本發(fā)明屬于基因領(lǐng)域，具體涉及一種macc1基因的抑制劑及其抗肝細胞癌侵襲用途。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性肝癌是一種原發(fā)灶發(fā)生于肝細胞和肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其中肝細胞性肝癌(即肝細胞癌，hcc)是最主要的病理類型，占原發(fā)性肝癌90％以上。macc1基因是2009年由stein等發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因。stein等研究發(fā)現(xiàn)，macc1作為肝細胞生長因子(hgf)/c-met信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，此外，劉清泉等發(fā)現(xiàn)macc1基因可能在肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，有可能成為肝癌治療的新靶點之一(劉清泉等，macc1基因在肝細胞癌中的表達及臨床意義，華中科技大學學報，2010，39：22-24)。目前，尚未見macc1基因多肽類抑制劑的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種macc1基因的抑制劑及其抗肝細胞癌侵襲用途。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：一種macc1基因的抑制劑，該抑制劑為一種多肽，該多肽包含式(ⅰ)氨基酸序列：etmfwydak(xa)pcftrvpma(xb)gtdeqlpdiwn；(ⅰ)其中，xa和xb選自m,y,l,v,w或e。優(yōu)選地，xa和xb選自m或w。優(yōu)選地，該抑制劑為下述多肽之一：etmfwydakmpcftrvpmamgtdeqlpdiwn；etmfwydakwpcftrvpmawgtdeqlpdiwn；etmfwydakmpcftrvpmawgtdeqlpdiwn；etmfwydakwpcftrvpmamgtdeqlpdiwn。優(yōu)選地，多肽n和/或c末端被化學修飾。優(yōu)選地，所述多肽的n末端被乙?；揎棧琧末端被酰胺化修飾。優(yōu)選地，所述多肽形式如下：ac-etmfwydakmpcftrvpmamgtdeqlpdiwn-nh2；ac-etmfwydakwpcftrvpmawgtdeqlpdiwn-nh2；ac-etmfwydakmpcftrvpmawgtdeqlpdiwn-nh2；ac-etmfwydakwpcftrvpmamgtdeqlpdiwn-nh2。優(yōu)選地，所述多肽為游離形式或藥學上可以接受的成鹽形式，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽。上述抑制劑在制備抗肝細胞癌增殖和侵襲的藥物中的應(yīng)用。一種藥物組合物，含有上述多肽抑制劑和藥學上可以接受的輔料。上述組合物在制備抗肝細胞癌增殖和侵襲的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的突出優(yōu)點：本發(fā)明提供的多肽抑制劑可以有效抑制肝細胞癌中macc1基因的表達，進而有效抑制肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移，可以用于制備成抗肝細胞癌侵襲的藥物。附圖說明圖1為多肽抑制劑對macc1mrna表達的影響；圖2為多肽抑制劑對macc1蛋白表達的影響。具體實施方式下面就結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細，凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。一、實驗材料本發(fā)明涉及的多肽通過本領(lǐng)域公知的標準多肽固相合成技術(shù)合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保護策略。按照樹脂固相合成的方法依次連接相應(yīng)氨基酸，期間依次脫去fmoc-保護基團，然后切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)c18柱分離純化，即可制得式(i)所示的多肽。hplc和ms檢測確證了本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)，且純度均≥98％。多肽i-1至多肽i-4的氨基酸序列如下，n末端和c末端未經(jīng)化學修飾：etmfwydakmpcftrvpmamgtdeqlpdiwn(多肽i-1)；etmfwydakwpcftrvpmawgtdeqlpdiwn(多肽i-2)；etmfwydakmpcftrvpmawgtdeqlpdiwn(多肽i-3)；etmfwydakwpcftrvpmamgtdeqlpdiwn(多肽i-4)。人肝細胞癌細胞株hepg2由本公司分子藥理實驗室保存。胎牛血清購自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑鹽和二甲基亞砜均購自美國sigma公司。兔抗人macc1抗體購自santacruz公司，hrp標記山羊抗兔igg二抗購自北京中衫金橋公司。transwell小室均購自millipore公司。pcr引物合成于廣州銳博，rt-pcr試劑盒購自takara公司。二、實驗方法1、人肝細胞癌細胞株hepg2培養(yǎng)人原發(fā)性肝癌細胞株于含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液中，37℃、5％co2培養(yǎng)，2-3d用0.25％胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。2、mtt法檢測多肽對hepg2增殖能力的影響取對數(shù)生長期的hepg2細胞，制成細胞懸液，以每孔5×104個細胞接種于96孔板中，每孔100μl細胞懸液。分為對照組、多肽i-1組、多肽i-2組、多肽i-3組、多肽i-4組。多肽組分別加入2、4、8、16、32μm的多肽，對照組加入等體積的試劑，培養(yǎng)24小時后，取出96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液并用pbs清洗，加入含mtt(終質(zhì)量濃度為5g/l)的rpmi-1640培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μl二甲基亞砜，搖床振蕩溶解結(jié)晶物。用dmso調(diào)零，于490nm測定每孔od值。按下述公式計算抑制率，并用直線回歸法計算各多肽的ic50值。增殖抑制率(％)＝(1-給藥組od值/對照組od值)×100％3、細胞侵襲實驗檢測多肽對hepg2侵襲能力的影響取4℃預(yù)冷的matrigel膠和無血清rpmi-1640細胞培養(yǎng)液，按體積比1：4充分混合均勻。向transwell板上室中每孔加入30μl上述混合液，覆蓋室中整個聚碳酸酯膜，于37℃培養(yǎng)箱中靜置3h后，每孔加入100μl細胞懸液(細胞密度為1×105/ml)和200μl無血清rpmi-1640培養(yǎng)液；同時向transwell板下室每孔加入500μl含體積分數(shù)30％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液。然后，用0、2、4、8、16、32μm的多肽分別處理hepg2細胞24h，然后取出小室，吸去培養(yǎng)液，甲醇固定30min，結(jié)晶紫染色20min，將小室倒置，用leicadc300f正置顯微鏡進行觀察并拍照。選取小室底面上、下、左、右及中心5個視野計數(shù)細胞，計算侵襲率。實驗重復(fù)3次，每個實驗點10個復(fù)孔。4、rt-pcr檢測多肽對hepg2細胞中macc1mrna表達的影響將hepg2細胞消化計數(shù)后加入6孔板，細胞密度為5×104/ml，細胞貼壁后，加入4、16μm的多肽培養(yǎng)24h，收集細胞，測定hepg2細胞中macc1mrna表達。另設(shè)置對照組，對照組不添加多肽。提取細胞總rna，逆轉(zhuǎn)錄得cdna，以此為模板進行pcr。引物如下：macc1上游引物：5’-ccttcgtggtaataatgcttcc-3’macc1下游引物：5’-agggcttccattgtattgaggt-3’β-actin上游引物：5’-acgcaccccaactacaactc-3’β-actin下游引物：5’-tctccttaatgtcacgcacga-3’于無菌無酶pcr管中配制50μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃60s，60℃50s，72℃90s，40次循環(huán)后，72℃延伸10min；4℃保存以備20g/l瓊脂糖凝膠電泳。實驗重復(fù)3次。5、westernblot檢測多肽對hepg2細胞中macc1蛋白表達的影響將hepg2細胞消化計數(shù)后加入6孔板，細胞密度為5×104/ml，細胞貼壁后，加入4、16μm的多肽培養(yǎng)24h，收集細胞，測定hepg2細胞中macc1蛋白表達。另設(shè)置對照組，對照組不添加多肽。通過bca法定量提取細胞總蛋白，在細胞總蛋白樣品中加入loadingbuffer，沸水使其充分變性。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(1:5000稀釋)及二抗(1:10000稀釋)雜交后進行化學發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參。最后，對條帶進行灰度掃描。macc1相對表達量＝macc1條帶積分光密度值/β-actin條帶積分光密度值。三、實驗結(jié)果1、多肽對hepg2增殖能力的影響與對照組相比，各多肽給藥組hepg2細胞的增殖均受到明顯抑制，且增殖抑制率與多肽濃度有關(guān)，濃度越高，抑制作用越強，具有明顯的濃度依賴性。結(jié)果如表1。表1不同濃度多肽對hepg2的增殖抑制率(％)2μm4μm8μm16μm32μm多肽i-1組13.5524.3240.6964.9578.32多肽i-2組18.6028.5845.4669.3684.58多肽i-3組10.8421.7238.0659.8472.44多肽i-4組11.5622.8539.7362.0875.73上述結(jié)果表明，多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4對hepg2細胞的增殖具有明顯的抑制作用，這種抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，ic50約為12μm，藥效優(yōu)異。2、多肽對hepg2侵襲能力的影響各多肽均能明顯抑制hepg2細胞的侵襲，hepg2細胞的侵襲率隨多肽濃度的升高而降低。結(jié)果如表2所示。表2不同濃度多肽對hepg2侵襲率(％)的影響2μm4μm8μm16μm32μm多肽i-1組83.4862.6944.9423.8411.25多肽i-2組80.1661.2043.0422.289.64多肽i-3組86.8565.7447.3526.5213.12多肽i-4組85.2664.9246.0325.0612.03transwell侵襲實驗證明，多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4對hepg2細胞的侵襲具有明顯的抑制作用，這種抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系。3、多肽對hepg2細胞中macc1mrna表達的影響多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4給藥處理24小時后，hepg2細胞中macc1mrna表達水平顯著下降，且多肽濃度越高，macc1mrna表達水平下降越明顯。各組macc1mrna相對表達量如圖1所示。結(jié)果表明，多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4對hepg2細胞macc1基因的轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的抑制作用。4、多肽對hepg2細胞中macc1蛋白表達的影響多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4給藥處理24小時后，hepg2細胞中macc1蛋白表達水平顯著下降，且多肽濃度越高，macc1蛋白表達水平下降越明顯。各組macc1蛋白相對表達量如圖2所示。結(jié)果表明，多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4對hepg2細胞macc1基因的翻譯水平具有明顯的抑制作用。綜合上述實驗可以得出如下結(jié)論：多肽i-1、多肽i-2、多肽i-3、多肽i-4可以從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制macc1基因在hepg2細胞中的表達，為macc1基因的有效抑制劑；同時，該macc1基因的有效抑制劑可以顯著抑制hepg2細胞的增殖和侵襲，該macc1基因的有效抑制劑可以用于制備成抗肝細胞癌侵襲的藥物。申請人還測試了上述多肽末端修飾(n末端被乙?；揎棧琧末端被酰胺化修飾)后的藥理作用，結(jié)果證明上述多肽末端修飾后與未修飾的形式具有類似的藥理作用和藥效強度。上述實施例是對本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護范圍局限于上述具體的實施例。當前第1頁12