本發(fā)明涉及一種三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

pH值是生物體的一個(gè)重要指標(biāo)，特定的pH值在很多生理、病理過(guò)程中起著十分重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的pH在許多生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。酸性或堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)引起細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致心、肺病變或神經(jīng)類(lèi)疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)猩ｋU(xiǎn)。因此監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值的變化可以為研究生理和病理過(guò)程提供重要信息。大部分文獻(xiàn)報(bào)的熒光素類(lèi)pH探針多以羅丹明B為主體，而且此類(lèi)的pH探針?biāo)苄院懿睿@就大大限制了其應(yīng)用范圍。2015年，報(bào)道了一種乙?；溄拥牧_丹明B肼-1-苯基哌嗪pH探針（The Journal of Biological and Chemical Luminescence）的31期的865–870頁(yè)公開(kāi)的文章（Sensitive detection of strong acidic condition by a novel rhodamine-based fluorescent pH chemosensor），此探針的測(cè)試液乙醇與水的體積比為1:1，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)占50%，pH在1.75-2.6的范圍內(nèi)隨著pH值增大，熒光值逐步降低，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2014年,報(bào)道了一種名為碳碳雙鍵鏈接的熒光素肼-3,4二羥基芐基的熒光探針（Dyes and Pigments）的107期的127-132頁(yè)公開(kāi)的文章（A sensitive and selective fluorescence probe based fluorescein for detection of hypochlorous acid and its application for biological imaging）。此探針的測(cè)試液二甲基亞砜與水的體積比為20:1，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)僅占5%。研究發(fā)現(xiàn)此化合物含有四個(gè)羥基，這就大大增加了其水溶性。

2016年，報(bào)道了一類(lèi)苯并咪唑pH探針（Dyes and Pigments）的12期的165-169頁(yè)公開(kāi)的文章（Benzimidazole-BODIPY as optical and fluorometric pH sensor）Stokes'位移僅為15 nm。在pH為3.05-8.09的范圍內(nèi)，隨著pH值得增大熒光值逐漸降低。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的pH熒光探針，多羥基咪唑-熒光素具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、熒光素在結(jié)構(gòu)上含兩個(gè)羥基，若以熒光素為熒光主體，可以提高探針的水溶性。

2、以熒光素為信號(hào)體的分子探針熒光發(fā)射波長(zhǎng)可達(dá)550 nm以上，可以實(shí)現(xiàn)熒光變化的“裸眼”觀測(cè)。如果將熒光素和咪唑有機(jī)結(jié)合起來(lái)不僅可以克服咪唑自身缺點(diǎn)，還可以將大大提高其應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的pH熒光探針?biāo)苄圆?，咪唑?lèi)化合物自身的熒光強(qiáng)度較低，與受體作用后熒光發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有太大變化，Stokes 位移變化較小的問(wèn)題，而提供三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針及其制備方法。

本發(fā)明的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

上述三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應(yīng)器中，再加入20.0~40.0 ml冰乙酸，升溫至80~130℃并攪拌4~12 h后，冷卻至室溫，向反應(yīng)器中加入水，再用堿性溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30~40%氫氧化鈉溶液）調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結(jié)晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

二、中間體化合物的合成：

稱(chēng)取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應(yīng)器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80%的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50~80℃，反應(yīng)5~10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

三、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應(yīng)器中，加入3.0~8.0 ml甲醇溶液，加入40%~60%的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8.0~16.0 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應(yīng)，冷至25~30℃。加入酸性溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~70%醋酸溶液），調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。

四、pH熒光探針的合成：

按照1:1~3物質(zhì)的量比稱(chēng)取中間體化合物和中間體化合物，加入到反應(yīng)器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，25~30℃下攪拌反應(yīng)4~8 h，停止反應(yīng)，加水淬滅，再用堿性溶液調(diào)pH值至6～10，抽濾，水洗濾餅至中性，干燥，乙酸乙酯重結(jié)晶，得到褐色固體，三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針。

步驟一中堿性介質(zhì)可以是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30~40%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~60%的碳酸鈉溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~70%的碳酸氫鈉溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40~55%的碳酸鉀溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48~80%的碳酸氫鉀溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30~40%的氫氧化鉀溶液。三中所述的酸性介質(zhì)可以是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的濃硫酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36~37%的濃鹽酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~70%冰乙酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40~50%磷酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30~60%的甲酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10~30%的酸性離子液體。

本發(fā)明的合成過(guò)程如下式子所示：

中間體化合物I

中間體化合物

中間體化合物

三羥基咪唑-熒光素

本發(fā)明提供了一種具有良好水溶性，在pH值為6.5~8.0的范圍內(nèi)，具有高選擇性、響應(yīng)靈敏的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。該pH熒光探針在pH值為6.5~8.0的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，而且不受K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺和Hg²⁺；I^-、Cl^-、Br^-、CO₃^2-、HCO₃^-、SO₄^2-、NO^2-、AcO^-、H₂PO₄^-、HPO₄^2-、BrO₃^-、NO₃^-、SO₃^2-、HSO₃^2-、F^-、SCN^-等其他離子的干擾，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，用于pH值的檢驗(yàn)，方便穩(wěn)定。

附圖說(shuō)明

圖1是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12) 體系中的紫外光譜圖，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光度。

圖2是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 6.5~7.9)，λ= 488 nm處的吸光度線性關(guān)系圖,橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為吸光度

圖3是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9) 在不同pH下，λ = 488 nm處的吸光度與此波長(zhǎng)下最大吸光度之比A/A_max。當(dāng)A/A_max = 0.5時(shí)，根據(jù)公式pK_a= pH ± lg ((A_max-A)/(A-A_min))，計(jì)算出pK_a= 6.6319或pK_a= 6.9680，橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為A/A_max。

圖4是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)在不同的pH條件下的熒光發(fā)射光譜，橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖5是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH = 6.5~8.0，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在λ=525 nm處的熒光值線性關(guān)系圖，橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖6是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在λ = 525 nm處的熒光強(qiáng)度與此波長(zhǎng)下最大熒光強(qiáng)度之比I/I_max。當(dāng)I/I_max = 0.5時(shí)，根據(jù)公式pK_{a =} pH ± lg((I_max-I)/(I-I_min))，計(jì)算出pK_a= 7.0806或pK_a= 6.9193，橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為I/I_max。

圖7是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在pH = 9.1和pH = 2之間的熒光可逆光譜圖，橫坐標(biāo)為循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖8是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH=9.1，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，陰離子對(duì)三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針干擾的熒光發(fā)射光譜圖，橫坐標(biāo)為陰離子，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖9是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH=2，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，陰離子對(duì)三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針干擾的熒光發(fā)射光譜圖，橫坐標(biāo)為陰離子，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖10是試驗(yàn)1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在pH = 9.1, pH = 7.0 ,pH = 2.0 三個(gè)不同pH條件下的時(shí)間響應(yīng)及時(shí)間穩(wěn)定熒光光譜圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

具體實(shí)施方式二：具體實(shí)施方式二的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應(yīng)器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升溫至80~130℃并攪拌4 ~12 h后，冷卻至室溫，向反應(yīng)器中加入水，再用堿性溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30~40%的氫氧化鈉溶液）調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結(jié)晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

二、中間體化合物的合成：

稱(chēng)取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應(yīng)器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80%的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50 ~80℃，反應(yīng)5 ~ 10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

三、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應(yīng)器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8~16 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應(yīng)，冷至25~30℃。加入酸性溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~70% 醋酸溶液），調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。

四、pH熒光探針的合成：

按照1 : 1的物質(zhì)的量的比稱(chēng)取中間體化合物I和中間體化合物II，加入到反應(yīng)器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5~10％氫氧化鉀溶液調(diào)pH值至7～8，析出固體，然后進(jìn)行抽濾，濾餅并水洗至中性，烘干，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是步驟三中所述的酸性介質(zhì)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的濃硫酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36~37%的濃鹽酸、冰乙酸或甲酸。其它與具體實(shí)施方式二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三不同的是步驟一中的反應(yīng)溫度為95~100℃，反應(yīng)時(shí)間為10～12 h。其它與具體實(shí)施方式二或三相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二至四之一不同的是步驟一中的pH值至7~9。其它與具體實(shí)施方式二至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二至五之一不同的是步驟二中反應(yīng)溫度為70~80℃，反應(yīng)時(shí)間為8~9 h。其它與具體實(shí)施方式二至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二至六之一不同的是步驟三中常溫?cái)嚢璺磻?yīng)3~5天。其它與具體實(shí)施方式二至六之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二至七之一不同的是步驟三中pH值為8~10。其它與具體實(shí)施方式二至七之一相同。

用以下實(shí)例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)1：本試驗(yàn)的三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應(yīng)器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升溫至80~130℃ 并攪拌4 ~12 h后，冷卻至室溫，向反應(yīng)器中加入水，再用堿性溶液調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結(jié)晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為95%，熔點(diǎn)：>300℃。用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜表征該中間體化合物，得到的結(jié)果如下：

IR (KBr, cm^–1): 3326, 3080, 1595, 1479, 1332, 1299, 760, 725; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 14.33 (H, s), 9.28 (H, s)，8.90 (2H, d, J = 8.40 Hz )，8.53(2H, d, J = 7.80 Hz), 8.25 (H, d, J = 8.40 Hz), 7.80 (3H, t, J = 7.20 Hz), 7.71 (2H, t, J = 7.80 Hz), 7.26(H, d, J = 9.0 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO) : δ_C163.4, 147.7, 140.2, 128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 127.9, 127.9, 127.9, 126.7, 126.6, 126.6, 124.5, 124.5, 124.5, 122.5, 122.5, 122.5, 118.5, 113.5.

從表征結(jié)果知該中間體化合物的結(jié)構(gòu)式為：

二、中間體化合物的合成：

稱(chēng)取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應(yīng)器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0 ~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80% 的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50 ~80℃，反應(yīng)5 ~ 10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為91%，熔點(diǎn)：>300℃。用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜表征該中間體化合物，得到的結(jié)果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421，1728，1636，1616，1465，1349，757，725;¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H13.60 (H, s, J = 13.60 Hz), 12.23 (H, s, J = 12.23 Hz), 8.90 (2H, q, J = 8.90 Hz), 8.64 (H, d, J = 8.64Hz), 8.49 (H, d, J = 8.49 Hz), 7.77 (2H, q, J = 7.77 Hz), 7.68 (2H, t, J = 7.68 Hz), 7.44 (H, s, J = 7.44 Hz), 6.84 (H, q, J = 6.84 Hz), 6.73 (H, d, J = 6.73 Hz), 4.75 (2H, s, J = 4.75 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C 170.8, 150.4, 149.5, 141.3, 134.8, 128.3, 128.1, 127.9, 127.7, 126.7, 126.2, 126.0, 124.6, 124.4, 122.7, 122.5, 122.2, 119.2, 118.0, 113.2, 110.7.

從表征結(jié)果知該中間體化合物的結(jié)構(gòu)式為：

二、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應(yīng)器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8~16 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應(yīng)，冷至25~30℃。加入酸性溶液，調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為24～28%；

用紅外光譜、核磁氫譜進(jìn)行表征，得到的結(jié)果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 2928, 2853, 1727;¹H NMR(200 MHz, DMSO): δ_H 11.88 (H, s), 10.66 (H, s), 10.27 (H, s), 8.02 (H, d, J = 6.6 Hz), 7.86–7.69 (2H, m), 7.32 (H, d, J = 6.6 Hz), 6.96 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.85 (H, s), 6.71 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.61 (H, s).

從表征結(jié)果知該中間體化合物的結(jié)構(gòu)式為：

三、三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的合成：

按照1 :1～3物質(zhì)的量的比稱(chēng)取中間體化合物和中間體化合物，加入到反應(yīng)器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，25℃～30℃ 攪拌反應(yīng)4～8 h，停止反應(yīng)，加水淬滅，再用溶液調(diào)pH值至6～10，抽濾，水洗濾餅至中性，干燥，乙酸乙酯重結(jié)晶，得到褐色固體，三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針。本步驟中，三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的產(chǎn)率為96%。

三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的熔點(diǎn)為303~305℃。質(zhì)量百分純度大于95%。

用紅外光譜及核磁共振譜進(jìn)行表征，得到的結(jié)果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421, 1728, 1636, 1616, 1600, 1465, 1394, 1349, 757, 725, 695; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 15.13 (H, s, J = 15.13 Hz), 13.87 (H, s, J = 13.87 Hz), 13.45 (H, s, J = 13.45 Hz), 10.22 (H, s, J = 10.22 Hz), 9.64 (H, s, J = 9.64 Hz), 8.92 (2H, s, J = 8.92 Hz),8.60 (2H, d, J = 8.60 Hz), 8.46 ( s, J = 8.46Hz, H, ArH), 8.04 ( d, J = 8.04 Hz, H, ArH), 7.82 ( t, J = 7.82 Hz, 3H, ArH), 7.76 (H, q, J = 7.76 Hz), 7.34 (H, d, J = 7.34 Hz), 7.27 (H, d, J = 7.27 Hz), 7.04 (H, d , J = 7.04 Hz) 6.80 (2H, q , J = 6.80 Hz) 6.63 (2H, s, J = 6.63 Hz, ArH);

¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C169.12, 164.18, 160.07, 157.61, 156.02, 152.74, 151.74, 151.17, 149.17, 138.96, 136.26, 134.62, 133.18, 130.77, 129.46, 128.58, 128.26, 127.88, 126.59, 125.25, 124.77, 123.44, 122.69, 120.84, 118.86, 114.25, 109.91, 107.24, 103.42, 83.01.

從以上的表征結(jié)果可知，三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

將本試驗(yàn)制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針進(jìn)行光譜性能測(cè)試，步驟如下：

試驗(yàn)2：本試驗(yàn)與試驗(yàn)1不同的是試驗(yàn)1的步驟四用以下的操作代替：按照1 : 1 ~ 4的物質(zhì)的量的比稱(chēng)取0.65 g中間體化合物和0.62~2.5 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時(shí)加入20~30 mL的40~50%的硫酸溶液作為溶劑，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)2~7小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，并置于200 mL的燒杯中，用10~30％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8~10，抽濾，濾餅用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗(yàn)三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)率為50%。

試驗(yàn)3：本試驗(yàn)與試驗(yàn)1不同的是試驗(yàn)1的步驟4用以下的操作代替：按照1~3 : 1的物質(zhì)的量的比稱(chēng)取0.65~1.9 g中間體化合物和0.62 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時(shí)加入15~50 mL的甲醇作為溶劑，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)5~10小時(shí)，停止反應(yīng)，旋出甲醇，乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗(yàn)得到的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針結(jié)構(gòu)為：

產(chǎn)率為75%。

試驗(yàn)4：本試驗(yàn)與試驗(yàn)1不同的是試驗(yàn)1的步驟四用以下的操作代替：按照2~6 : 1的摩爾比稱(chēng)取1.3~3.8 g中間體化合物和0.62 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時(shí)加入15~55 mL的37%的濃鹽酸作為溶劑，25~30℃下反應(yīng)5小時(shí)，停止反應(yīng)，加入水淬滅，并置于200 mL的燒杯中，用5~30％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7~9，抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗(yàn)得到的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)率為40%。