本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物分離純化領域，具體涉及一種快速制備高純度羥基-α-山椒素的方法。

背景技術：

花椒油是直接用食用油浸泡花椒或采用有機溶劑浸提、超臨界co2萃取等方法制得的花椒油樹脂與食用油適量混合所制成的具有麻香味的調(diào)味油。花椒油的加工大大減少了花椒在貯藏和銷售等環(huán)節(jié)中造成有效成分的損失和微生物污染，解決了花椒粒和花椒粉劑給烹飪及食用帶來的不便，因此越來越受消費者青睞。但目前花椒油市場并不規(guī)范，產(chǎn)品標簽大多只標明原料，而作為花椒油重要指標的麻味物質(zhì)含量并沒有出現(xiàn)在標簽上。如何分離出高純度花椒麻味物質(zhì)，以作為花椒及其產(chǎn)品麻味定量的標準品一直是國內(nèi)研究的熱點，也是各花椒生產(chǎn)企業(yè)關注的焦點。

在花椒的應用中，最重要的仍然是它的風味，由多不飽和酰胺引起的強烈的麻味是花椒能成為中國“八大味”之一的重要品質(zhì)指標?；ń分械穆槲妒怯甚０奉愇镔|(zhì)（麻味物質(zhì)）引起的，研究表明這些物質(zhì)包括γ-山椒素、羥基-γ-山椒素、β-山椒素、羥基-β-山椒素、γ-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、花椒素、異花椒素等。山椒素又可分為α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素等，且其中的羥基-α-山椒素和羥基-γ-山椒素的相對含量明顯大于其他的山椒素。這些山椒素在200nm到300nm都有紫外吸收現(xiàn)象，并在270nm處出現(xiàn)了最大吸收峰。

從花椒中提取、分離、純化得到高純度的酰胺類物質(zhì)是一種極其困難的方法。03132341.3公開了一種利用超臨界流體技術分離花椒麻味成分的工藝，該工藝設備操作技術要求較高，且所制備的麻味成分為初步提取物，這類方法需要較強的操作經(jīng)驗，實驗的重復性極差，結果不穩(wěn)定，耗時長，且所制備的麻味成分為初步提取物，只能用于工業(yè)化生產(chǎn)中，作為食品和藥品的原料，不適宜作為麻味定量的標準品。而201210175527.9使用薄層層析法從花椒油中提取高純度羥基山椒素的方法，雖然填補了這方面的空白，但制備過程中仍然使用到液相色譜的色譜柱，制備成本增加。

針對上述問題，本發(fā)明采用恒溫振蕩提取、正己烷萃取以及紫外照射三步法對花椒油中的羥基-α-山椒素進行提取，此外該制備方法不需要特殊的儀器設備，使得制備方法相比于傳統(tǒng)的柱層析法更加簡單、耗時更短、成本低，極大的提高了工作效率。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的技術方案是提供了一種快速制備高純度羥基-α-山椒素的方法。該方法操作簡單，不需要專業(yè)性太強的技術人員進行操作，同時耗費時間明顯縮短，制作過程中無需使用制備型或半制備型高效液相色譜儀，降低了制備成本，且獲得的羥基-α-山椒素的純度高。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：

一種快速制備高純度羥基-α-山椒素的方法，包括以下步驟：

（1）以花椒油作為原料，向花椒油中加入甲醇，然后依次進行震蕩、超聲、離心，獲取上清液；

（2）向上清液中加入正己烷進行萃取，得到下層清液；

（3）對下層清液進行層析、過濾，最終將濾液進行減壓蒸干，獲得粗提取物；

（4）將粗提取物溶于甲醇后，轉移至血清瓶內(nèi)進行紫外燈照射，照射結束后進行減壓蒸干即得羥基-α-山椒素。

進一步的，本發(fā)明所述步驟（1）中花椒油與甲醇的體積比為1:20；所述花椒油為紅花椒油。步驟（1）中采用恒溫震蕩器震蕩，溫度為40℃，震蕩時間為1h，轉速為160rpm。步驟（1）中超聲時間為5min。步驟（1）中離心速度為4000r/min，離心時間為15min。所述上步驟（2）中上清液和正己烷的料液比1：2，萃取次數(shù)3次；所述步驟（2）過濾為0.22μm有機系濾膜過濾。所述步驟（3）減壓蒸干采用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干，干燥條件為真空度0.09mpa，溫度為45℃，干燥時間2h。所述步驟（4）中甲醇為色譜級甲醇，用量20ml。所述紫外燈功率為20~30w，波長為254nm，照射的距離為15~20cm，照射的時間為2~4h。所述步驟（4）減壓蒸干采用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干，干燥條件為真空度0.09mpa，溫度為45℃，干燥時間1h。

本發(fā)明構思為：本發(fā)明首先采用甲醇將花椒油中的山椒素提取出來，提取后進行震蕩、超聲、離心，將油脂及油溶性物質(zhì)除去。采用正己烷重復萃取3次，將花椒中的香味物質(zhì)全部除去，以便獲得高純度的麻味物質(zhì)（山椒素），隨后進行層析、過濾、蒸干得到粗提取物。最終采用甲醇將山椒素溶解，為山椒素提供極性環(huán)境，并經(jīng)紫外光照射后獲得純度大于98%的羥基-α-山椒素，雜質(zhì)與其他同分異構體及其他酰胺類物質(zhì)的含量不足1%。這樣純度的羥基-α-山椒素可用于所有的生理生化實驗以及麻味評價實驗，整個制備方法用時為7~9個小時。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用了恒溫振蕩提取、正己烷萃取以及紫外照射處理三個關鍵步驟，使得制備方法相比于傳統(tǒng)的柱層析法更加簡單、耗時更短，傳統(tǒng)的提取分離純化方法一般耗時24~48小時，且操作復雜，經(jīng)驗性較強，重復性較差，本發(fā)明提供的方法全過程只需要7~9個小時，且操作簡單。而專利號cn201210309645.4中步驟（1）中干燥時間就達0.5~2h，步驟（3）中干燥時間也達2～6h，不僅提示操作步驟更多、更復雜，且花費的時間更長，且對操作人員的要求更高，一旦出現(xiàn)殘留溶劑，則會影響下一步的萃取。

2、由于本發(fā)明采用了紫外照射處理，利用光反應和化學反應使得羥基-α-山椒素的同分異構體羥基-β-山椒素和羥基-ε-山椒素向其（羥基-α-山椒素）發(fā)生轉化，進而提高了羥基-α-山椒素的純度，最終使得目標物質(zhì)（羥基-α-山椒素）的純度達到98%以上。遠遠高于專利號cn201210175527.9所提取出羥基-α-山椒素82.82%的濃度。

3、由于本發(fā)明提供的一種快速制備高純度羥基-α-山椒素的方法不需要特殊的儀器設備，如制備型或半制備型高效液相色譜儀，且操作簡單，耗時短，成本低，因此可以為一般的實驗室和一般操作水平的人員用來制備高純度的羥基-α-山椒素以進行其所需實驗，極大的提高了工作效率。

附圖說明

圖1實施例1制備的物質(zhì)hplc圖譜；

圖2實施例2制備的物質(zhì)hplc圖譜；

圖3實施例3制備的物質(zhì)hplc圖譜。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。該領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容，對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。

實施例1

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機系濾膜，最后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，放入血清瓶中，將其進行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率20w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈15cm，照射時間為2小時，照射結束后用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干1h即得羥基-α-山椒素。

實施例2

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機系濾膜，最后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，放入血清瓶中，將其進行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率30w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈20cm，照射時間為4小時，照射結束后用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干1h即得羥基-α-山椒素。

實施例2

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機系濾膜，最后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，放入血清瓶中，將其進行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率25w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈18cm，照射時間為3小時，照射結束后用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干1h即得羥基-α-山椒素。

測試例1

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機系濾膜，最后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，放入血清瓶中，待反應結束后，用旋轉蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干，蒸干時間1h即可獲得羥基-α-山椒素。

測試例2

將上述制備得到的物質(zhì)進行光譜檢測，采用高效液相色譜法（hplc）進行檢測，檢測條件為色譜柱：mnnucleodur1100-5c18柱(?4×125mm,5μm)；流動相：a水；b乙腈；流速：0.5ml/min；柱溫：25℃；紫外檢測波長：270nm；進樣量：20μl。洗脫程序如表1所示。

表1hplc洗脫程序

根據(jù)hplc分析結果，如圖1所示，實施例1制備得到的物質(zhì)中羥基-α-山椒素的純度為98.07%。如圖2所示，實施例2制備得到的物質(zhì)中羥基-α-山椒素的純度為98.20%。如圖3所示，實施例3制備得到的物質(zhì)中羥基-α-山椒素的純度為98.21%。測試例1制備得到的物質(zhì)中羥基-α-山椒素為72%，羥基-β-山椒素為9%，羥基-ε-山椒素為4%。