磷酸緩沖液，其中含鐵氰化鉀濃度為5mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測方法制備的血液同型半胱氨酸檢測試劑盒，其特征在于，此試劑盒包括盒體以及在盒體內(nèi)的96孔板、HCY標準品、HCY特異性轉(zhuǎn)化酶、還原劑、緩沖液、顯色液A和顯色液B。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述HCY特異性轉(zhuǎn)化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸Y -裂解酶,所述還原劑為二硫蘇糖醇,所述緩沖液為250mM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為8. 3，其中含磷酸吡多醛的濃度為10uM，Triton X-100的濃度為0.05wt%，三羧乙基膦的濃度為ImM，所述顯色液A為濃度為I. 5 M的％304溶液，其中含二甲基對苯胺濃度為20mM，所述顯色液B為20mM磷酸緩沖液，其中含鐵氰化鉀濃度為 5mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了生物檢測技術(shù)領(lǐng)域的一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。此試劑盒包括盒體以及在盒體內(nèi)的96孔板、HCY標準品、HCY特異性轉(zhuǎn)化酶、還原劑、緩沖液、顯色液A和顯色液B，此試劑盒利用rHCYase分解血中的HCY產(chǎn)生H2S，生產(chǎn)的H2S與二甲基對苯胺反應(yīng)生產(chǎn)甲基藍，通過甲基藍生成量反應(yīng)血液中HCY的含量。本試劑盒操作簡單，試劑穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，方法靈敏，適用于實驗室和臨床快速檢測HCY。
文檔編號G01N21/64GK102901720SQ201210369578
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者弓景波, 錢令嘉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所