本發(fā)明涉及菊苣酸在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紫錐菊又名紫錐花、紫松果菊，為多年生草本植物，菊科松果菊屬。上個世紀(jì)70年代，紫錐菊引入我國，作為觀賞性植物栽培；90年代，肖培根院士首先將紫錐菊作為免疫調(diào)節(jié)劑介紹到國內(nèi)，國內(nèi)各地開始將其作為藥用植物引種，并逐漸投入gap標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，從而保證研究與開發(fā)的原料安全問題。近年來國內(nèi)已有數(shù)種紫錐菊制劑得到開發(fā)并應(yīng)用于臨床，如“金屏風(fēng)膠囊”(浙江正大青春寶藥業(yè)有限公司)、“紫黃精”(成都地奧制藥集團(tuán)有限公司)等，均為紫錐菊與補(bǔ)氣中藥黃芪的復(fù)方制劑。

紫錐菊的應(yīng)用非常廣泛，主要用途有提高機(jī)體免疫水平、抗炎、清除氧自由基以抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等。國外對紫錐菊抗病毒作用的研究中，wacker采用小鼠l-929細(xì)胞培養(yǎng)的方法證實(shí)紫錐菊提取物能間接的抑制流感病毒、皰疹病毒與水泡性口炎病毒的活性；may發(fā)現(xiàn)松果菊的水提取物可明顯抑制流感病毒、皰疹病毒與脊髓灰質(zhì)炎病毒活性。目前，國內(nèi)對紫錐菊抗病毒作用的研究還處在起步階段，文獻(xiàn)報(bào)道多集中在畜牧業(yè)。馮善祥考察了紫錐菊復(fù)合物對感染雞新城疫病毒雛雞、人工感染傳染性法氏囊病毒雛雞的保護(hù)作用，并指出紫錐菊復(fù)合物可用于雞新城疫、雞傳染性法氏囊的預(yù)防以及治療。在細(xì)胞水平上，紫錐菊復(fù)方制劑對ndv有明顯的抑制作用，效果優(yōu)于紫錐菊。

在紫錐菊的抗病毒研究中，已證實(shí)其提取物對流感病毒、柯薩奇b族病毒、皰疹病毒、hsv-ⅱ引起的細(xì)胞病變具有不同程度的抑制作用，對ard3、ard7、副流感病毒、echo11及hsv-ⅰ等的體外實(shí)驗(yàn)則無明顯效果。目前我國對引種紫錐菊藥理活性的研究還局限在刺激免疫水平方面，人用抗病毒制劑尚未全面開發(fā)。在實(shí)現(xiàn)將紫錐菊用于人類病毒性疾病的治療過程中，仍然有藥材標(biāo)準(zhǔn)缺失、抗病毒活性成分不詳、抗病毒作用機(jī)理及靶點(diǎn)不清等問題橫亙眼前。因此對紫錐菊進(jìn)行全面質(zhì)量評價研究及藥理活性研究是其在我國得到全面開發(fā)應(yīng)用的前提。

紫錐菊作為一種良好的免疫促進(jìn)草藥，其化學(xué)成分及成分活性已有較多報(bào)道。目前在紫錐菊屬植物及其制劑的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)研究中，已分離出咖啡酸類衍生物、烷基酰胺類、多糖類、揮發(fā)油類、生物堿、黃酮、多炔類及其它類化學(xué)成分等。菊苣酸是紫錐菊中極為重要的免疫活性成分之一，近年來的藥理研究表明，菊苣酸具有增強(qiáng)免疫功能和抗炎作用，并能抑制透明質(zhì)酸酶，保護(hù)膠原蛋白免受可導(dǎo)致降解的自由基的影響?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未見到關(guān)于菊苣酸在抗呼吸道合胞病毒方面的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)了菊苣酸的新用途——在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的發(fā)明人應(yīng)用中藥化學(xué)方法對植物紫錐菊中的抗病毒成分進(jìn)行篩選，并通過體外抗病毒藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了最佳抗病毒活性成分——菊苣酸，并發(fā)現(xiàn)菊苣酸對呼吸道合胞病毒(rsv)的體外抗病毒活性最強(qiáng)，優(yōu)于對照藥利巴韋林，因此，可以以菊苣酸為活性成分用于制備抗呼吸道合胞病毒的藥物，具體應(yīng)用時，可適量添加藥劑學(xué)上可接受的基質(zhì)或輔料，也可以與適當(dāng)?shù)乃幬锫?lián)合應(yīng)用。

紫錐菊中藥物活性成分復(fù)雜，有咖啡酸類衍生物、烷基酰胺類、多糖類、揮發(fā)油類、生物堿、黃酮、多炔類及其它類化學(xué)成分等，本發(fā)明不但發(fā)現(xiàn)了紫錐菊提取物對呼吸道合胞病毒有抑制作用，還明確了菊苣酸為體外抗呼吸道合胞病毒的有效成分，對紫錐菊的抗病毒研究、紫錐菊成方制劑的進(jìn)一步研究等具有重要意義。

附圖說明

圖1：：正常細(xì)胞及病毒病變細(xì)胞，其中，a：正常vero細(xì)胞(4×40)；b：hsv-ⅰ病毒病變(4×10)；c：正常vero細(xì)胞(4×10)；d：rsv病毒病變(4×10)；e：正常rd細(xì)胞(4×10)；f：ev71病毒病變(4×10)。

圖2：紫錐菊體外抗病毒譜的篩選結(jié)果柱狀圖。

圖3：紫錐菊提取方法優(yōu)化結(jié)果柱狀圖。

圖4：紫錐菊水提物d101型大孔樹脂洗脫物抗病毒結(jié)果柱狀圖。

圖5：d101大孔樹脂柱分離樣品pad監(jiān)測圖。

圖6：d101大孔樹脂柱分離有效部位液相色譜圖。

圖7：快速制備化合物高效液相檢測色譜圖。

圖8：菊苣酸對照品裂解碎片信息。

圖9：制備純品化合物裂解碎片信息。

圖10：紫錐菊制備純品抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。

實(shí)驗(yàn)一紫錐菊體外抗病毒譜的篩選

1.實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1藥品紫錐菊干燥地上部分藥材購自安徽省桐城市維慶藥用植物有限公司，粉碎機(jī)粉碎，備用；利巴韋林注射液(齊魯制藥有限公司，規(guī)格為50mg/ml，批號：1501166141)。

1.2細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(vero，為hsv-ⅰ、rsv的敏感細(xì)胞株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存)；橫紋肌瘤細(xì)胞(rd，為ev71的敏感細(xì)胞株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.3病毒毒種hsv-?。篺株，1996年引自山東醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；rsv：long株，2000年10月引自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室，本科室保存；ev71，分離自濟(jì)南市兒童醫(yī)院icu病房病死患兒(genbank登記號：hq825317)。

1.4試劑正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、二甲基亞砜(天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，均為分析純)；細(xì)胞培養(yǎng)液(1640細(xì)胞培養(yǎng)液，gibco產(chǎn)品，含11％新生牛血清及100u/ml青霉素和鏈霉素，置4℃?zhèn)溆?；細(xì)胞維持液(1640細(xì)胞培養(yǎng)液，gibco產(chǎn)品，含2％新生牛血清及100u/ml青霉素和鏈霉素)；pbs(ph7.2，含nacl8g、kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo42.9g，加雙蒸水至1000ml，過濾除菌，分裝置4℃?zhèn)溆?；細(xì)胞消化液(0.25％胰酶，macgene公司產(chǎn)品，分裝至青霉素瓶，置-20℃冰箱備用)。

1.5儀器co2恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司產(chǎn)品)；生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西公司產(chǎn)品)；超凈工作臺(濟(jì)南隆宏凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；雙人雙面凈化工作臺(蘇州凈化儀器廠)；倒置顯微鏡(olympus公司產(chǎn)品)；臺式自動平衡離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)有限公司)；離心機(jī)(賀立氏臺式低溫離心機(jī))；超低溫冰箱(－80℃，725型，thermoforma公司)；低溫冰箱(－40℃，日本三洋公司；–20℃，中科美菱公司產(chǎn)品；4℃，海爾兄弟公司產(chǎn)品)；液氮罐(四川液氮罐廠產(chǎn)品)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國gibco公司產(chǎn)品)；除菌針頭濾器(美國頗爾公司pallcorporation，孔徑：0.22μm，直徑13mm)；移液器(德國eppendorf產(chǎn)品，型號：20-200μl；100-1000μl)；移液器吸頭(德國eppendorf產(chǎn)品，與移液器配套)；超聲振蕩清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，fw-100)；水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司，gfl-230)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1制備不同極性溶劑紫錐菊提取物

取紫錐菊藥材粉末40g，加入8倍量的蒸餾水進(jìn)行煎煮2h，抽濾；取過濾后藥渣加同樣量蒸餾水繼續(xù)煎煮2h，抽濾；將兩次濾液合并，水浴揮干。分別更換80％乙醇、100％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇重復(fù)上述工藝步驟，制備紫錐菊不同極性部位提取物。水提物以細(xì)胞維持液溶解，其它提取物以dmso溶解，0.22μm濾頭過濾除菌，備用。

取紫錐菊粉末40g，加8倍量的50％丙酮超聲提取1h，抽濾，濾渣再加8倍量50％丙酮重復(fù)超聲1h，抽濾；兩次濾液合并，水浴揮干，用dmso溶解適量，0.22μm濾頭過濾除菌，備用。

2.2不同極性溶劑紫錐菊提取物體外抗病毒實(shí)驗(yàn)

2.2.1細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代

從液氮中取出凍存的vero、rd細(xì)胞，均投放于37℃溫水中迅速搖晃，在1min內(nèi)迅速解凍。800rpm離心5min，棄去上清液，使用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。2d后細(xì)胞長成單層，0.25％胰酶消化并1:2傳代，至細(xì)胞長成單層時可用于試驗(yàn)。

2.2.2病毒的擴(kuò)增

取上述已長至單層的細(xì)胞，棄去上清液，將存放于-80℃條件下的hsv-ⅰ、rsv、ev71病毒解凍后分別接種于對應(yīng)的敏感細(xì)胞上。于35℃，5％co2條件下的培養(yǎng)箱中孵育1h，取出加入細(xì)胞維持液后，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。逐日鏡下觀察細(xì)胞病變(cytopathiceffect,cpe)，當(dāng)cpe達(dá)到90％，于超低溫冰箱反復(fù)凍融3次，吹打離心(20000r/min，15min)，取上清分裝，做好標(biāo)記，–40℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3病毒毒力的測定

用細(xì)胞維持液將單純皰疹ⅰ型病毒液、呼吸道合胞病毒液做10倍比系列稀釋，橫向依次接種在96孔板內(nèi)長成單層的vero細(xì)胞上，縱向重復(fù)3孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照，置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用同樣方法取ev71病毒液做十倍比系稀釋后，種在長成單層的rd細(xì)胞上。48h后倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞出現(xiàn)病變，視為病毒毒性，終止培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞病變率。

運(yùn)用reed-muench兩氏法，即公式(1)、(2)，計(jì)算各病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量tcid50(50％tissuecultureinfectivedose)。

公式(2)········tcid50＝antilog(logc+pd×logcm)

其中：pd＝細(xì)胞比距；p1＝高于50％病變百分?jǐn)?shù)；p2＝低于50％病變百分?jǐn)?shù)；c＝高于50％病變率的稀釋度；cm＝倍比稀釋系數(shù)。

2.2.4藥物細(xì)胞毒性的測定

取2.1項(xiàng)下備用不同極性提取物適量，用細(xì)胞維持液做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，分別加樣于96孔板中已經(jīng)長成單層的vero、rd細(xì)胞上，各稀釋度縱向重復(fù)3孔，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后顯微鏡下觀察病變情況，待病毒對照病變率達(dá)到90％，終止培養(yǎng)，觀察并記錄每種提取物的細(xì)胞病變(cpe)百分率，應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)，并確定最大無毒濃度(tc0)。

2.2.5藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響

取2.1項(xiàng)下備用的不同極性提取物用細(xì)胞維持液做2倍比系列，稀釋共12個稀釋度，分別按100μl/孔依次加樣于96孔板內(nèi)的單層rd、vero細(xì)胞上，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)利巴韋林注射液原液為陽性對照，并設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照。除細(xì)胞對照加100μl細(xì)胞維持液外，各孔加2.2.3項(xiàng)下測得tcid50濃度的病毒液100μl。置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90％細(xì)胞病變后終止培養(yǎng)。鏡下觀察其cpe。應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(ec50)(concentrationfor50％ofmaximaleffect,ec50)。根據(jù)2.2.4項(xiàng)下的藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)及藥物半數(shù)有效濃度(ec50)，計(jì)算藥物的抑毒指數(shù)(ti)。

公式(3)…tc50＝[antilog(log高于50％病變率藥物稀釋度值-pd)]×初始濃度

細(xì)胞存活率大于50％最后一個濃度為ec50

公式(4)…ec50＝[antilog(log高于50％存活率藥物稀釋度值-pd)]×初始濃度

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1病毒毒力測定的結(jié)果

觀察病毒所致細(xì)胞的病變情況，按reed·muench法計(jì)算hsv-ⅰ型病毒(f株)的tcid50＝10^-3.33/100μl，rsv病毒株的tcid50為10^-2.50/100μl，ev71病毒株的tcid50為10^-4.33/100μl。

3.2藥物對病毒的抑制作用結(jié)果

結(jié)果如圖1所示。通過記錄的cpe百分率，應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)及藥物半數(shù)有效濃度(ec50)，并確定抑毒指數(shù)(ti＝tc50/ec50)。結(jié)果見表1、圖2。

表1紫錐菊體外抗病毒譜的篩選結(jié)果

注:—表示無效，ti值大于4視為有效。

4.討論

本實(shí)驗(yàn)同時考察了紫錐菊不同極性部位對hsv-ⅰ、rsv、ev71所致細(xì)胞病變的效果，使抗病毒譜的結(jié)果更加準(zhǔn)確全面。結(jié)果表明，紫錐菊不同提取物對hsv-ⅰ、rsv、ev71所致細(xì)胞病變均有不同程度的抑制作用。通過檢測紫錐菊不同極性提取物對hsv-ⅰ、rsv、ev71的抗病毒效果發(fā)現(xiàn)，80％醇回流、水煎煮部位對三種病毒均有較好的抑制活性。通過比較各有效ti值發(fā)現(xiàn)，80％醇回流部位對rsv、ev71的抑制效果、水煎煮部位對hsv、rsv、ev71的抑制效果均大于陽性對照藥利巴韋林的抗病毒效果。本課題的目的是尋找紫錐菊的抗病毒有效成分，且水煎煮部位對抗rsv的效果最佳(ti值已達(dá)到196，遠(yuǎn)大于陽性對照的31)，因此選擇紫錐菊水部位對rsv的效果作為跟蹤依據(jù)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)方向。

實(shí)驗(yàn)二紫錐菊提取方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)一中已明確紫錐菊的水煎煮部位對rsv所致細(xì)胞病變比其他極性部位有更好的抑制效果，因此在水提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化以確定一個更好的提取方案。

由于本研究的主要目的為定性，因此僅選擇對提取效果影響較大的溫度作為考察因素，分別設(shè)水煎煮提取與水超聲提取兩種提取方法，通過體外實(shí)驗(yàn)考察溫度因素對提取效果的影響，從而確定最佳提取方案。

1實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1藥品紫錐菊干燥地上部分藥材購自安徽省桐城市維慶藥用植物有限公司，粉碎機(jī)粉碎，備用；利巴韋林注射液(齊魯制藥有限公司，規(guī)格為50mg/ml，批號1501166141)。

1.2細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(vero，rsv的敏感細(xì)胞株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3病毒毒種rsv：long株，2000年10月引自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室，本科室保存。

1.4試劑蒸餾水；細(xì)胞培養(yǎng)液(1640細(xì)胞培養(yǎng)液，gibco產(chǎn)品，含11％新生牛血清及100u/ml青霉素和鏈霉素，置4℃?zhèn)溆?；細(xì)胞維持液(1640細(xì)胞培養(yǎng)液，gibco產(chǎn)品，含2％新生牛血清及100u/ml青霉素和鏈霉素)；pbs(ph7.2，含nacl8g、kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo42.9g，加雙蒸水至1000ml，過濾除菌，分裝置4℃?zhèn)溆?；細(xì)胞消化液(0.25％胰酶，macgene公司產(chǎn)品，分裝至青霉素瓶，置-20℃冰箱備用)。

1.5儀器同實(shí)驗(yàn)一。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1不同極性紫錐菊提取物的提取

(1)水超聲提取法取紫錐菊粉末40g，加8倍量的蒸餾水超聲提取2h，抽濾；濾渣再加8倍量蒸餾水重復(fù)提取，抽濾；兩次濾液合并，100℃水浴揮干，細(xì)胞維持液溶解適量，0.22μm濾頭過濾除菌，備用。

(2)水煎煮提取法取紫錐菊藥材粉末40g，加入8倍量的蒸餾水進(jìn)行煎煮2h，抽濾；取過濾后藥渣加同樣量蒸餾水繼續(xù)煎煮2h，抽濾；將兩次濾液合并，水浴揮干。以細(xì)胞維持液溶解適量，0.22μm濾頭過濾除菌，備用。

2.2體外抗病毒實(shí)驗(yàn)

2.2.1藥物細(xì)胞毒性的測定

取紫錐菊水超聲提取物、水煎煮提取物適量，用細(xì)胞維持液做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，加樣于多孔板中已經(jīng)長成單層的vero細(xì)胞上，每個稀釋度重復(fù)3孔，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后顯微鏡下觀察病變情況，待病毒對照病變率達(dá)到90％，終止培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞病變(cpe)百分率，應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)，并確定最大無毒濃度(tc0)。

2.2.2藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響

取紫錐菊水煎煮提取物、水超聲提取物用細(xì)胞維持液做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，依次加入96孔板內(nèi)的單層vero細(xì)胞上(100μl/孔)，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)利巴韋林注射液原液為陽性對照，并設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照。除細(xì)胞對照加100μl維持液外，各孔加100個tcid50的病毒100μl。置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90％細(xì)胞病變后終止培養(yǎng)。鏡下觀察并記錄其cpe。應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(ec50)(concentrationfor50％ofmaximaleffect,ec50)。根據(jù)上述藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)及藥物半數(shù)有效濃度(ec50)，計(jì)算藥物抑毒指數(shù)(ti)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2、圖3)。

表2紫錐菊提取方法優(yōu)化結(jié)果

4.討論

溫度會影響受熱易變性成分的溶出效率，實(shí)驗(yàn)中的兩種提取方法主要考察溫度因素對活性成分提取效率的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水煎煮提取的抑毒指數(shù)大于水超聲提取的抑毒指數(shù)，同時水提取物的效果遠(yuǎn)大于陽性對照藥利巴韋林的效果。由此得出結(jié)論：抑制rsv所致細(xì)胞病變的有效成分在加熱條件下仍有存在，且高溫條件有利于其溶出，因此確定水煎煮提取法為最終的提取方法。

實(shí)驗(yàn)三紫錐菊抗病毒有效部位的分離與純化

大孔吸附樹脂的應(yīng)用出現(xiàn)在二十世紀(jì)六十年代，是繼離子交換法之后的又一分離純化方法，七十年代開始應(yīng)用于中藥的分離純化。大孔吸附樹脂通過分子間作用力、氫鍵的吸附作用及多孔結(jié)構(gòu)的分子篩作用發(fā)揮作用，待分離物質(zhì)因吸附力及分子量大小的差異在洗脫過程中達(dá)到分離與純化的目的。按其極性大小和所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三種類型，對各種不同極性的藥物均具有較好的分離效果。d101型大孔吸附樹脂是苯乙稀型非極性共聚體，是一種多孔海綿狀結(jié)構(gòu)的人工合成的聚合物吸附劑，適用范圍比較廣譜。

紫錐菊的水溶性部位主要為咖啡酸類衍生物、多糖類、蛋白質(zhì)等大極性物質(zhì)，成分種類繁多且極性相近，分離難度較大。已有文獻(xiàn)報(bào)道，咖啡酸衍生物類為紫錐菊重要的刺激機(jī)體免疫力的活性成分，在擬將其作為目標(biāo)組分的情況下，選擇d101型大孔吸附樹脂，能將大極性成分快速洗脫下來，做到有效物質(zhì)少損失，從而達(dá)到較理想的分離純化目的。

1實(shí)驗(yàn)儀器與材料

乙醇(天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，分析純)；d101型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；玻璃層析柱(φ4.5×85cm)。其余儀器與材料同實(shí)驗(yàn)二。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品溶液制備

取紫錐菊粉末50g，加入8倍量的蒸餾水進(jìn)行煎煮2h，抽濾；取過濾后藥渣加同樣量蒸餾水繼續(xù)煎煮2h，抽濾；將兩次濾液合并，100℃水浴揮干。取上述水煎煮提取物超聲溶于400ml水中，備用

2.2大孔樹脂的預(yù)處理

取一定量的d101型大孔吸附樹脂，用100％乙醇浸泡24h，充分溶脹后的體積約為1l。取潔凈的玻璃層析柱(φ4.5×85cm)，濕法裝柱，至樹脂高度約為柱高的2/3處，用乙醇進(jìn)行沖洗。隨時檢測柱下端流出液體，即將液體與水按1:5混合，若混合后所得溶液澄清透明時，改用蒸餾水沖洗，至柱中流出的液體無乙醇味，靜置樹脂柱床備用。

2.3上樣

將2.1中的樣品溶液用玻璃棒緩慢引流上樣于處理好的的大孔樹脂柱中，打開層析柱下端的閥門，讓樣品溶液緩緩流動，最后保持液面高出樹脂柱床2～3cm處，關(guān)閉閥門，靜置12小時。

2.4洗脫

依次用水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇進(jìn)行梯度洗脫?？刂屏鞒鲆毫鞒鏊俣燃s為1滴/秒，每200ml收集為一段，每個洗脫梯度沖至無色換下一個梯度。將洗脫液按收集順序編號，并分別水浴蒸干，備用。

2.5體外抗病毒實(shí)驗(yàn)

2.5.1藥物細(xì)胞毒性的測定

取紫錐菊大孔樹脂洗脫物適量，分別用細(xì)胞維持液溶解，并做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，加樣于96孔板中已經(jīng)長成單層的vero細(xì)胞上，每個稀釋度縱向重復(fù)3孔，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后顯微鏡下觀察病變情況，待病毒對照的病變率達(dá)到90％，終止培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞病變(cpe)百分率，應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)。

2.5.2藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響

取紫錐菊大孔樹脂洗脫物溶解并用細(xì)胞維持液做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，依次加樣于96孔板內(nèi)的單層vero細(xì)胞上(100μl/孔)，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)利巴韋林注射液原液為陽性對照，并設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照。除細(xì)胞對照加100μl維持液外，各孔加100個tcid50的rsv病毒液100μl。置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90％細(xì)胞病變后終止培養(yǎng)。鏡下觀察并記錄其cpe。應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(ec50)(concentrationfor50％ofmaximaleffect,ec50)。根據(jù)上述藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)及藥物半數(shù)有效濃度(ec50)，計(jì)算藥物抑毒指數(shù)(ti)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表3、圖4)

表3紫錐菊水提物d101型大孔樹脂洗脫物的抗病毒作用結(jié)果

4.討論

在洗脫過程中，為保證成分不損失，最初流出、未被大孔樹脂吸附部分也等體積分段收集；收集過程中設(shè)200ml為一個收集體，以保證更好的分離效果。表3中的洗脫物序號為抗病毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，按順序?qū)⑾噜徥畟€效果相近的收集段合并的結(jié)果。

圖表中結(jié)果顯示，水2、水3、水4、水5、水6的抑毒指數(shù)大于d101型大孔樹脂分離純化前的抑毒指數(shù)(ti＝235)，并且仍然優(yōu)于利巴韋林(ti＝32)，說明用d101大孔吸附樹脂作為紫錐菊水煎煮提取物的分離純化方法切實(shí)可行。

縱觀本部分體外抗呼吸道合胞病毒結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基本各洗脫部位的抗病毒效果均優(yōu)于利巴韋林，針對這種情況有兩種猜想：①本實(shí)驗(yàn)所采用的分離純化方法對活性成分的富集效果不理想；②紫錐菊中有多種抗呼吸道合胞病毒活性成分，并且強(qiáng)活性成分主要集中在大極性的水部位。本實(shí)驗(yàn)無論符合哪種猜想，均說明，除優(yōu)選出的效果集中部位外，其它洗脫部位仍有繼續(xù)開發(fā)的價值，不可忽視。

實(shí)驗(yàn)四紫錐菊抗病毒有效成分的分析及結(jié)構(gòu)鑒定

1實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1藥品取實(shí)驗(yàn)三中水2、水3、水4、水5、水6合并，4000rpm離心15min，上清、沉淀分別100℃水浴揮干，備用。

1.2試劑乙醇、乙酸丁酯、甲酸、磷酸(天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，分析純)；乙腈(tediacompany，禹王集團(tuán)，色譜純)；

1.3儀器pad紫外檢測器；高效液相色譜儀；agilent1260系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，配有在線脫氣機(jī)，四元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器)；agilent6230tof質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源，masshunlerdataacquisition在線工作站和qualiatiseanalysis離線分析軟件)；cheetahtmmp100中壓快速純化制備系統(tǒng)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。余同實(shí)驗(yàn)三。

2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1檢測波長的選擇

取本實(shí)驗(yàn)1.1中離心上清樣品適量，用蒸餾水稀釋至接近無色，經(jīng)pad紫外檢測器全波長掃描，結(jié)果如圖5。

由圖5可知，pad的監(jiān)測波長范圍為200～500，樣品的最大吸收波長為330nm，將其作為應(yīng)用高效液相分析的參考條件。

2.2高效液相色譜檢測

2.2.1樣品處理取本章中離心上清樣品適量，超聲溶于超純水，0.45μm微孔濾膜濾過，得供試樣品，備用。

2.2.2色譜條件

查閱文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)摸索，確定樣品的hplc檢測條件為：syncronisc18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫35℃；流速1ml/min；檢測波長330nm；進(jìn)樣量20μl；流動相條件乙腈(a)-0.3％磷酸溶液(b)＝10(a)：90(b)，等度洗脫。

2.2.3hplc檢測結(jié)果

由圖6可知，d101大孔吸附樹脂分離所得樣品在2.2.2色譜條件下分離結(jié)果成分簡單，分離度好，因此將此樣品在半制備液相繼續(xù)純化精制。

2.3中壓快速制備色譜條件

本實(shí)驗(yàn)采用sq230020-0flash球形aqc18(球形20～35μm，20g)色譜柱，在中壓快速制備液相上，以乙腈-0.3％磷酸作為流動相；流速：15ml/min；柱溫：室溫；收集波長：325nm。

表4快速制備液相的洗脫梯度

2.4化合物的制備

稱取1.1中的上清樣品0.0972g，于1ml蒸餾水中超聲溶解，進(jìn)樣。按2.3項(xiàng)下的快速制備色譜條件制備，按峰收集制備產(chǎn)物，并編號。

將制備產(chǎn)物分別過0.45μm微孔濾膜，按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣高效液相色譜進(jìn)行檢測，得單峰物質(zhì)，見圖7。

根據(jù)高效液相色譜檢測結(jié)果，合并譜圖相同組分，40℃恒溫水浴揮干，得白色針狀結(jié)晶。2.5化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

菊苣酸對照品：esi-ms:492.1135[m+h2o]⁺，分子量374.1，分子式為c22h18o12。裂解電壓為100v時的碎片：135.0431,163.0384,224.1249,295.0446,325.0710,391.2831,492.1139,619.1109,767.1069,841.0523,922.0092,966.1917,1109.1847；裂解電壓為200v時的裂解碎片有：135.0441,163.0390,295.0454,378.9861,492.1132,569.0255,691.0268,767.1098,841.0469,922.0094,966.1924,1109.1796。如圖8所示。

相同實(shí)驗(yàn)條件下，所得純品化合物的離解碎片：裂解電壓為100v時，碎片有：163.0389,224.1273,295.0450,325.0694,391.2831,457.0759,492.1135,619.1061,731.1020,841.0503,922.0093,966.1908,1111.1960；裂解電壓為200v時，碎片有：135.0441,163.0392,295.0469,378.9877,492.1126,619.1096,731.1036,841.0484,922.0099,966.1929,1111.1909。如圖9所示。與菊苣酸對照品的離解碎片基本一致，故可判斷所得到的白色針狀結(jié)晶為菊苣酸。

3純品化合物的體外藥效實(shí)驗(yàn)

3.1藥物細(xì)胞毒性的測定

取制備純品，用細(xì)胞維持液溶解，過0.45μm微孔濾膜，做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，加樣于多孔板中已經(jīng)長成單層的vero細(xì)胞上，每個稀釋度重復(fù)3孔，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后顯微鏡下觀察病變情況，待病毒對照的病變率達(dá)到90％，終止培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞病變(cpe)百分率，應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)。3.2藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響

取1.1中的上清樣品及制備純品適量，用細(xì)胞維持液溶解，過0.45μm微孔濾膜，用細(xì)胞維持液溶解并做2倍比系列稀釋，共12個稀釋度，依次加樣于96孔板內(nèi)的單層vero細(xì)胞上(100μl/孔)，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)利巴韋林注射液原液為陽性對照，并設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照。除細(xì)胞對照加100μl維持液外，各孔加100個tcid50的rsv病毒液100μl。置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90％細(xì)胞病變后終止培養(yǎng)。鏡下觀察并記錄其cpe。應(yīng)用reed-muench方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(ec50)(concentrationfor50％ofmaximaleffect,ec50)。根據(jù)上述藥物半數(shù)中毒濃度(tc50)及藥物半數(shù)有效濃度(ec50)，計(jì)算藥物抑毒指數(shù)(ti)。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如表5、圖10所示)

表5紫錐菊制備純品抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.討論

本實(shí)驗(yàn)中制備所得化合物菊苣酸對呼吸道合胞病毒所致細(xì)胞病變的抑制指數(shù)為4272，是制備前上清液的9倍，是陽性對照藥的256倍，抑毒效果突出，因此是體外抗呼吸道合胞病毒的有效成分。

由實(shí)驗(yàn)三中圖4可知，體外抗病毒實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的水2、水3、水4、水5、水6部位的抗病毒效果差別較大，由于每個部位樣品量較少，為使后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)中使用的樣品為各部位的合并物。

由于大孔樹脂洗脫物中仍有多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等大分子物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用離心后取上清的方式去除大分子雜質(zhì)，以降低純化難度。

對比制備前樣品與制備產(chǎn)物的hplc圖譜發(fā)現(xiàn)，制得化合物為總樣品中的第4個峰，其在總樣中的含量最高，因此較易分得。

總結(jié)

本研究補(bǔ)充與完善了三種不同來源紫錐菊的性狀、顯微鑒別資料；建立了紫錐菊的體外抗病毒譜；通過體外藥理活性追蹤發(fā)現(xiàn)了活性成分菊苣酸。本研究的實(shí)驗(yàn)成果為紫錐菊抗病毒的進(jìn)一步研究及三種不同來源紫錐菊的準(zhǔn)確使用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)和資料。

本實(shí)驗(yàn)在抗病毒活性成分的篩選工作中，采取了“篩選范圍由寬至窄、由淺入深、逐步鎖定目標(biāo)”的實(shí)驗(yàn)方案。首先選定具有不同遺傳物質(zhì)的不同類型病毒，結(jié)合不同極性部位提取物做廣譜篩選，綜合分析篩選結(jié)果，確定效果最佳極性部位及病毒種類，進(jìn)而以有效部位的分離、純化、精制作為跟蹤方向，以所選病毒的體外藥效作為篩選依據(jù)，層層推進(jìn)，進(jìn)而得到抗病毒活性物質(zhì)。

當(dāng)今針對呼吸道合胞病毒所引發(fā)疾病的治療并無特效藥，利巴韋林為臨床常用藥。本實(shí)驗(yàn)中，選定利巴韋林為抗病毒實(shí)驗(yàn)的陽性對照藥，雖然其體外抑制效果并不突出，但并不能否定其在臨床應(yīng)用中的地位。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，應(yīng)繼續(xù)將利巴韋林作為考察菊苣酸抗病毒效果的陽性對照藥應(yīng)用于體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)，亦可考慮增添其它陽性對照藥。

紫錐菊中的菊苣酸是不穩(wěn)定成分，其在紫錐菊的制劑商品中含量不穩(wěn)定或并不存在，因此質(zhì)量控制中常以多糖類成分或酰胺類成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菊苣酸體外抑制rsv效果突出，表明其藥理活性得到了肯定，因而其在治療性藥物中的含量會對某些疾病的療效會產(chǎn)生一定影響。因此，在后續(xù)的體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)中、在紫錐菊成方制劑的進(jìn)一步研究中，針對菊苣酸的有效利用量及其作用效果，亦可做進(jìn)一步考察。

在實(shí)現(xiàn)將紫錐菊用于人類病毒性疾病的治療過程中，仍然有藥材標(biāo)準(zhǔn)缺失、抗病毒活性成分不詳、抗病毒作用機(jī)理、靶點(diǎn)不清等問題橫亙眼前。因此對紫錐菊進(jìn)行藥理活性研究、尋找可靠活性成分并進(jìn)行全面質(zhì)量評價是其在我國得到進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的前提。