本發(fā)明涉及分子生物學和生物醫(yī)學領(lǐng)域。更具體地，涉及一種基于重組病毒的抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法的建立和應用。

背景技術(shù)：

呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus，rsv)是在世界范圍內(nèi)引起5歲以下兒童和嬰兒嚴重呼吸道疾病和毛細支氣管炎的最常見的病毒性病原體之一。rsv引起的季節(jié)性感染通常持續(xù)1-2周，在大多數(shù)健康的成年人身上表現(xiàn)為輕微的類似感冒的癥狀。然而，對于弱勢群體—嬰兒、老年人和免疫力低下的人，rsv感染易導致嚴重的下呼吸道感染。據(jù)估計，2005年全球約有3.38億5歲以下兒童發(fā)生了rsv感染。其中，約有340萬人為嚴重的下呼吸道感染需要住院治療，至少有66,000人死亡。嚴重的rsv感染同樣困擾著老年人，在美國每年rsv感染會導致約177,000名老年人住院，約有11,000人死亡。據(jù)估計，每年住院費用超過10億美元。持續(xù)缺乏任何特定的治療或安全有效疫苗減少全球rsv感染的發(fā)病率和死亡率。

目前還沒有授權(quán)的疫苗可以預防rsv，用于治療rsv的藥物也僅有利巴韋林和帕利珠單抗，然而帕利珠單抗是一種昂貴的人源化單克隆抗體，僅能用作預防性治療，利巴韋林是一種核苷抗代謝物，有嚴重毒性，存在致畸作用。因此，我們迫切需要開發(fā)新的抗rsv藥物。

高通量篩選(highthroughputscreening，hts)技術(shù)以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式結(jié)合自動化操作系統(tǒng)，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù)，可以實現(xiàn)對高容量化合物樣品庫的篩選。高通量篩選在微板中進行操作，樣品用量一般在微克級別，節(jié)省了化合物樣品，降低了成本；運用自動化操作系統(tǒng)，減少了工作人員的勞動量，提高了篩選的準確性；依賴于數(shù)量龐大的化合物樣品庫，實現(xiàn)了大規(guī)模的藥物篩選，充分利用了藥物資源，提高了新的藥物發(fā)現(xiàn)的概率。

高通量篩選系統(tǒng)由化合物樣品庫，自動化操作系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)四個部分組成，運用所建立的高通量篩選模型，可以微量、快速、靈敏和準確的進行藥物篩選。目前，高通量篩選模型已經(jīng)成為開發(fā)抗病毒藥物的主要方式，迄今為止已有很多高通量篩選模型用于抗病毒藥物篩選，并取得了一定的成效。

因此，提供一種抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法對于預防和治療rsv具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種基于反向遺傳學構(gòu)建的重組rsv反基因組質(zhì)粒rrsv-gfp及其經(jīng)拯救獲得的重組病毒。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種簡便、快速、準確、便于操作的抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于反向遺傳學構(gòu)建的重組rsv反基因組質(zhì)粒rrsv-egfp，其序列如seqidno.1所示，全長為19543bp。

進一步地，所述重組質(zhì)粒rrsv-egfp是將重組序列裝入到pbrat載體中獲得的；其中，所述重組序列是在rsv反基因組的5′端側(cè)翼插入t7啟動子序列，3′端側(cè)翼插入丁型肝炎核酶(hdvribozyme,δ)序列和t7終止子，在g和f基因之間插入綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)基因，并刪除了sh基因的非編碼區(qū)186-297之間112個堿基；所述pbrat載體是將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體中，即得。

本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的制備包括以下步驟：

1)將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體，將其改造為pbrat載體；

2)將nheⅰlmluⅰ合成片段連接到載體pmd18-t中得pmd18-t-l質(zhì)粒；取a1(pmeⅰns1ns2npmshxhoⅰ)合成片段、pbr322b載體，pmeⅰ和xhoⅰ酶切，連接，得到pbr322b-rsva1質(zhì)粒；取a2(sacishgasuⅱ)合成片段、pbr322b載體，saci和asuⅱ酶切，連接，得到pbr322b-rsva2質(zhì)粒。

3)本發(fā)明采用分段克隆的方法來構(gòu)建rrsv-egfp質(zhì)粒，即取pmd18-t-l質(zhì)粒、pbrat載體，nhei和mlui酶切，連接，得到pbrat-l質(zhì)粒，取asuiigegfpfm2lnheⅰ合成質(zhì)粒、pbrat-l質(zhì)粒，asuii和nhei酶切，連接，得到pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，取pbr322b-rsva1質(zhì)粒、pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，pmei和xhoi酶切，連接，得到pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，取pbr322-rsva2和pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，saci和asuii酶切，連接，得到rrsv-egfp質(zhì)粒。

采用相似或相同的制備原理，重組序列也可以裝入到其他的表達載體中或修改的表達載體中，表達載體的修改方式不限于本申請例舉的方法。

采用本發(fā)明原理構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，插入綠色熒光蛋白基因以外的其他報告基因，如熒光素酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶等活熒光蛋白家族中的成員，實現(xiàn)通過檢測報告蛋白的表達量來評價抗rsv藥物的，也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明構(gòu)建的攜帶egfp重組質(zhì)粒是在以rsvlong株為母本的基礎(chǔ)上進行改造構(gòu)建的，推動了反向遺傳學在rsv上的應用，另外，利用此重組質(zhì)?？捎糜谡萺sv重組病毒，并可進一步將重組病毒用于抗rsv藥物的高通量篩選中，具有靈敏直觀的優(yōu)勢。

本發(fā)明還提供了由上述重組質(zhì)粒經(jīng)拯救獲得重組rsv。

本發(fā)明進一步提供了上述重組rsv在篩選抗rsv藥物中的應用。

本發(fā)明利用上述重組rsv病毒篩選抗rsv藥物的高通量篩選方法，包括以下步驟：接種宿主細胞，加入重組rsv和待篩選藥物；檢測gfp熒光強度；評價待篩選藥物的抗rsv效果。

基于rrsv-egfp的高通量篩選模型有很多優(yōu)點：第一，操作非常簡單，高效，很適合自動化的篩選以便廣泛的篩選化合物的；第二，與基于細胞病變效應(cytopathiceffect,cpe)等傳統(tǒng)的方法相比，基于rrsv-egfp的高通量篩選模型的數(shù)據(jù)更客觀、準確和穩(wěn)定，避免了實驗人員的主觀影響；第三，綠色熒光蛋白的發(fā)光過程不需要任何其他輔助因素，可直接產(chǎn)生綠色熒光，且gfp的表達量與病毒在細胞中的復制量相統(tǒng)一，對細胞的生長和病毒的復制幾乎沒有影響。

進一步地，所述宿主細胞包括實驗組宿主細胞、細胞對照組宿主細胞、病毒對照組宿主細胞和陽性對照組宿主細胞。

所述宿主細胞為hep-2細胞或vero細胞；優(yōu)選地，為hep-2細胞。

利用熒光強度抑制率評價待篩選的藥物的抗rsv效果，公式如下：

抑制率＝(病毒對照組熒光強度-實驗組熒光強度)/(病毒對照組熒光強度-細胞對照組熒光強度)×100％

其中，所述細胞對照組既不加重組rsv也不加待篩選藥物；病毒對照組只加重組rsv，不加待篩選藥物；實驗組既加重組rsv又加待篩選化合物；另外同時設(shè)立陽性對照組，加重組rsv和對重組rsv明確有抑制作用的化合物。所述病毒對照組、陽性對照組與實驗組加入重組rsv的量相同。所述熒光強度是指綠色熒光蛋白(gfp)的熒光信號(rfu)。抑制率越大則表明待篩選藥物抗rsv作用越強，可以對比陽性對照組和實驗組的抑制率，確定待篩選藥物對rsv的抑制作用。

進一步地，所述熒光強度檢測的激發(fā)波長為470-481nm，發(fā)射波長為515-525nm；優(yōu)選地，激發(fā)波長479nm，發(fā)射波長517nm。

進一步地，所述病毒加入后24-72h檢測熒光強度；優(yōu)選地，為48h。

進一步地，所述96孔板中，宿主細胞感染重組rsv劑量為100-10000pfu/孔；優(yōu)選地，宿主細胞感染重組rsv病毒劑量為3000pfu/孔。

進一步地，所述96孔板中，宿主細胞的接種密度為0.5×10⁴-4×10⁴細胞/孔；優(yōu)選地，為2×10⁴細胞/孔。

為了優(yōu)化高通量篩選方法中g(shù)fp的檢測條件，本發(fā)明對gfp的檢測波長、檢測時間、病毒感染劑量、病毒感染劑量、細胞密度進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示：對于檢測波長：當激發(fā)波長為470-481nm，發(fā)射波長為515-525nm，檢測病毒量與熒光強度間的線性關(guān)系較好；而激發(fā)波長為479nm，發(fā)射波長為517nm熒光強度值較高，因此，確定了檢測的激發(fā)波長為479nm，發(fā)射波長為517nm。對于檢測時間：在感染后48h，gfp表達水平較高，72h時熒光強度有所下降，因此確定檢測時間為感染后48h。對于病毒感染劑量：隨著rsv濃度的增高細胞活性呈現(xiàn)下降的趨勢，然而在100-10000pfu細胞活性維持在80％以上，結(jié)合病毒感染劑量優(yōu)化結(jié)果，確定病毒感染劑量為3000pfu/孔。對于細胞密度：當細胞密度為2×10⁴細胞/孔時能夠檢測到最大信號強度，且各細胞密度對照組間無顯著性差異，因此，確定細胞用量為2×10⁴細胞/孔。

在本發(fā)明中，待篩選藥物可以是人工合成的化合物，也可以是從天然產(chǎn)物中分離純化的化合物，可以是單個化合物，也可以是由單個化合物組成的混合化合物。初篩后，將陽性的混合化合物樣品拆分為單個化合物，進行再次篩選。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明利用表達綠色熒光蛋白的重組rsv病毒與宿主細胞和待篩選化合物相互作用，由于綠色熒光蛋白的表達水平與病毒復制水平密切相關(guān)可以通過檢查熒光強度分析化合物的抗病毒作用，進而建立針對rsv的高通量藥物篩選模型，進行大規(guī)模的藥物篩選，為抗rsv藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明方法操作簡便，能夠更快速、準確的反映病毒狀況，便于高通量操作；

3、本發(fā)明方法是在96孔板中進行操作，能夠同時對多個化合物進行篩選，且數(shù)據(jù)更客觀、準確和穩(wěn)定，避免了實驗人員的主觀影響；

4、本發(fā)明gfp熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物及其他輔助因子，且對細胞毒性較小。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出載體pbrat的酶切鑒定電泳圖，其中m代表分子量標記物。

圖2示出重組rrsv-egfp質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中m代表分子量標記物；1：asuⅱ，nheⅰ；2：pmeⅰ，xho??；3：asuⅱ，sacⅰ；4：ecorⅴ；5：speⅰ；6：aflⅱ；7：mluⅰ。

圖3示出質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染bhk-t7/9細胞后顯微鏡下觀察熒光表達情況；1：實驗組；2：陽性對照組；3：陰性對照組mock。

圖4示出盲傳至宿主細胞hep-2細胞后顯微鏡下觀察熒光表達情況；1：實驗組；2：陰性對照組mock。

圖5示出熒光顯微鏡觀察rrsv-egfp連續(xù)傳代后熒光表達情況；p1-p8：第一到第八代。

圖6示出利用免疫酶法檢測連續(xù)傳代后重組病毒的空斑形成單位(pfu/ml)

圖7示出為不同激發(fā)波長和發(fā)射波長檢測的結(jié)果，其中，pfu/孔為96孔板每個孔中的病毒數(shù)單位；檢測的激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525。

圖8示出不同時間點rsv與gfp之間的劑量-效應關(guān)系曲線。

圖9示出病毒感染量對細胞活性的影響。

圖10示為細胞密度與檢測結(jié)果的關(guān)系，其中，細胞/孔為96孔板每個孔中的細胞數(shù)單位。

圖11示為化合物p13與gfp表達量的關(guān)系。

圖12示出利巴韋林與gfp表達量的關(guān)系。

圖13示出高通量篩選模型z’因子檢測統(tǒng)計圖

圖14示出sp100107化合物庫2000個化合物初篩陽性結(jié)果。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1rrsv-egfp質(zhì)粒的構(gòu)建

1、將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體，將其改造為pbrat載體，將改造后的載體利用xhoⅰ和notⅰ進行酶切鑒定，于3466bp處得到目的條帶(圖1)，即載體片段。

2、將nheⅰlmluⅰ合成片段連接到載體pmd18-t中得pmd18-t-l質(zhì)粒；取a1(pmeⅰns1ns2npmshxhoⅰ)合成片段、pbr322b載體，pmeⅰ和xhoⅰ酶切，連接，得到pbr322b-rsva1質(zhì)粒；取a2(sacishgasuⅱ)合成片段、pbr322b載體，saci和asuⅱ酶切，連接，得到pbr322b-rsva2質(zhì)粒。

3、反基因組rrsv-egfp質(zhì)粒構(gòu)建

取pmd18-t-l質(zhì)粒、pbrat載體，nhei和mlui酶切，連接，得到pbrat-l質(zhì)粒，取asuiigegfpfm2lnhei合成質(zhì)粒、pbrat-l質(zhì)粒，asuii和nhei酶切，連接，得到pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，取pbr322b-rsva1質(zhì)粒、pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，pmei和xhoi酶切過夜，連接，得到pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，取pbr322-rsva2質(zhì)粒和pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，saci和asuii酶切，連接，得到rrsv-egfp質(zhì)粒，將獲得的rrsv-egfp質(zhì)粒用asuⅱ，nheⅰ(1)；pmeⅰ，xhoⅰ(2)；asuⅱ，sacⅰ(3)；ecorⅴ(4)；speⅰ(5)；aflⅱ(6)；mluⅰ(7)多組酶進行酶切鑒定，分別在相應位置得到目的條帶(圖2)。

實施例2重組病毒的拯救

將bhkt7/9細胞接種在6孔板，24h后，轉(zhuǎn)染所述rrsv-egfp質(zhì)粒和四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)至宿主細胞(bhkt7/9)于37℃下培養(yǎng)(實驗組)，與此同時設(shè)立陽性對照組和陰性對照組mock，其中陽性對照組轉(zhuǎn)染rsv微型復制子pbr322b-rsv-egfp和四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)，陰性對照組mock只轉(zhuǎn)染四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)，轉(zhuǎn)染96小時盲傳至宿主細胞hep-2繼續(xù)放置于37℃下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染(圖3)和盲傳(圖4)后每天在顯微鏡下觀察熒光表達情況，根據(jù)細胞出現(xiàn)的熒光可以判斷實驗組已成功拯救出重組病毒。

實施例3重組病毒穩(wěn)定性鑒定

利用熒光顯微鏡觀察rrsv-egfp連續(xù)傳代后熒光表達情況(圖5)和利用免疫酶法檢測連續(xù)傳代后重組病毒的空斑形成單位(pfu/ml)(圖6)，從連續(xù)傳代的熒光表達情況可以看出拯救出的重組病毒是穩(wěn)定的，免疫酶法檢測的結(jié)果顯示拯救出的重組病毒的量在連續(xù)傳3代后趨于穩(wěn)定(p<0.05)。

實施例4檢測條件的優(yōu)化

1.確定合適的檢測波長：

96孔板中培養(yǎng)hep-2細胞，感染3倍梯度稀釋的rsv(30000-0pfu)，于感染后24h檢測gfp表達水平，如圖7所示，檢測的激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525，用d、e、f三組波長檢測病毒量與熒光強度間的線性關(guān)系較好，e組的熒光強度值較高，確定檢測的激發(fā)波長為479nm，發(fā)射波長為517nm。

2.確定合適的檢測時間和病毒感染劑量：

96孔板中培養(yǎng)hep-2細胞，感染3倍梯度稀釋的rsv(30000-0pfu)，分別于感染后24h、48h和72h檢測gfp表達水平，如圖8所示，在感染后48h，gfp表達水平較高，確定檢測時間為感染后48h。并利用mts法對感染后48h的細胞活性進行了檢測，如圖9所示，隨著rsv濃度的增高細胞活性呈現(xiàn)下降的趨勢，然而在100-10000pfu細胞活性維持在80％以上，且病毒量與熒光強度有很強的相關(guān)性，確定病毒感染劑量為3000pfu/孔。

3.確定合適的細胞用量：

在上述實驗的基礎(chǔ)上，分別按0.5×10⁴細胞/孔、1.0×10⁴細胞/孔、2×10⁴細胞/孔和4×10⁴細胞/孔的密度將hep-2細胞接種到96孔板中，用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細胞，同時設(shè)立相應的細胞對照，感染后48h，檢測gfp表達水平。如圖10所示，當細胞密度為2×10⁴細胞/孔時能夠檢測到最大信號強度(p<0.01)，因此確定細胞用量為2×10⁴細胞/孔。

實施例5系統(tǒng)驗證

96孔板中，按2×10⁴細胞/孔接種細胞，24h后取化合物p13或利巴韋林進行10倍梯度稀釋至10^-4-10²μm加到細胞中，之后加入3000pfu/孔的rsv，同時設(shè)立相應劑量dmso對照組，細胞對照及病毒對照，感染后48h檢測egfp表達水平。當化合物p13濃度為1m時，與dmso對照組相比，egfp表達水平顯著下降(如圖11，p<0.05)；當p13濃度達到100μm時，egfp表達量幾乎完全被抑制。當利巴韋林濃度為10^-2μm時，與空白對照組相比，egfp表達水平顯著下降(如圖12，p<0.05)；當利巴韋林濃度達到100μm時，egfp表達量幾乎完全被抑制。

同時，在加入化合物p13或利巴韋林48h后，我們利用mts法對細胞活性進行了檢測，結(jié)果表明在所有實驗劑量組中，細胞活性均保持在80％以上，表明陽性化合物對rsv的抑制作用并不是由細胞毒性引起的，且dmso溶劑對egfp的表達沒有明顯的影響?；谶@些結(jié)果，我們認為此系統(tǒng)能夠正確反映陽性化合物對rsv的抑制作用，能夠用于篩選抗rsv藥物。

實施例6高通量篩選模型z’因子檢測

96孔板中，按2×10⁴細胞/孔接種細胞，24h后用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細胞，作為病毒感染組(48個孔)，hep-2細胞只加入維持液，作為細胞對照組(48個孔)，感染后48h檢測egfp表達水平，結(jié)果如圖13所示，從圖中可以看出，病毒感染組和細胞對照組的相對熒光強度均穩(wěn)定分布在一定范圍內(nèi)。計算z’因子，變異系數(shù)(％cv)、信噪比(s/n)和信背比(s/b)。z’＝1-(3×病毒感染對照組標準偏差+3×細胞對照組標準偏差)/(病毒感染對照組平均值-細胞對照組平均值)，z’在0.5～1.0之間符合高通量篩選的要求。s/b＝病毒感染對照組平均值/細胞對照組平均值(推薦標準：>3)；s/n＝(病毒感染對照組平均值-細胞對照組平均值)/((細胞對照組標準偏差)2+(病毒感染對照組標準偏差)2)1/2(推薦標準：>10)。％cv＝病毒感染對照組標準偏差/病毒感染組平均值(推薦標準：<20)。如表1所示，根據(jù)公式計算，抗rsv藥物高通量篩選模型z’＝0.85(n＝48)，符合高通量篩選模型的可接受標準，其他各項參數(shù)也均符合高通量篩選的統(tǒng)計學要求，因此，利用gfp標記的重組rsv建立的抗rsv藥物篩選模型符合高通量篩選要求，可以應用于大規(guī)模篩選實驗。

表1高通量篩選模型各參數(shù)統(tǒng)計表

實施例7sp100107化合物庫篩選

采用本發(fā)明構(gòu)建的篩選模型進行小規(guī)模的藥物篩選，初篩2000個化合物，篩選濃度為10μm。96孔板中，按2×10⁴細胞/孔接種細胞，用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細胞同時取化合物1μl加到hep-2細胞中，感染48h后檢測綠色熒光蛋白的表達量。計算抑制率。抑制率＝(病毒感染對照組-實驗組)/(病毒感染對照組-細胞陰性對照組)×100％。選擇抑制率大于50％的化合物作為初篩得到的陽性化合物，包括硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤等(如表2)，陽性率為1.65％(部分結(jié)果如圖14)。

表2部分陽性化合物的分子式和結(jié)構(gòu)式

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。

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<110>北京交通大學

<120>一種抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法和應用

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