本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及化合物1–15的分離制備方法及用途。具體涉及分離純化過程，結(jié)構(gòu)確證，乙酰膽堿酯酶抑制作用等。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)即老年性癡呆癥，是以癡呆為特征的大腦退行性變性疾病，嚴重影響患者的認知功能、記憶功能、社會生活能力、個人生活能力和情感人格等。隨著世界老年人口的急速增長，ad發(fā)病人數(shù)也逐年增多，現(xiàn)已成為現(xiàn)代社會嚴重威脅老年人生命的疾病之一。目前雖然針對ad的發(fā)病機理和癥狀開發(fā)出各種各樣的藥物，但是臨床上用于治療ad最成功的藥物還是乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitors，acheis)。貫葉連翹(hypericumperforatum)：又名貫葉金絲桃，歐洲名為“st.john’swort”,俗稱圣約翰草，系藤黃科金絲桃屬多年生草本植物。貫葉連翹在民間已有二千四百余年的藥用歷史。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認為，其性平，味辛苦澀，具有清心明目、舒經(jīng)活血、止血生肌、解毒消炎、利濕之功效。目前，用貫葉連翹提取物制成的制劑已在歐美大量上市，主要用于治療抑郁癥、甲型和乙型肝炎及艾滋病等。近年來，隨著阿爾茲海默病的患者不斷的增加，ad已經(jīng)成為繼心臟病和癌癥之后危害人類健康的主要疾病之一。但該疾病治療藥物少、療效不佳，當(dāng)前研發(fā)單一靶點抗ad新藥屢屢受挫，亟待新的防治策略。天然產(chǎn)物、特別是特殊三維結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物是藥物開發(fā)的重要源泉。近年來，越來越多的藥物研發(fā)人員開始致力于從藥用植物中尋找結(jié)構(gòu)新穎且對乙酰膽堿酯酶有良好抑制活性的化合物。因此，從貫葉連翹中篩選具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的新的天然產(chǎn)物具有非常重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化合物及其分離純化方法和應(yīng)用。本發(fā)明的間苯三酚類化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(1)；其中英文命名如表(1)。表(1).對式(1)中化合物1–15的中英文命名：中文名英文名化合物1圣約翰草素ahyperforatina化合物232-差向異構(gòu)圣約翰草素a32-epi-hyperforatina化合物3圣約翰草素bhyperforatinb化合物4圣約翰草素chyperforatinc化合物5圣約翰草素dhyperforatind化合物615-差向異構(gòu)圣約翰草素d15-epi-hyperforatind化合物7圣約翰草素ehyperforatine化合物832-差向異構(gòu)圣約翰草素e32-epi-hyperforatine化合物9圣約翰草素fhyperforatinf化合物10圣約翰草素ghyperforating化合物11圣約翰草素hhyperforatinh化合物12圣約翰草素ihyperforatini化合物1315-差向異構(gòu)圣約翰草素i15-epi-hyperforatini化合物14圣約翰草素jhyperforatinj化合物15圣約翰草素khyperforatink本發(fā)明人通過對藥用植物貫葉連翹(hypericumperforatum)的乙醇提取物進行分離純化，得到15個新化合物。綜合運用多種波譜分析方法和其他手段，確定其為間苯三酚類化合物，具體結(jié)構(gòu)如式(1)所示。通過對化合物1–15的乙酰膽堿酯酶抑制活性評價，發(fā)現(xiàn)化合物1–15對乙酰膽堿酯酶均有抑制作用，其中化合物3，5，6，8和9對乙酰膽堿酯酶有良好的抑制作用。本發(fā)明的又一個目的是提供式(1)中所示化合物在制備乙酰膽堿酯酶抑制藥物中的應(yīng)用。附圖說明圖1：化合物2晶體結(jié)構(gòu)；圖2：化合物6晶體結(jié)構(gòu)；圖3：化合物7晶體結(jié)構(gòu)。具體實施方式實施例1：化合物1–15的制備和結(jié)構(gòu)鑒定。(一)如式(1)所示化合物1–15的制備1.植物信息本植物的莖葉于2014年8月采摘自中華人民共和國湖北省神農(nóng)架地區(qū)，由華中科技大學(xué)張長弓教授鑒定為貫葉連翹(hypericumperforatum)。植物標(biāo)本存放于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與資源評價重點實驗室標(biāo)本室，標(biāo)本號為hp20140826。2.提取分離貫葉連翹的干燥莖葉(105kg)粉碎后用95％乙醇提取3次，每次室溫下浸泡4–5天，減壓濃縮后得到總浸膏8.3kg。將總浸膏懸浮于水中，用二氯甲烷萃取，最終得到二氯甲烷部位3.8kg。二氯甲烷部位進行硅膠柱層析(100–200目)，石油醚：丙酮梯度洗脫(100:0–0:100)，用tlc檢測合并相似的部分，得到7個組分(ⅰ–ⅶ)。組分ⅲ經(jīng)過mci柱脫色后，除去色素，再經(jīng)過反相c18柱層析(甲醇–水，50％–100％)得到8個組分：組分ⅲ1–ⅲ8。其中的組分ⅲ5再次進行硅膠柱層析，石油醚：丙酮梯度洗脫(30:0–0:1)，最終得到11個組分：ⅲ5a–ⅲ5k。其中的ⅲ5d經(jīng)過凝膠柱層析以及反相高效液相色譜(hplc)純化得到了化合物10，以及通過手性hplc方法得到了化合物5和6。同時，我們應(yīng)用與上述相同的方法從另外一個組分ⅲ5f中分離得到了化合物7和8。之后，我們對組分ⅲ5g進行了進一步的反相柱層析(甲醇–水，50％–85％)并得到5個組分：ⅲ5g1–ⅲ5g5。隨后，我們通過半制備hplc方法從ⅲ5g3中分離得到化合物1和2，從ⅲ5g4中分離得到化合物12和13。而組分ⅲ6則通過硅膠柱層析，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫(30:0–0:1)，得到8個組分：ⅲ6a–ⅲ6h。其中的組分ⅲ6d應(yīng)用和上述ⅲ5g相同柱層析分離方法得到了化合物3，4，14，和15。而化合物9和11則是通過另一個組分ⅲ6c經(jīng)過反相柱層析(甲醇–水，60％–90％)以及半制備hplc分離得到的。(二)如式(1)所示化合物1–15的結(jié)構(gòu)鑒定對化合物1–15的高分辨質(zhì)譜，紫外光譜，紅外光譜，旋光，核磁共振，圓二色譜和x射線單晶衍射等數(shù)據(jù)進行綜合分析，從而確定化合物1–15的結(jié)構(gòu)?；衔?：colorlessoil；[α]26d+80(c1.6,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝203(4.10)and281(4.04)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)205(-7.45),276(+30.04),305(-13.11)nm；ir(kbr)vmax3440,2973,2929,1722,1643,1616,1446,1383,1236cm–1；hresims:m/z569.3860[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物1的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(4)所示?；衔?：colorlesscrystals；mp163–165℃；[α]19d+81(c1.2,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.20)and281(4.06)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)203(-7.31),277(+28.95),305(-12.23)nm；ir(kbr)vmax3445,2976,2925,1725,1662,1620,1454,1383,1236cm–1；hresims:m/z569.3851[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物2的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(4)所示，晶體結(jié)構(gòu)如圖(1)所示。化合物3：colorlessoil；[α]29d+85(c2.5,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.23)and273(3.97)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)207(-8.84),269(+29.05),299(-7.95)nm；ir(kbr)vmax3437,2974,2929,1724,1642,1616,1446,1384,1226cm–1；hresims:m/z569.3846[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物3的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(4)所示。化合物4：colorlessoil；[α]30d+16(c2.4,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝203(4.54)and272(4.29)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)205(-9.69),269(+24.88),299(-11.44)nm；ir(kbr)vmax3434,2974,2929,1725,1648,1616,1445,1384,1234cm–1；hresims:m/z569.3838[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物4的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(4)所示?；衔?：colorlessoil；[α]26d+12(c0.5,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.41)and280(4.21)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)207(-6.24),275(+17.08),304(-10.51)nm；ir(kbr)vmax3437,2975,2930,1722,1656,1621,1445,1383,1243cm–1；hresims:m/z605.3828[m+na]+(calcdforc36h54o6na,605.3818).化合物5的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(4)所示?；衔?：colorlesscrystals；mp108–110℃；[α]26d+54(c0.6,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.31)and280(4.29)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)205(-11.40),276(+34.12),305(-14.21)nm；ir(kbr)vmax3442,2975,2929,1724,1655,1620,1446,1382,1238cm–1；hresims:m/z583.3992[m+h]+(calcdforc36h55o6,583.3999).化合物6的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(5)所示，晶體結(jié)構(gòu)如圖(2)所示。化合物7：colorlesscrystals；mp108–109℃；[α]26d+66(c0.3,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝203(4.42)and273(4.29)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)227(+12.73),248(-4.16),273(+13.80),302(-4.92)nm；ir(kbr)vmax3437,2970,2926,1731,1626,1449,1377,1237,1212cm–1；hresims:m/z569.3857[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842)?；衔?的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(5)所示，晶體結(jié)構(gòu)如圖(3)所示。化合物8：colorlessoil；[α]26d+71(c0.8,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.27)and273(4.20)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)227(+13.92),248(-4.30),273(+14.36),302(-4.76)nm；ir(kbr)vmax3438,2973,2927,1730,1627,1451,1365,1237,1212cm–1；hresims:m/z569.3836[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物8的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(2)和表(5)所示化合物9：colorlessoil；[α]22d+52(c0.4,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.20)and273(4.01)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)225(+7.40),247(-1.90),271(+9.70),301(-2.86)nm；ir(kbr)vmax3449,2971,2925,1730,1622,1451,1366,1237,1209cm–1；hresims:m/z525.3547[m+h]+(calcdforc33h49o5,525.3580).化合物9的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(5)所示化合物10：colorlessoil；[α]29d+48(c0.6,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.05)and273(3.93)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)227(+6.47),248(-2.63),273(+7.23),302(-2.60)nm；ir(kbr)vmax3441,2972,2927,1731,1624,1452,1366,1237,1213cm–1；hresims:m/z569.3866[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842)?；衔?0的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(5)所示?；衔?1：colorlessoil；[α]28d+34(c0.5,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.10)and283(4.00)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)242(-5.64),276(+15.73),302(-12.03)nm；ir(kbr)vmax3442,2972,2929,1729,1623,1408,1384,1236,1182cm–1；hresims:m/z569.3851[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物11的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(6)所示化合物12：colorlessoil；[α]21d+23(c0.4,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.12)and282(3.93)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)243(-4.16),277(+13.37),302(-9.97)nm；ir(kbr)vmax3434,2972,2927,1727,1614,1447,1409,1382,1236cm–1；hresims:m/z591.3660[m+na]+(calcdforc35h52o6na,591.3662).化合物12的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(6)所示化合物13：colorlessoil；[α]21d-28(c0.3,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.20)and282(4.03)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)244(-4.79),276(+10.41),301(-10.55)nm；ir(kbr)vmax3435,2960,2925,1726,1617,1451,1408,1382,1230cm–1；hresims:m/z591.3657[m+na]+(calcdforc35h52o6na,591.3662).化合物13的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(6)所示化合物14：colorlessoil；[α]28d+42(c4.3,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.49)and272(4.30)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)242(-4.07),269(+12.90),294(-6.81)nm；ir(kbr)vmax3435,2972,2928,1730,1621,1446,1411,1383,1214cm–1；hresims:m/z569.3860[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物14的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(6)所示化合物15：colorlessoil；[α]28d-10(c2.4,ch3oh)；uv(ch3oh)λmax(logε)＝202(4.35)and273(3.97)nm；ecd(ch3oh)λmax(δε)243(-3.74),270(+8.89),296(-5.05)nm；ir(kbr)vmax3435,2973,2928,1728,1620,1446,1412,1384,1215cm–1；hresims:m/z569.3832[m+h]+(calcdforc35h53o6,569.3842).化合物15的核磁共振(nmr)數(shù)據(jù)如表(3)和表(6)所示表(2).化合物1–8的13cnmr數(shù)據(jù)(recordincd3od).表(3).化合物9–15的13cnmr數(shù)據(jù)(recordincd3od).表(4).化合物1–5的1hnmr數(shù)據(jù)(recordincd3od；jinhz).表(5).化合物6–10的1hnmr數(shù)據(jù)(recordincd3od；jinhz).表(6).化合物11–15的1hnmr數(shù)據(jù)(recordincd3od；jinhz).實施例2：化合物1–15對乙酰膽堿酯酶的抑制作用?；衔?–15對乙酰膽堿酯酶的抑制作用是通過ellman方法確定的，結(jié)果如表(7)所示。表(7).化合物1–15對乙酰膽堿酯酶的抑制作用實驗結(jié)論：化合物1–15對乙酰膽堿酯酶均有抑制作用。其中，化合物3，5，6，8，9對乙酰膽堿酯酶有明顯的抑制作用，化合物1，4，11，15有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性。當(dāng)前第1頁12