本發(fā)明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應用。特別涉及一種綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）肽基脯氨酸順反異構酶蛋白（peptidyl-prolylcis-transisomerases,ppiase）基因dvppiase的核苷酸序列、編碼蛋白dvppiase，及其在提高生物耐鹽能力和在改良農作物性狀中的應用。

背景技術：

鹽堿化是影響植物生長的最重要的環(huán)境壓力之一，世界20%的可耕土地嚴重的鹽漬化，它嚴重影響了農作物的產量和生產力。克隆植物的耐鹽基因，分析探討相關的耐鹽機制，并應用于作物品種改良和鹽堿地利用，是未來農業(yè)生產一個重要的研究方向。

杜氏藻屬(dunaliella)是自然界中廣泛存在的一種無細胞壁的真核單細胞綠藻，廣泛分布于鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環(huán)境中，尤其在高鹽水域中是主要種群，很容易從自然環(huán)境中分離得到。其細胞外只有一層彈性糖蛋白外膜，隸屬綠藻門、真綠藻綱、團藻目、鹽藻科、鹽藻屬。自從1905被命名后，在這一個世紀以來，鹽藻成為研究藻類對鹽適應性的最為方便的模式生物。綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）是杜氏藻屬中具有代表性的一個種。該種又稱杜氏鹽藻、鹽生綠色杜氏藻等，它是已知最耐鹽的真核生物。對環(huán)境具有極強的適應能力，可以適應0.05m-5.5mnacl、8-35℃、ph6-9的生長條件。鹽藻還具有非常強的滲透調節(jié)能力，它一次最大可以耐受3~4倍的滲透壓的變化；如果通過梯度改變滲透壓，鹽藻可以耐受7倍以上的滲透壓的變化。此外，它對營養(yǎng)、光照、溫度、ph值、重金屬等環(huán)境因子造成的脅迫也有很好的耐受性。極強的耐鹽能力、簡單的細胞結構以及便利的培養(yǎng)條件，使綠色杜氏藻成為研究植物適應高鹽脅迫的分子機制的重要的基因資源寶庫。

肽基脯氨酰異構酶(peptidyl-prolylisomerases,ppiase)可以參與調節(jié)轉錄因子的活性，催化加速肽基脯氨酸的順反異構化，在蛋白質的折疊/解折疊中起重要作用。它也可能參與蛋白質復合物的組裝/解組裝、蛋白質運輸及調節(jié)蛋白質活性。ppiase具有三個家族：親環(huán)蛋白(cyclophilin)家族、fk506結合蛋白(fkbp)家族、小菌素家族(parvulinfamily)。這三個家族在主要序列和三維結構上并不相似，卻能完成同樣的反應，都能使蛋白質脯氨酸殘基n-末端一邊的肽鍵進行順反異構化。其中fkbp具有底物專一性，可以和免疫抑制劑fk506以及雷帕霉素特異性結合。除了具有ppiase酶活性,fkbps還充當著分子伴侶的角色,提供蛋白質之間相互作用的結合位點，與其他蛋白相互作用從而調控不同的生化過程。該家族基因在植物的響應脅迫和不同生長發(fā)育過程中都扮演著重要角色。在調控基因表達和光合適應性方面也具有廣泛的生物學功能。目前還沒有文獻報到具有耐鹽的功能。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種具有耐鹽功能的基因，該基因是從綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）中分離出來的肽基脯氨酸順反異構酶蛋白（peptidyl-prolylcis-transisomerases,ppiase）基因，稱為dvppiase。

本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。

本發(fā)明目的之三是提供利用基因提高生物耐鹽性方面的應用，其特征在于含有dvppiase基因的鹽敏感酵母細胞可以獲得一定的耐鹽能力。

為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種具有耐鹽功能的基因，其特征在于該基因為seqidno：1所示的dna序列。

一種上述基因的編碼蛋白，其特征在于該蛋白是seqidno2所示的氨基酸序列。

一種上述的具有耐鹽功能的基因在提高生物體耐鹽能力中的應用。

一種上述的具有耐鹽功能的基因在改良農作物性狀中的應用。

本發(fā)明通過逆境脅迫的方法，從綠色杜氏藻中克隆到了一個肽基脯氨酸順反異構酶蛋白基因，并通過實驗證明了它具有耐鹽的功能?？寺》治鼍G色杜氏藻中dvppiase基因有助于深入理解綠色杜氏藻抗鹽機制，同時也會為生物耐鹽基因工程和分子育種提供了基因資源。本發(fā)明首次從綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）中分離到肽基脯氨酸順反異構酶蛋白基因dvppiase，并通過轉化酵母細胞證明該基因還具有耐鹽功能和改良農作物性狀的應用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的dvppiase基因編碼蛋白的物種間同源性分析圖。紅色方框標注為dvppiase基因編碼蛋白的的第118-218位氨基酸，即為屬于fkbp_c超家族的肽基脯氨酸順反異構酶ppiase的保守結構域。

圖2為本發(fā)明的dvppiase基因編碼的蛋白進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于肽基脯氨酸順反異構酶蛋白ppiase家族。

圖3為本發(fā)明的dvppiase基因在酵母突變體g19中的功能分析。即含dvppiase完整orf的est序列插入到酵母表達載體paj401中，轉化酵母鹽敏感突變體g19，在含不同濃度的nacl的表型展示培養(yǎng)基上進行表型測定。

具體實施方法

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆（molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.）或酵母遺傳學方法（methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual,adamsaetal編，coldspringharborlaboratory,1998出版）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例一：dvppiase全長編碼區(qū)的克隆與分析

對綠色杜氏藻d.viridis受不同濃度鹽誘導的cdna文庫est序列（表達序列標簽）進行分析，通過序列比對，分離到了一個綠色杜氏藻肽基脯氨酸順反異構酶蛋白基因，命名為dvppiase。該est序列全長816bp，含有dvppiase完整的開放閱讀框（orf）、kozak序列（gccatgc）以及poly(a)結構，見序列表seqidno：1所示的dna序列。

實施例二dvppiase編碼的蛋白結構、同源分析及定位預測

vectornti軟件的分析結果顯示：該基因編碼一個含225個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為24.7kda，等電點為8.64。該基因編碼的蛋白c端第118-218位氨基酸具有保守的fkbp_c型的肽基脯氨酸順反異構酶結構域，參見圖2。圖3為本發(fā)明的dvppiase基因編碼的蛋白進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于肽基脯氨酸順反異構酶蛋白家族。dvppiase與其他物種的ppiase蛋白具有一定的同源性。它與藻類的同源蛋白相似度在60-69%，與高等植物的同源蛋白相似度低于60%。

通過信號肽預測軟件（signalp4.1）分析顯示dvppiase蛋白的第24-25位點存在一個存在一個剪切位點。tmhmm預測顯示dvppiase蛋白無跨膜結構。wolfpsort軟件預測表明dvppiase蛋白定位在葉綠體中。

實施例三dvppiase在酵母突變體中的功能分析

（一）酵母表達載體的構建：首先將含有dvppiase完整orf的est序列（編號6376）構建到酵母表達載體中：我們將6376序列利用限制性內切酶位點ecori和xhoi構建到酵母表達載體paj401中。

（二）轉化酵母：使用liac熱激轉化法將含有6376的重組克隆轉化到酵母鹽敏感突變體g19（mat?,ura3his3trp1ade2ena1△::ena4△）中。

（二）酵母轉化子的表型鑒定

所用基本培養(yǎng)基為ap培養(yǎng)基，并加入所需氨基酸。篩選標記為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷。轉入載體為paj401的轉化子表型展示培養(yǎng)基，添加2%的半乳糖作為碳源。所用表型展示培養(yǎng)基：以不含nacl的ap培養(yǎng)基為對照生長條件，加入不同濃度的nacl的ap培養(yǎng)基為耐鹽表型分析生長條件。

首先將酵母轉化子在ap培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600=0.6，以5μl為一個滴度，并以5倍稀釋度為系列稀釋滴度，在表型展示培養(yǎng)基上展示酵母轉化子的耐鹽表型。在paj401組成型強表達啟動子啟動下，6376成功互補了酵母鹽敏感突變體g19的表型，參見圖3；結果表明轉化了含dvppiase完整orf的est序列的酵母鹽敏感突變體可以在220mmnacl下仍然有表型，說明了dvppiase基因能夠部分恢復酵母突變體的功能，證明了dvppiase能夠有效地提高生物體的耐鹽能力。

盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內的變動。

<110>上海大學

<120>具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及應用

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<212>dna

<213>綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）

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<213>綠色杜氏藻（dunaliellaviridis）

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