專利名稱：人呼吸道合胞病毒f蛋白的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法。
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染，特別是毛細(xì)支氣管炎最重要的病毒性病原。嬰幼兒發(fā)病高峰期為出生后6周至6個(gè)月，尤其是2飛個(gè)月內(nèi)發(fā)病率高，出生一年內(nèi)約有50%嬰兒感染RSV。 RSV感染患兒的死亡率約為1%，伴有發(fā)育不良、慢性肺部疾患和先天性心臟病等疾病的兒童死亡率則更高。近年來，RSV感染在我國的流行發(fā)病率為0. Μ9Γ21.9%，住院病死率為 0. 59Γ4% ；同時(shí)老人和免疫缺陷病人也易遭受RSV引起的嚴(yán)重感染，且有感染史者易發(fā)生肺功能異常、支氣管哮喘等肺部疾患。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球每年發(fā)病和死亡人數(shù)分別為 6400萬和16萬，且近期有研究認(rèn)為RSV感染引起的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)實(shí)際上比季節(jié)性流感更加嚴(yán)重，因此，RSV感染已成為當(dāng)前迫切需要研究的重要課題。迄今為止，對RSV的感染仍然缺乏有效的特異性治療方法，尚無安全、有效的疫苗批準(zhǔn)上市，臨床上使用的抗病毒藥物如利巴韋林(Ribavirin)治療RSV感染也未取得理想的療效，且成本很高，因此研發(fā)具有治療作用的RSV特異性單克隆抗體(Monoclonal antibody, McAb)和疫苗具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前，WHO已將RSV疫苗列為全球疫苗計(jì)劃中優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一，而其中以RSV主要中和抗原為基礎(chǔ)的亞單位疫苗以其安全性好、 能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的血清抗體而備受矚目。當(dāng)前，DNA疫苗和亞單位疫苗等異源性初免 /加強(qiáng)(prime-boost)免疫策略或者亞單位疫苗與Toll-like受體(Toll-like receptor, TLR)激動(dòng)劑聯(lián)合應(yīng)用的免疫策略是當(dāng)今新型病毒疫苗研究的主要趨勢，有望進(jìn)一步提高亞單位的免疫原性和安全性，但難點(diǎn)在于制備免疫原性好、純度高的RSV中和抗原。RSV是副粘病毒科肺病毒屬，中等大小(120^300 nm),有包膜，為非節(jié)段單股負(fù)鏈 RNA病毒，約15222個(gè)核苷酸，編碼11種蛋白，其中3種跨膜蛋白(G、F和SH)，4種核殼體蛋白(N、P、L和M2 1)，2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)，1種基質(zhì)蛋白(M)和1種RNA調(diào)節(jié)因子(M2 2)。RSV中和抗原主要包括RSV膜表面融合蛋白(Fusion protein F)和黏附蛋白 (Attachment protein G)兩種糖蛋白，F(xiàn)與G蛋白為引起免疫反應(yīng)的主要抗原，都可使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，疫苗及單克隆抗體的靶標(biāo)多選擇在這兩個(gè)蛋白。F蛋白直接介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合、病毒的穿入、合胞體的形成，與G蛋白相比，其蛋白基因變異小，在不同的亞型間具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保護(hù)性抗原，被認(rèn)為是很有潛力的亞單位候選疫苗，但其瓶頸問題是F蛋白的制備和純化方法。F蛋白作為膜蛋白的一種，其制備存在著含量低、低產(chǎn)量、丟失活性及需要大量優(yōu)化純化過程等諸多困難。在F蛋白的純化方面，當(dāng)前常用的方法是利用免疫親和層析和蛋白電泳法等純化方法，但這些方法不僅蛋白產(chǎn)量少且會(huì)導(dǎo)致其抗原性的部分喪失，由此可見，為加快RSV新型疫苗的研制，迫切需要建立F蛋白制備和純化的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法。該方法基于同一種緩沖體系，經(jīng)過兩步層析純化獲得高抗原性的F蛋白，并且該方法純化人呼吸道合胞病毒F蛋白的產(chǎn)率較高。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用技術(shù)方案是
一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，該方法包括以下步驟
(1)細(xì)胞與病毒培養(yǎng)將HEp-2細(xì)胞或Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含有血清的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞豐度為809Γ90%時(shí)，接種人呼吸道合胞病毒，然后更換含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)完全病變后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基，離心，收集上清作為病毒貯液；
(2)病毒的濃縮與純化所述病毒貯液利用聚乙二醇沉淀法進(jìn)行濃縮，然后通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化，得到病毒混懸液；
(3)病毒的裂解向所述病毒混懸液中加入病毒裂解液，4°C裂解20-30min，然后加入緩沖液A稀釋3飛倍，離心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；
其中，所述病毒混懸液與病毒裂解液的體積比為1 5 1 10，所述病毒裂解液為含有250 mM 蔗糖，25 mM MES-NaOH, 10 mM NaCl, 0. 5% Triton X_100，2mM EDTA，1 mM PMSF, pH 5.7 的溶液；所述緩沖液A為含有25 mM MES-NaOH,0. 03% Triton X-100和 10 mM NaCl,pH 5.7 的溶液；
(4)離子交換柱層析純化采用陰離子交換層析柱，先用緩沖液A平衡柱子，之后上樣病毒蛋白粗提溶液，經(jīng)2倍柱體積緩沖液A清洗后，采用緩沖液A和緩沖液B混合緩沖液， 進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫過程中，混合緩沖液中緩沖液B的含量從0線性遞增至100%， 洗脫5 15個(gè)柱體積，收集穿透峰和各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析檢測，得到陽性洗脫組分，
其中所述緩沖液 B 為含有 25 mM MES-NaOH, 0. 03% Triton X-100，IM NaCl, pH 5. 7 的溶液；
(5)凝膠過濾柱層析純化采用凝膠過濾層析柱，先用緩沖液C平衡柱子，上樣經(jīng)離子交換層析柱得到的陽性洗脫組分，然后用緩沖液C洗脫，收集各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western Blot分析檢測，得到陽性洗脫液，然后將該洗脫液凍干，即得；
其中，所述緩沖液 C 為含有 25 mM MES-NaOH,0. 03% Triton X-100，150 mM NaCl，pH 5. 7的溶液。在步驟(1)中，接種人呼吸道合胞病毒的量為MOI=O. 005 0. 20。在步驟(2)中所述病毒濃縮的具體方法為向所述病毒貯液中加入MgSO4溶液和 ρΗ7. (Γ8. 0的HEPES溶液，至該混合溶液中MgSO4的終濃度為0. Γθ. 2 Μ, HEPES的終濃度為 5(Tl00mM，然后用50% PEG6000滴加入到該混合溶液中，滴加至PEG6000的體積百分含量為 10%時(shí)停止滴加，4°C攪拌90 min，然后在5800-6000rpm條件下，離心20 min，棄上清，按沉淀量的廣5%的量加預(yù)冷NTE溶液溶解，并且向該溶液中加入MgSO4溶液和EDTA溶液，至該溶液中所述MgSO4的終濃度為0. Γθ. 2Μ, EDTA的終濃度為廣2mM，得到溶解的病毒液。所述病毒純化的具體方法為依次將2mL 60%、2mL 45%及2mL 30%蔗糖溶液由下至上放入離心管中，所述溶解的病毒液置于最上層，35000rpm，4°C離心90min，收集病毒帶，然后用NTE溶液稀釋3 5倍后，22000rpm，4°C離心90min，收集沉淀，用NTE溶液溶解后，得到病毒混懸液。上述步驟中，所述NTE 溶液為含有 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 7. 5的溶液。在步驟(4)中，所述陰離子交換層析柱為Hitrap Q FF, Hi trap Q HP, Hi trap DEAE FF。在步驟(5)中，所述凝膠過濾層析柱的填料為kphacryl S-300，Sephacryl S-400, Sepharose 6B, Sepharose CL-6B, Superdex 200, Superose 6。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)獲得的主要中和抗原F蛋白作為RSV亞單位疫苗的一種，可以有效避免利用全病原體生產(chǎn)疫苗而導(dǎo)致的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，并有利于提高疫苗中有效成分的濃度、純度，以及開發(fā)多價(jià)、多聯(lián)疫苗。(2)建立的F蛋白兩步層析純化新方法不僅蛋白產(chǎn)量高(高達(dá)54%的產(chǎn)率)，并且基于同一種緩沖體系，有利于保持F蛋白抗原性，純化的F蛋白仍然能被單克隆抗體檢測到。(3)建立的F蛋白兩步層析純化新方法避免了傳統(tǒng)親和層析的成本昂貴及電泳純化的難以做到規(guī)模化生產(chǎn)的弊端。(4)本發(fā)明具有很高的技術(shù)水平和工藝先進(jìn)性，而且高效、快速、低成本的優(yōu)點(diǎn)使得所建立的F蛋白的制備與純化方法適合于規(guī)?；a(chǎn)，為RSV亞單位疫苗的研究與生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。圖1用單抗mAb 18F12進(jìn)行Wfestern blot鑒定純化的F蛋白圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為四季青公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為Merck 公司產(chǎn)品；MgS04、EDTA和蔗糖為益利公司分析純產(chǎn)品；HEPES購自Hyclone公司；T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶均為Costar公司產(chǎn)品；0. 22 mm 一次性針頭濾器為I^ll公司產(chǎn)品；PEG6000為Amresco公司產(chǎn)品；Hitrap Q FF 5 mL陰離子交換層析預(yù)裝柱；S印hacryl S-300凝膠過濾填料購自GE Healthcare公司；超濾管購自Millipore公司；微孔濾膜為上海興亞凈化材料廠產(chǎn)品；Triton X-100為Amresco分裝產(chǎn)品；7708預(yù)染染蛋白Marker購自美國New England Biolabs公司；TMB底物購自Promega公司；羊抗人RSV多克隆抗體 (ABl 128)購自Chemicon公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG為中杉金橋產(chǎn)品；抗F蛋白mAb 18F12(相關(guān)信息見Arnold R, Werner F, Humbert B, Werchau H,
Konig W. Effect of respiratory syncytial virus-antibody complexes on cytokine (IL-8, IL-6, TNF-alpha) release and respiratory burst in human granulocytes.


Immunology 1994;82 (2):184 - 91 高速冷凍離心機(jī) Beckman超速離心機(jī)
日本HITACHI公司美國Beckman公司電泳儀
半干式電轉(zhuǎn)儀垂直電泳槽酶標(biāo)儀
凝膠成像系統(tǒng)洗片機(jī)生物安全柜 -80°C低溫冰箱
AKTA Explorer 100蛋白層析系統(tǒng)實(shí)施例1
美國GE公司
美國BioRad公司美國BioRad公司美國BioRad公司
瑞士 TECON公司美國Alpha公司
美國PROCE公司美國Nuair公司美國Nuair公司
(1)細(xì)胞與病毒培養(yǎng)HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)的T-75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞豐度約為809Γ90%時(shí)，以MOI=O. 005、. 20感染劑量接種RSV，更換新鮮 DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 7池，細(xì)胞出現(xiàn)完全病變后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基，2000 rpm，離心5 min，收集上清作為病毒貯液。(2)病毒的濃縮與純化病毒貯液加入MgSO4溶液和ρΗ=7. (Γ8. 0的HEPES進(jìn)行混合，使該混合液中MgSO4終濃度為0. Γ0. 2 M和HEPES的終濃度為5(Tl00 mM,然后用50% (W/V) PEG6000緩慢滴加入到該混合溶液中，邊滴加邊搖勻，滴加至PEG6000的含量為10% (V/V)時(shí)停止滴加，4°C輕柔攪拌90 min，然后在580(T6000rpm條件下，離心20 min，棄上清，按沉淀量的廣5%(W/V)的量加預(yù)冷 NTE 溶液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH 7. 5)溶解，并且向該溶液中加入MgSO4溶液和EDTA溶液，至該溶液中所述MgSO4的終濃度為0. Γθ. 2Μ，EDTA的終濃度為廣2mM，得到溶解的病毒液。依次將2mL 60%、2mL 45%及2mL 30%蔗糖溶液由下至上放入離心管中，所述溶解的病毒液置于最上層，35000rpm，4°C離心90min，收集病毒帶(該病毒帶位于30%蔗糖溶液和45%蔗糖溶液之間)，然后用NTE溶液稀釋3 5倍后，22000rpm，4°C離心90min，收集沉淀， 用NTE溶液溶解后，得到病毒混懸液，分裝凍存于 80°C。(3)病毒的裂解向所述病毒混懸液中加入病毒裂解液(250 mM蔗糖，25 mM MES-NaOH, 10 mM NaCl,0. 5% v/v Triton X-100,2 mM EDTA，1 mM PMSF，pH 5.7)，所述病毒混懸液與病毒裂解液體積比為1:5 1:10，41裂解301^11，裂解過程中間隔進(jìn)行渦旋震蕩， 然后用緩沖液 A (25 mM MES-NaOH, 0. 03% v/v Triton X-100，10 mM NaCl, pH 5. 7)稀釋 3 5倍，11000-13000rpm，離心10 min，取上清，得到病毒蛋白粗提液。(4)離子交換純化采用Hitrap Q FF 5ml陰離子交換層析預(yù)裝柱，先使用10倍柱體積的緩沖液A平衡柱子，之后上樣IOmL病毒蛋白粗提液，經(jīng)2倍柱體積緩沖液A清洗后， 采用緩沖液 A 和緩沖液 B (25 mM MES-NaOH, 0. 03% v/v Triton X-100, IM NaCl, pH 5.7) 混合緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫梯度洗脫過程中，混合緩沖液中緩沖液B的含量從0線性遞增至100%，洗脫5 15個(gè)柱體積(CV)，收集穿透峰和各洗脫峰并進(jìn)行SDS-PAGE和Wfestern Blot分析檢測，得到陽性洗脫組分。陽性洗脫組分的確定
經(jīng)離子交換洗脫后，F(xiàn)蛋白主要是以140 kD的二聚體存在，收集離子交換洗脫峰后，分別進(jìn)行SDS-PAGE (非還原條件)和Wfestern Blot檢測，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明峰1含有分子量為140KD及60KD的兩種蛋白，而相應(yīng)的Wfestern Blot結(jié)果則表明分子量為140KD的蛋白能夠被羊抗人RSV多克隆抗體檢測到，因此，確定洗脫峰1為陽性洗脫組分。(5)凝膠過濾純化采用kphacryl S-300凝膠過濾填料，用緩沖液C (25 mM MES-NaOH,0. 03% v/v Triton X-100,150 mM NaCl，pH 5. 7)平衡 1.5 個(gè)柱體積后，按照 2^5%個(gè)柱體積的量，上樣離子交換層析陽性洗脫組分，洗脫后收集各洗脫峰，并用超濾離心管濃縮收集樣品，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析檢測，經(jīng)檢測后洗脫峰1只含有分子量為140KD的一種蛋白，而相應(yīng)的Wfestern Blot結(jié)果則表明此蛋白能夠被羊抗人RSV 多克隆抗體檢測到，因此，經(jīng)凝膠過濾，得到了純化的F蛋白，該陽性洗脫液經(jīng)凍干后，保存于-80"C。(6)經(jīng)兩步層析純化后的F蛋白再用單克隆抗體進(jìn)行鑒定分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在非還原性狀態(tài)，樣品未加熱處理情況下，經(jīng)單抗mAb 18F12鑒定，F(xiàn)蛋白為140 kD的二聚體， 參見附圖1。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
權(quán)利要求
1.一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)細(xì)胞與病毒培養(yǎng)將HEp-2細(xì)胞或Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含有血清的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞豐度為809Γ90%時(shí)，接種人呼吸道合胞病毒，然后更換含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)完全病變后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基，離心，收集上清作為病毒貯液；(2)病毒的濃縮與純化所述病毒貯液利用聚乙二醇沉淀法進(jìn)行濃縮，然后通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化，得到病毒混懸液；(3)病毒的裂解向所述病毒混懸液中加入病毒裂解液，4°C裂解2(T30min，然后加入緩沖液A稀釋3飛倍，離心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；其中，所述病毒混懸液與病毒裂解液的體積比為1 5 1 10，所述病毒裂解液為含有250 mM 蔗糖，25 mM MES-NaOH, 10 mM NaCl, 0. 5% Triton X_100，2mM EDTA，1 mM PMSF, pH 5.7 的溶液；所述緩沖液A 為含有 25 mM MES-NaOH, 0. 03% Triton X-100和 10 mM NaCl，pH 5.7 的溶液；(4)離子交換柱層析純化采用陰離子交換層析柱，先用緩沖液A平衡柱子，之后上樣病毒蛋白粗提溶液，經(jīng)2倍柱體積緩沖液A清洗后，采用緩沖液A和緩沖液B混合緩沖液， 進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫過程中，混合緩沖液中緩沖液B的含量從0線性遞增至100%， 洗脫5 15個(gè)柱體積，收集穿透峰和各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析檢測，得到陽性洗脫組分，其中所述緩沖液 B 為含有 25 mM MES-NaOH, 0. 03% Triton X-100，IM NaCl, pH 5. 7 的溶液；(5)凝膠過濾柱層析純化采用凝膠過濾層析柱，先用緩沖液C平衡柱子，上樣經(jīng)離子交換層析柱得到的陽性洗脫組分，然后用緩沖液C洗脫，收集各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western Blot分析檢測，得到陽性洗脫液，然后將該洗脫液凍干，即得；其中，所述緩沖液 C 為含有 25 mM MES-NaOH,0. 03% Triton X-100，150 mM NaCl，pH 5. 7的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟(1) 中，接種人呼吸道合胞病毒的量為MOI=O. 005、. 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述病毒濃縮的具體方法為向所述病毒貯液中加入MgSO4溶液和ρΗ7. (Γ8.0的HEPES 溶液，至該混合溶液中MgSO4的終濃度為0. Γ0. 2 Μ, HEPES的終濃度為5(Tl00mM，然后用 50% PEG6000滴加入到該混合溶液中，滴加至PEG6000的體積百分含量為10%時(shí)停止滴加， 在4°C攪拌90 min,然后在5800-6000rpm條件下，離心20 min,棄上清，按沉淀量的廣5% 的量加預(yù)冷NTE溶液溶解，并且向該溶液中加入MgSO4溶液和EDTA溶液，至該溶液中所述 MgSO4的終濃度為0. Γθ. 2Μ，EDTA的終濃度為廣2mM，得到溶解的病毒液；其中，所述 NTE 溶液為含有 150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH 7.5 的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述病毒純化的具體方法為依次將2mL 60%、2mL 45%及2mL 30%蔗糖溶液由下至上放入離心管中，所述溶解的病毒液置于最上層，35000rpm，4°C離心90min，收集病毒帶，然后用 NTE溶液稀釋3 5倍后，22000rpm，4°C離心90min，收集沉淀，用NTE溶液溶解后，得到病毒混懸液；其中，所述 NTE 溶液為含有 150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH 7.5 的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟(4) 中，所述陰離子交換層析柱為Hitrap Q FF, Hitrap Q HP, Hitrap DEAE FF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟(5) 中，所述凝膠過濾層析柱的填料為 Sephacryl S-300, Sephacryl S-400, Sepharose 6B, Sepharose CL—6B, Superdex 200, Superose 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法。該方法通過以RSV感染HEp-2細(xì)胞或Vero細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)完全病變后，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)基，離心，取上清，PEG6000沉淀，獲得的沉淀物經(jīng)溶解后通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化，純化的病毒經(jīng)裂解液溶解包膜蛋白后，蛋白粗提溶液依次經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析對F蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)過兩步層析可以得到高度純化的F蛋白，且在純化過程中保持了F蛋白的抗原性，純化的F蛋白仍然能被一組單克隆抗體檢測到。
文檔編號C07K1/16GK102199198SQ20111007533
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者付遠(yuǎn)輝, 何金生, 唐亞寧, 鄭妍鵬 申請人:北京交通大學(xué)