本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煙色煙管菌菌絲體多糖及其制備方法，以及作為抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多糖組分是食藥用真菌中已知的主要活性成份，食藥用真菌多糖在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”，作為一種生物非特異性免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血糖和降血酯等生物活性。

煙色煙管菌(bjerkanderafumosa)屬于非褶菌目、多孔菌科、煙管菌屬的藥用真菌。野生煙色煙管菌的子實(shí)體在東北民間被認(rèn)為具有抗腫瘤(尤其是抗子宮癌)的功效，但到目前為止，沒有對煙色煙管菌多糖成分及功能的相關(guān)研究。

近年來隨著自然條件的破壞，野生真菌資源越來越匱乏，限制了藥用真菌包括煙色煙管菌的進(jìn)一步開發(fā)和利用。因此采用液體深層發(fā)酵法得到煙色煙管菌(b.fumosa)菌絲體，并對其菌絲體去蛋白多糖進(jìn)行了分離純化，得到均一的菌絲體多糖，同時(shí)對其生物活性進(jìn)行研究，可以使其更好地應(yīng)用于保健品、免疫佐劑的開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次在煙色煙管菌菌絲體中提取得到去蛋白多糖dbfm，并進(jìn)一步提純制備了均一多糖組分dbfm3，并對dbfm和dbfm3的抗氧化活性和免疫作用進(jìn)行了研究。具體來說，通過搖瓶發(fā)酵收集煙色煙管菌菌絲體，經(jīng)熱水提取、乙醇沉淀、酶–sevag法去蛋白得到去蛋白菌絲體去蛋白多糖dbfm，之后經(jīng)過deaecellulosede-32(deae-32)陰離子交換柱層析，采用0～1mol/lnacl溶液洗脫，于0.6～0.9mol/lnacl梯度下洗脫得到均一多糖dbfm3。結(jié)果表明去蛋白多糖dbfm以及均一多糖組分dbfm3具有清除dpph自由基、羥基自由基的活性，對由h2o2引起的dna損傷和人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞sh–sy5y損傷具有保護(hù)作用；對于不加有絲分裂原刺激的脾淋巴細(xì)胞具有促進(jìn)增值的作用，同時(shí)對cona誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖與lps刺激的淋巴細(xì)胞增殖均有一定協(xié)同作用。

本發(fā)明的煙色煙管菌菌絲體多糖的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：

1)菌絲體制備：煙色煙管菌(bjerkanderafumosa)接種量為10％，溫度28℃，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)8天，得到煙色煙管菌菌絲體。

2)煙色煙管菌菌絲體經(jīng)沸水提、95％乙醇醇沉，得到煙色煙管菌菌絲體粗多糖，再用酶–sevag法去蛋白、無水乙醇醇沉得到菌絲體去蛋白多糖dbfm。

3)煙色煙管菌菌絲體去蛋白多糖dbfm經(jīng)deaecellulosede-32陰離子交換柱分離后得到三個(gè)組分，其中多糖組分dbfm3經(jīng)sepharosecl–6b凝膠層析柱純化后檢測為均一多糖，經(jīng)hpglc檢測測定dbfm3分子量為1.8×10⁵da。

4)煙色煙管菌菌絲體均一多糖dbfm3含有甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖，摩爾比為1：18.16：0.702，。紅外光譜分析表明dbfm3為α型吡喃糖，nmr核磁共振分析顯示：dbfm3含有1→3、1→6糖苷鍵。

煙色煙管菌菌絲體多糖dbfm和dbfm3具有抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性，：具有顯著地清除dpph自由基、羥基自由基的活性，對由h2o2引起的dna損傷和人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞sh-sy5y損傷具有保護(hù)；對于不加有絲分裂原刺激的脾淋巴細(xì)胞具有促進(jìn)增值的作用，同時(shí)對cona誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖與lps刺激的淋巴細(xì)胞增殖均有一定協(xié)同作用，且均一多糖dbfm3的生物活性較未純化的去蛋白多糖dbfm明顯提高。

附圖說明

圖1是(a)去蛋白多糖dbfm經(jīng)deaecellulosede-32陰離子交換柱層析圖譜和(b)sepharosecl–6b凝膠層析柱的洗脫曲線檢測dbfm3均一性的洗脫曲線；

圖2是均一多糖dbfm3的hpglc色譜圖；

圖3是單糖組成色譜圖，(a)為標(biāo)準(zhǔn)樣，(b)為均一多糖dbfm3；

圖4是均一多糖dbfm3的紅外光譜圖；

圖5是均一多糖dbfm3的核磁共振譜圖：(a)為¹h–nmr，(b)為¹³c–nmr，(c)為¹h–¹hcosy；

圖6是多糖的清除(a)dpph自由基、(b)羥基自由基的活性；dbfm3為均一多糖，dbfm為未純化的去蛋白多糖，vc為陽性對照；

圖7是(a)puc–19dna紫外照射后的凝膠電泳圖，泳道1：marker，泳道2：h2o2+dna+蘆丁，泳道3：h2o2+dna+dbfm3，泳道4：h2o2+dna+pbs，泳道4：未處理的dna；(b)dbfm和dbfm3對h2o2損傷的sh–sy5y細(xì)胞活性的影響；

圖8是多糖dbfm和dbfm3對有無有絲分裂原條件下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法可按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好的理解本發(fā)明；但是，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所提供的實(shí)施例。

實(shí)施例1：煙色煙管菌菌絲體的發(fā)酵

種子液培養(yǎng)：250ml搖瓶中裝新鮮種子培養(yǎng)基100ml，煙色煙管菌(bjerkanderafumosa)菌種接活化后平板母種3塊，每塊0.5cm²。置于28℃、150r/min的恒溫?fù)u床上震蕩8天。

上述的1l種子培養(yǎng)基：0.1g/lcacl2,1g/lkh2po4,1.5g/lmgso4,2g/l酵母浸膏,3g/l蛋白胨,20g/l葡萄糖。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：500ml搖瓶中裝新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基200ml，培養(yǎng)8天，培養(yǎng)條件同種子培養(yǎng)基，得煙色煙管菌菌絲體。

上述的1l發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5g/lmgso4,0.05g/lfeso4,1g/lkh2po4,0.02g/lcuso4,0.4g/lk2hpo4,0.01g/lznso4,0.01g/lcocl2,0.08g/lmnso4,3g/l蛋白胨,53g/l玉米粉。

實(shí)施例2：煙色煙管菌菌絲體多糖的提取、分離和純化

煙色煙管菌菌絲體去蛋白多糖的提?。壕z體用蒸餾水沖洗干凈，100℃加熱2h后，過濾濃縮，加入4倍95％乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?℃靜置過夜，離心收集沉淀，用無水乙醇、乙醚依次洗滌3次，沉淀冷凍干燥，得菌絲體粗多糖bfm。用酶–sevag法對粗多糖進(jìn)行除蛋白，5％多糖溶液與鏈蛋白酶(酶：蛋白＝1：50)混和后，加入少量二甲苯防腐，1％nacl做激活劑，37℃保溫24h。再與sevag試劑(氯仿：正丁醇＝4：1)一起振蕩，離心，反復(fù)數(shù)次至無沉淀產(chǎn)生，無水乙醇醇沉、凍干，得菌絲體去蛋白多糖dbfm。

煙色煙管菌菌絲體去蛋白多糖的分離純化：取適量多糖dbfm溶于蒸餾水中，上樣于已經(jīng)平衡好的deaecellulosede-32陰離子交換柱，先用兩倍柱體積蒸餾水洗脫，再用兩倍體積的0～1mol/lnacl溶液洗脫，流速1ml/min，自動收集器收集(4ml/管)，用苯酚–硫酸法檢測各管多糖含量，合并相同餾分，醇沉，冷凍干燥，獲得煙色煙管菌菌絲體多糖，圖1a是dbfm經(jīng)deae–32陰離子交換柱的洗脫曲線的三個(gè)洗脫峰，其中使用蒸餾水洗脫的為中性多糖，命名為dbfm1；0.2-0.5mol/lnacl梯度下洗脫的為酸性多糖組分i，命名為dbfm2；0.6-0.9mol/lnacl梯度下洗脫的為酸性多糖組分ii,命名為dbfm3。將dbfm1、dbfm2和dbfm3復(fù)溶于蒸餾水，用sepharosecl–6b凝膠層析柱檢驗(yàn)糖的均一性，采用0.9％nacl洗脫，流速0.15ml/min，自動收集器收集(3ml/管)，用苯酚–硫酸法檢測各管多糖含量。檢測結(jié)果顯示只有dbfm3為單一對稱峰，認(rèn)為dbfm3為均一多糖，圖1b是dbfm3的sepharosecl–6b凝膠層析柱洗脫曲線。

煙色煙管菌菌絲體純化多糖的純度鑒定和分子量測定高效液凝膠滲透色譜法(hpglc)，進(jìn)一步檢測多糖的純度和分子量，采用rid–10a示差折光檢測器和tsk–g3000pwxl凝膠層析色譜柱(7.8mm×30.0cm)，柱溫為35℃，流動相為0.2mol/lnacl溶液，流速為0.6ml/min。將多糖樣品溶于0.2mol/lnacl溶液中，樣品濃度為2mg/ml，上樣量為20μl。圖2是均一多糖dbfm3的hpglc色譜圖，檢測結(jié)果表明，dbfm3具有均一性，分子量為1.8×105da。

實(shí)施例3：煙色煙管菌菌絲體均一多糖的結(jié)構(gòu)分析

煙色煙管菌菌絲體均一多糖的單糖組成分析通過對煙色煙管菌菌絲體均一多糖dbfm3進(jìn)行酸解、水解及衍生化，得到單糖–pmp衍生物，用shimadzuhplc系統(tǒng)結(jié)合dikmainertsilods–3色譜柱(4.6mm×150mm)測定dbfm3的單糖組成，流速為1ml/min。圖3是單糖組成色譜圖，(a)為標(biāo)準(zhǔn)樣，(b)為均一多糖dbfm3；檢測結(jié)果表明dbfm3含有甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖，摩爾比為1：18.16：0.702。

煙色煙管菌菌絲體均一多糖的紅外光譜分析取干燥的均一多糖dbfm32mg，以kbr壓片，用specordir型紅外色譜儀進(jìn)行檢測，掃描范圍為4000–500cm-1，記錄紅外光譜圖。圖4為均一多糖dbfm3的紅外光譜圖，表明其為α型吡喃糖。

煙色煙管菌菌絲體均一多糖的核磁共振光譜分析稱取20mg干燥多糖樣品dbfm3，充分溶解于0.5mld2o中，測定¹³c–nmr譜、¹h–nmr譜和¹h–¹hcosy譜。圖5是均一多糖dbfm3的核磁共振譜圖：(a)為¹h–nmr，(b)為¹³c–nmr，(c)為¹h–¹hcosy。

dbfm3的¹h–nmr中峰重疊，難以辨別，¹h–¹hcosy的化學(xué)位移表明dbfm3含有1→3、1→6糖苷鍵，¹³c–nmr的化學(xué)位移表明dbfm3含有1→3糖苷鍵，在δ160–180之間有吸收峰，說明存在糖醛酸。

實(shí)施例4：煙色煙管菌菌絲體多糖dbfm和dbfm3的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性分析

多糖對dpph自由基的清除率配制0.5、1、2、3、4、5mg/ml的多糖溶液，分別取2ml置于試管中，再向各試管中分別加入2mldpph·溶液，振蕩搖勻，將反應(yīng)體系置于室溫黑暗處并保持半小時(shí)，測定其吸光度值od1，空白組為2ml甲醇和2mldpph，測定其吸光度值od0，對照組為2ml多糖溶液和2ml甲醇，測定其吸光度值od2。用抗環(huán)血酸作為陽性對照。所有吸光度值均在517nm處測定。dpph自由基清除率可通過以下公式計(jì)算：

圖6a是多糖對dpph自由基的清除率，結(jié)果顯示，dbfm3和dbfm的dpph自由基清除活性在0.5mg/ml–5mg/ml濃度范圍內(nèi)均變現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，在濃度2mg/ml時(shí)清除活性達(dá)到較高水平，并隨濃度升高趨于平穩(wěn)水平，且dbfm3的活性高于dbfm。

多糖對羥基自由基的清除率配制濃度為9mmol/l的feso4、9mmol/l水楊酸溶液及8.8mmol/l的h2o2溶液。配制0.5、1、2、3、4、5mg/ml的多糖溶液，分別取1ml置于試管中，再向試管中分別加入1ml水楊酸和1mlfeso4，振蕩搖勻，最后向反應(yīng)體系中加入1mlh2o2溶液，將試管置于37℃水浴鍋中溫育1小時(shí)，之后將反應(yīng)后的溶液離心(10000rpm，5min)，取上清液，測定其吸光度值ax，用蒸餾水(代替多糖溶液)作為空白組測定其吸光度值a0，用蒸餾水(代替h2o2)作為對照組測定其吸光度值ax0，用抗環(huán)血酸作為陽性對照。所有吸光度值均在510nm處測定。羥基清除率可通過以下公式計(jì)算：

圖6b是多糖對羥基自由基的清除率，結(jié)果顯示，dbfm3和dbfm的羥基自由基清除活性在0.5mg/ml–5mg/ml濃度范圍內(nèi)均變現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，在濃度2mg/ml時(shí)清除活性達(dá)到較高水平，且dbfm3的活性高于dbfm。

多糖對dna損傷的保護(hù)作用以puc-19dna質(zhì)粒為研究目標(biāo)，利用紫外光激發(fā)h2o2產(chǎn)生羥基自由基來誘導(dǎo)dna損傷，研究多糖對損傷的保護(hù)作用。puc-19dna質(zhì)粒濃度為10nm，多糖溶液濃度為5mg/ml。在離心管依次加入puc-19dna質(zhì)粒3μl、2％h2o24μl、多糖溶液3μl，混合均勻，室溫條件下用紫外照射15min，然后經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測dna的損傷程度。圖7a是puc–19dna紫外照射后的凝膠電泳圖，泳道2為h2o2+dna+蘆丁，蘆丁對紫外線有極強(qiáng)的吸收作用，uv照射，dna以sc型和oc型兩種形式存在，作為陽性對照；泳道3為h2o2+dna+dbfm3，有oc型dna，說明當(dāng)多糖加入反應(yīng)體系后，dna的損傷程度減小，多糖dna對的損傷有一定的保護(hù)作用，可能是因?yàn)槎嗵悄芮宄p基自由基，與多糖的抗氧化能力有關(guān)系。

多糖對h2o2損傷sh-sy5y細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)分組為正常對照組、h2o2(400μmol/l)模型組、不同濃度多糖溶液+h2o2(400μmol/l)劑量組。將生長良好的sh-sy5y細(xì)胞制備成2×10⁴/ml的細(xì)胞懸液，按每孔200μl接種于96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞粘附于板上，用不同濃度的多糖溶液(5、10、25、50、100μg/ml)預(yù)處理2小時(shí)，然后用h2o2(400μmol/l)作用24小時(shí)后，每孔加20μlmtt溶液(5mg/ml)，培養(yǎng)4h后，去上清液每孔加入100μldmso，震蕩溶解，酶標(biāo)儀570nm處檢測吸光值。細(xì)胞活力(％)＝劑量組od值/正常對照組od值。圖7b是多糖對h2o2損傷的sh–sy5y細(xì)胞活性的影響，如圖所示，sh–sy5y細(xì)胞經(jīng)h2o2損傷后，細(xì)胞活性明顯降低，與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，說明模型制造成功。與h2o2模型組相比，劑量組多糖能顯著抑制h2o2對細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞活力升高，與正常對照組效果相當(dāng)，且dbfm3的活性高于dbfm。

多糖對有無有絲分裂原條件下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響采用mtt方法檢測脾淋巴細(xì)胞的增殖情況，小鼠頸椎脫臼處死后，無菌條件下取出脾臟，輕輕研磨制備脾細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，然后用rpmi–1640完全培養(yǎng)基制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶cell/ml。100μl含有無菌待測樣品的細(xì)胞懸液加入含有或者不含cona(5μg/ml)、lps(10μg/ml)的96孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的多糖溶液(終濃度為10、20、40、80、200μg/ml)100μl?；靹蚝蠓湃肱囵B(yǎng)箱5％co2、37℃培養(yǎng)48h。每孔加20μlmtt溶液(5mg/ml)，培養(yǎng)4h后，去上清液每孔加入100μldmso，震蕩溶解，酶標(biāo)儀570nm處檢測吸光值。圖8是多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響，從圖中可以看出，dbfm3和dbfm對于不加有絲分裂原刺激的脾淋巴細(xì)胞具有促進(jìn)增值的作用(圖8a)，同時(shí)對cona誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖與lps刺激的淋巴細(xì)胞增殖均有一定協(xié)同作用(圖8b、c)，且dbfm3的活性高于dbfm。

對去蛋白多糖dbfm經(jīng)deae–32陰離子交換柱洗脫的另外兩個(gè)組分dbfm1和dbfm2進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并未發(fā)現(xiàn)明顯的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。