本發(fā)明涉及的是基因工程的技術領域，尤其涉及的是一種基于zmend1a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和淀粉含量的方法。

背景技術：

淀粉是植物種子的主要組成部分，作為光合作用的最終產(chǎn)物，是取之不盡用之不竭的天然材料。淀粉不僅可以作為糧食、飼料，而且是重要的工業(yè)原材料，廣泛用于食品、化工、能源、機械、建筑、制藥等行業(yè)。水稻中，淀粉為水稻胚乳的主要組成成分，其含量和品質(zhì)直接影響著水稻種子的品質(zhì)。

淀粉根據(jù)結(jié)構不同分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例以及支鏈淀粉的分支鏈結(jié)構決定著水稻的品質(zhì)，同時直鏈淀粉和直鏈淀粉之間的比例還決定著淀粉的用途。直鏈淀粉生產(chǎn)的可再生、可降解膜應用于農(nóng)用薄膜加工業(yè)和包裝工業(yè)，可以減少工業(yè)廢氣及減弱溫室效應氣體的釋放，高直鏈淀粉還是生產(chǎn)光解塑料的最佳原料，用于一次性餐具，是解決日益嚴重的“白色污染”的有效途徑；支鏈淀粉具有更好的薪性，可增加膨化食品的體積，作為食品添加劑具有不同于直鏈淀粉的效果，在黏合劑領域具有較多應用。

在禾谷類胚乳中淀粉的合成是一個多酶催化的復雜過程，主要涉及四大類酶：adp-葡萄糖焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(sss)、淀粉分支酶(sbes)、淀粉去分支酶(dbes)。這四大類酶都包括許多家族成員，各成員又有精細分工，在淀粉合成過程中發(fā)揮不同的作用。直鏈淀粉是由α-1,4糖普鍵連接的線性多聚物，通常只含有很小程度的分支。在正常作物種子中，直鏈淀粉約占儲藏淀粉的20-30％，它對于淀粉顆粒的形成并非必要。淀粉的顆粒結(jié)構主要是由于支鏈淀粉的折疊而形成的。agpase是淀粉合成過程中非常關鍵的酶，因此其對其活性的影響會直接影響到淀粉的合成。淀粉合成酶是通過催化α-1,4-葡聚糖鏈，在adp-葡萄糖上不斷的添加寡聚糖，從而實現(xiàn)葡聚糖鏈的延伸。根據(jù)淀粉體中存在的狀態(tài)，可分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase，gbss)和可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase，sss)。直鏈淀粉主要是由顆粒結(jié)合型淀粉合成酶gbssi負責合成的。淀粉合成酶將adpg(adp-葡萄糖)中的葡萄糖基添加到支鏈淀粉的分支鏈或直鏈淀粉的非還原性末端。淀粉合成酶可分為5個家族：ssi、ssii、ssiii、ssiv和gbss。它們分別延伸支鏈淀粉中不同聚合度的支鏈，或者延伸線性的直鏈淀粉鏈。gbss家族有兩個成員：gbssi和gbssii。gbssi由wx基因編碼，主要負責胚乳和花粉粒中直鏈淀粉的合成。gbssii主要在葉片中表達，負責非儲藏器官中的直鏈淀粉的合成。在玉米、小麥、水稻、馬鈴薯的gbssi缺失突變體中，貯藏器官淀粉粒中僅含有支鏈淀粉組分，幾乎不含有直鏈淀粉成分。gbssi是唯一能夠連續(xù)地延伸直鏈淀粉的淀粉合成酶，生成長的寡糖鏈。多糖鏈的分支通過淀粉分支酶來實現(xiàn)，在淀粉分支酶(sbe)催化作用下，剪切掉多糖鏈內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，釋放還原端，產(chǎn)生一個α-1，6糖苷鍵，結(jié)合上可溶性糖鏈形成分支。sbe在支鏈淀粉合成過程中扮演著不同的角色，由于直鏈淀粉分支較少，sbe在直鏈淀粉的分支過程中也一定起重要作用。淀粉去分支酶的功能是去除一些不規(guī)則的分支。對玉米、水稻和擬南芥的isa酶突變體分析發(fā)現(xiàn)，該酶的突變能直接導致淀粉含量的降低，不正常的淀粉結(jié)構、顆粒形態(tài)和植物糖原的積累，而pul主要在淀粉降解過程中起作用，然而在淀粉合成過程中也起作用，其突變影響淀粉含量和結(jié)構。

綜上，通過基因工程手段培育直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例各不相同的植物對于淀粉工業(yè)化生產(chǎn)是迫切需要的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種基于zmend1a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，以提供一種能夠降低水稻籽粒直鏈淀粉/總淀粉比例，提高支鏈淀粉/總淀粉比例的方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種基于zmend1a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，所述zmend1a基因為下述i)或ii)的dna分子：

i)核苷酸序列如seqidno.1所示的dna分子；

ii)核苷酸序列與seqidno.1至少具有98％同一性且編碼如seqidno.2所示的氨基酸序列的dna分子；

所述方法為：以人工合成或基因克隆方法獲得所述zmend1a基因，構建zmend1a基因過量表達載體，并將過量表達載體導入目的水稻基因組中，得到zmend1a基因過量表達植株，所述過量表達植株籽粒直鏈淀粉含量以及直鏈淀粉/總淀粉比例均低于目的水稻(支鏈淀粉/總淀粉比例高于目的水稻)，相比較目的水稻具有更好的薪性，可應用在食品添加劑或粘合劑等領域。

所述zmend1a基因的獲得方法為基因克隆法，具體步驟包括：提取玉米籽粒胚乳rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以cdna為模板，根據(jù)zmend1a基因序列設計特異性擴增引物，進行pcr擴增。

進一步地，所述特異性擴增引物序列為：

end1a-f：5′-atggacgaggaccggagcgcc-3′

end1a-r：5′-tcgatggttccactgcttttgctgagc-3′

進一步地，所述步驟(2)中，zmend1a基因過量表達載體為多克隆位點區(qū)域依次連接有35s啟動子、zmend1a基因和終止子的pcambia1301植物表達載體。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種基于zmend1a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，該方法利用zmend1a基因?qū)χ参镒蚜５矸酆铣上嚓P基因的負調(diào)控作用，通過基因工程的方法改變水稻籽粒中直鏈淀粉含量和直鏈淀粉/總淀粉比例，獲得具有高支鏈淀粉的轉(zhuǎn)基因水稻新品種，對利用基因工程技術開發(fā)具有特定功能的轉(zhuǎn)基因水稻新品種具有重要的實踐意義。

附圖說明

圖1為peasy-t1載體圖譜；

圖2為pcambia1301載體圖譜；

圖3為zmend1a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒大小和千粒重測定結(jié)果柱狀圖；其中圖3a為水稻籽粒大小測定結(jié)果，圖3b為水稻籽粒千粒重測定結(jié)果；wt為野生型植株，l1-4為過量表達植株；

圖4為zmend1a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量柱狀圖；其中圖4a為直鏈淀粉含量，圖4b為總淀粉含量；wt為野生型植株，l1-6為過量表達植株。

具體實施方式

實施例1

1、材料

本實施例所用方法如無特別說明均為本領域的技術人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。

2、方法

2.1zmend1a基因的獲得

選取玉米b73品種授粉后16天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以玉米胚乳cdna為模板，根據(jù)zmend1a基因序列和玉米b73基因組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合植物表達載體的多克隆位點設計引物end1a–f-1、end1a–r-1，進行pcr擴增，獲得pcr擴增產(chǎn)物。

引物序列為：

end1a–f-1：5′-ggggtaccatggacgaggaccggagcgcc-3′

end1a–r-1：5′-aactgcagtcgatggttccactgcttttgctgagc-3′

pcr反應程序為：98℃，預變性10min；98℃，變性20s；65℃，退火20s；72℃，延伸2min，30個循環(huán)；72℃，復性10min；10℃保存。

將pcr擴增產(chǎn)物用質(zhì)量比為2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段并連接至peasy-t1載體(購于全式金生物技術有限公司，載體圖譜如圖1所示)，獲得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)trans5α細胞中，提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒做模板，以end1a-f-1、end1a-r-1為引物進行pcr擴增驗證，同時用kpni和psti雙酶切質(zhì)粒進行檢測，篩選陽性克隆子，將陽性克隆子送去華大生物公司進行測序，測序結(jié)果使用mega4.0軟件比對，結(jié)果與預測一致。獲得的重組質(zhì)粒命名為t-end1a。

2.2zmend1a基因過量表達載體的構建

以pcambia1301(購于上海捷蘭生物技術有限公司，載體圖譜如圖2所示)為原始載體，在其多克隆位點的ecori和saci酶切位點之間連接一個35s啟動子，并在sphi和hindiii酶切位點之間加上一段nos終止子，獲得改造的載體p1。用kpni和psti雙酶切t-end1a得到小的目的片段，同時用kpni和psti雙酶切p1得到大的目的片段，將上述兩片段使用t4連接酶連接，構建獲得載體p1-zmend1a，作為轉(zhuǎn)水稻的zmend1a基因過量表達載體。

2.3農(nóng)桿菌介導的zmend1a基因過量表達植株的獲得

農(nóng)桿菌介導的過量表達植株的獲得方法及培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基配方參見文獻：methodsinmolecularbiology，vol.343：agrobacteriumprotocols，2/e，volume1，具體包括以下步驟：

2.3.1水稻成熟胚誘導愈傷的獲得

在實驗前，將目的水稻的成熟種子在強太陽光下曬3-4h后對其去殼處理。先用滅菌水洗，水至清，再用75％(質(zhì)量)乙醇浸泡5min，然后用滅菌水、次氯酸和吐溫配制的殺菌水(具體比例：滅菌水：次氯酸＝1：1，總體積：吐溫＝1ml:1ul)浸泡30min，期間不停的搖晃，從而進行表面滅菌，之后用無菌水沖洗，直至水變澄清，再將成熟種子放在滅菌濾紙上吸干水分后，取其于愈傷誘導培養(yǎng)基上，26±1℃培養(yǎng)；10-15d后，將誘導出的乳黃色愈傷轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。每兩周繼代培養(yǎng)一次，繼代兩次后挑選繼代培養(yǎng)5-7d，將色澤淡黃的愈傷用于共培養(yǎng)。

2.3.2用于轉(zhuǎn)化水稻的農(nóng)桿菌菌液的準備

將p1-zmend1a轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404中，獲得重組農(nóng)桿菌lba4404/p1-zmend1a。將重組農(nóng)桿菌lba4404/p1-zmend1a接種于yep液體培養(yǎng)基(含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6-1.0；室溫下5000rpm離心5min收集菌體，隨后將其懸浮于液體共培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至od600＝0.4，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。

2.3.3農(nóng)桿菌侵染水稻營養(yǎng)器官

挑選色澤鮮嫩、呈乳黃的愈傷，集中放入100ml無菌三角瓶中，加入上述制備好的農(nóng)桿菌懸浮液(懸浮液以淹沒愈傷為好)；28℃，220rpm搖床上培養(yǎng)20-30min；倒掉菌液，將侵染后的愈傷置于含無菌濾紙的培養(yǎng)皿上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3d。

2.3.4選擇培養(yǎng)

將共培的愈傷先用滅菌水清洗直至水變澄清，棄去清洗液，轉(zhuǎn)入含有羧芐青霉素(100mg/ml)的溶液中振蕩清洗30min以上，用無菌濾紙吸干，置于含無菌濾紙的培養(yǎng)皿中干燥處理；再將愈傷挑選到含有羧芐青霉素(500mg/ml)和潮霉素(50mg/l)篩選培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)30d左右，直至長出新的抗性愈傷。

2.3.5抗性愈傷的分化

從篩選培養(yǎng)基上挑選長勢較好呈乳黃色的新愈傷于含有50mg/l潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先28℃暗培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)移到30℃條件下進行全光照培養(yǎng)，15-30d，有綠點出現(xiàn)；30-40d后會分化出幼苗。

2.3.6生根、壯苗和移栽

待分化出的幼苗h≥3cm時，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周；選擇h≥15cm、根系發(fā)達的幼苗，加水室溫下煉苗2-3d后，用溫水洗去培養(yǎng)基，移入含水稻培養(yǎng)土的水桶中栽培。待苗生長健壯后移入水田中生長，共計31株獨立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻苗。

2.4轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

為了檢測轉(zhuǎn)基因水稻，以提取的轉(zhuǎn)基因水稻總dna為模板，用目的基因zmend1a片段和潮霉素基因為檢測對象，設計引物，進行pcr擴增，用以初步鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

檢測目的基因zmend1a片段的引物：

end1a–f-2：5’-gccttcagcaactatcagagcctacc-3’

end1a–r-2：5’-cgaactttacgctcaagctcaccc-3’

pcr反應條件為：94℃預變性10min；94℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃總延伸6min。

檢測潮霉素基因的引物：

hyg-f：5’-taggagggcgtggatatggc-3’

hyg-r：5’-tacacagccatcggtccaga-3’

pcr反應程序為：94℃預變性10min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，34個循環(huán)；72℃總延伸10min。

結(jié)果，31株獨立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻苗中有29株同時擴增出目的基因zmend1a片段和潮霉素基因，將該29株植株進行southern雜交，均驗證通過，即獲得了29株t0代轉(zhuǎn)基因植株，命名為l1-29。t0代轉(zhuǎn)基因植株成熟后，收獲t1代種子，t1代種子自交繁殖得到t2代種子。依次類推，獲得zmend1a基因過量表達的轉(zhuǎn)基因水稻株系。

2.5zmend1a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒大小和千粒重測定

選取三株轉(zhuǎn)基因株l1、l2、l3的t3代籽粒進行大小和千粒重測量。籽粒大小使用游標卡尺單粒逐個測量，三個獨立轉(zhuǎn)化株其t3代籽粒分別選取了1000粒，分部對籽粒長、寬以及厚度進行測定，實驗至少三次重復；千粒重使用電子天平，每百粒計數(shù)稱重，三個獨立轉(zhuǎn)化株其t3代籽粒分別選取10個100粒計重，相加數(shù)即為千粒重量，三個重復。

實驗以野生型中花11為對照，實驗結(jié)果見圖3，三株轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的長度和厚度幾乎不變，但籽粒的寬度明顯變窄(圖3a)，相應的千粒重明顯降低(圖3b)。說明zmend1a基因的轉(zhuǎn)入對水稻籽粒的寬度產(chǎn)生明顯影響。

2.6zmend1a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量測定

取6株獨立轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)基因株l1、l2、l3、l4、l5、l6的t3代籽粒進行直鏈淀粉和總淀粉測定，并以野生型目的玉米籽粒做對照，每次實驗測定至少重復三次，測定方法如下：

直鏈淀粉測定時，首先對籽粒中淀粉進行提純，將烘干去硬殼和胚的種子在室溫下用0.4％(質(zhì)量分數(shù))的naoh溶液浸泡48h，料液(樣本比0.4％的naoh溶液)比為1:3，洗滌后再用0.4％的naoh溶液浸泡24h，反復水洗至種子表面不再黏滑為止，瀝干水分，用膠體磨粉碎，淀粉乳過篩(200目)，離心(3000r/min,20min)，取下層白色沉淀,即為淀粉,將淀粉反復漂洗離心，40℃鼓風干燥，粉碎，過篩(200目)，即得淀粉純品，用于直鏈淀粉的測定。直鏈淀粉的測定采用愛爾蘭megazyme公司生產(chǎn)的直鏈淀粉/支鏈淀粉分析試劑盒(貨號：k-amyl)，測定方法可參見試劑盒說明書，在此不做詳細描述。

總淀粉測定時，先將烘干的種子去硬殼和胚，再使用組織研磨儀將其研磨成粉末，40℃過夜烘干，過0.5mm篩(35目)。總淀粉測定采用愛爾蘭megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉測定試劑盒(貨號：k-tsta)，具體為：將研磨后樣品(準確稱量～100mg)加入到試管中(16×120mm)，確保全部樣品位于試管底部；加入0.2ml乙醇溶液(80％v/v)，用漩渦混合器混合；放入攪拌架子，加入2ml的2mol/l的koh至每個試管中，冰水混合浴中攪拌20min左右，重懸粉末和溶解抗性淀粉(注意：不要使用渦旋儀混勻，會使淀粉乳化，確保加入koh時，試管處于劇烈震蕩狀態(tài)。這是為了避免淀粉形成團塊難以溶解)；當試管在磁力攪拌器上攪拌時，加入8ml的1.2mol/l醋酸鈉緩沖液(ph3.8)至每個試管。立即加入0.1ml耐熱α-淀粉酶(試劑盒配置溶液)和0.1ml淀粉葡糖苷酶(試劑盒配置溶液)，充分混合，在50℃下孵育；孵育30min，間斷混勻；樣品淀粉含量>10％：將全部的溶液轉(zhuǎn)移到100ml的容量瓶中,用洗瓶沖洗試管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸餾水調(diào)整溶液體積至100ml,充分混勻。取部分溶液離心(1800rpm,10min)；轉(zhuǎn)移兩份稀釋的樣品溶液(0.1ml)到圓底試管中(16×100mm)；加入3.0mlgopod溶液(試劑盒配置溶液)到每一個試管中(包括葡萄糖對照和試劑空白對照),然后在50℃下孵育20min；葡萄糖對照包括0.1ml葡萄糖標準溶液(1mg/ml)+3.0mlgopod溶液。試劑空白對照：0.1ml蒸餾水+3.0ml的gopod溶液；相對于試劑空白在510nm下測定每一個樣品和葡萄糖質(zhì)控的吸光度。計算公式如下：

δa＝相對于試劑空白所讀取的吸光度；fv＝總體積(例如100ml或10ml)；0.1＝樣品分析體積；1/1000＝轉(zhuǎn)化從μg至mg；100/w＝淀粉作為干粉重量的比例；w＝干粉重量；162/180＝d葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫氫葡萄糖；淀粉％(占干物質(zhì)比重)＝淀粉％×100/100-水分含量(％)。

結(jié)果如圖4所示,圖中可以看出，zmend1a基因過表達植株的籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量都有所降低，其中直鏈淀粉含量降低幅度在16.87％-29.81％(圖4a)，總淀粉含量降低幅度為1.86％-6.96％(圖4b)，直鏈淀粉含量降低幅度顯著高于總淀粉含量降低幅度，直鏈淀粉/總淀粉比例下降，支鏈淀粉/總淀粉比例上調(diào)。

以上為本發(fā)明一種詳細的實施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，但本發(fā)明的保護范圍不限于上述的實施例。

sequencelisting

<110>安徽農(nóng)業(yè)大學

<120>一種基于zmend1a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和淀粉含量的方法

<130>/

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caacgcgcttggagccccggtgataacagcgacaacgaggctgagagctgggcggtcagt720

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