本發(fā)明屬于生物工程中的dna重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用gst原核表達(dá)體系制備gst-pias387-121aa(aminoacid)融合蛋白的多克隆抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

pias3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(stat3)的抑制蛋白,能夠特異的與活化的stat3結(jié)合進(jìn)而阻止stat3與dna結(jié)合。hpias3全長定位于人類第1號染色體1q21上，包含14個外顯子。

pias3在人類正常組織廣泛表達(dá)，而對于癌組織中的表達(dá)目前的研究結(jié)果有一定的爭議性。對來源于人體腦、乳腺、腎、肺、前列腺、皮膚、肝臟、食管、胃和結(jié)直腸10個部位的103例惡性腫瘤標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，pias3蛋白在其中100例(大約97％)中都有程度不同的高表達(dá)。而另外一些實(shí)驗(yàn)組的研究表明pias3在胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等癌癥中均表達(dá)減少或缺失。這種爭議性是否由于對不同剪接型pias3蛋白檢測的結(jié)果，值得深入研究。抗體是蛋白質(zhì)檢測和功能研究中的最有力工具之一，我們制備的針對pias3exon2特異表達(dá)肽段的高效價(jià)抗體對于系統(tǒng)研究68kdpias3全長蛋白在各種組織和細(xì)胞中的表達(dá)和作用機(jī)制具有十分重大的意義。另外，研究表明pias3蛋白能夠誘導(dǎo)前列腺癌凋亡，是前列腺癌抑癌蛋白，我們制備的抗體為pias3潛在分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種能夠用于表達(dá)pias3exon2特異肽段蛋白的檢測的模型，為從蛋白水平深入研究pias3功能及相關(guān)疾病提供必要的實(shí)驗(yàn)工具。

利用基因工程技術(shù)，將pias3exon2特異表達(dá)肽段87-121位氨基酸(35aa)對應(yīng)dna片段克隆到原核表達(dá)載體pgex-4t-1中。經(jīng)酶切和序列分析后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，并經(jīng)異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)產(chǎn)生gst-pias3exon235aa融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清，并應(yīng)用proteina/g將其純化，獲得多克隆抗體。抗體的效價(jià)及特異性采用elisa和westernblot檢測，并應(yīng)用免疫印跡和免疫組化檢測了pias3蛋白在前列腺癌細(xì)胞和前列腺癌組織中的表達(dá)與定位。

本發(fā)明的gst-pias3exon235aa融合蛋白是將利用特殊序列(pias3exon2特異表達(dá)肽段87-121位氨基酸對應(yīng)dna片段)構(gòu)建gst-pias3exon235aa融合蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化bl21得到的高效表達(dá)特異性的gst-pias3exon235aa融合蛋白，這段87-121位氨基酸序列為：

其對應(yīng)核苷酸序列為：

這種gst-pias3exon235aa融合蛋白及其多克隆抗體制備包括以下步驟：

第一步，克隆載體的構(gòu)建

以人pias3cdna為模板，應(yīng)用pcr技術(shù),擴(kuò)增得到的目的片段與pmd18-t載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟得到重組質(zhì)粒后，酶切鑒定并測序。

第二步，原核表達(dá)載體pgex-4t-1的構(gòu)建

將克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pgex-4t-1雙酶切后，利用回收試劑盒獲得pias3基因該區(qū)片段和載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟獲得重組的表達(dá)載體。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定。

第三步，gst-pias3exon235aa融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

重組質(zhì)粒pgex-4t-1/pias3exon235aa轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，利用iptg誘導(dǎo)，gst-pias3exon235aa融合蛋白的表達(dá)。以sds-page進(jìn)行鑒定，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。用超聲裂解細(xì)菌，所獲蛋白用glutathione-sepharose4b柱純化，sds-page鑒定純化產(chǎn)物。

第四步，兔抗pias3exon235aa抗血清的制備及純化

以純化的pias3exon235aa融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，300μg純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2周加強(qiáng)免疫1次。于末次免疫后1周取耳血，用elisa法測定抗體的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1∶100000時，頸動脈放血，收集血清。用proteina/g純化抗pias3exon235aa血清，準(zhǔn)備蛋白asepharosecl-4b親和柱，親和層析使抗體結(jié)合在柱子上，經(jīng)2次洗滌后，將抗體洗脫，達(dá)到純化目的，sds-page鑒定純化產(chǎn)物，獲得該發(fā)明的多克隆抗體。應(yīng)用多種免疫學(xué)方法檢測其效價(jià)及特異性，結(jié)果顯示該抗體可特異性的與pias3蛋白結(jié)合。

利用pias3exon2特異表達(dá)肽段蛋白對應(yīng)基因序列成功構(gòu)建gst-pias3exon235aa融合蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化bl21后可高效表達(dá)特異性的gst-pias3exon235aa融合蛋白。以該融合蛋白免疫兔子獲得抗gst-pias3exon235aa融合蛋白的高效價(jià)抗體經(jīng)多種免疫學(xué)方法檢測抗體效價(jià)及特異性，結(jié)果表明抗體效價(jià)高達(dá)1∶1000000，且特異性良好?？贵w可應(yīng)用于pias3蛋白的檢測，對于系統(tǒng)研究68kdpias3全長蛋白在各種組織和細(xì)胞中的表達(dá)和作用機(jī)制具有十分重大的意義。另外，pias3蛋白能夠誘導(dǎo)前列腺癌凋亡，是前列腺癌抑癌蛋白，我們制備的抗體為潛在機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明：

圖1：pcr擴(kuò)增出的pias3基因87-121氨基酸片段dna瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2：雙酶切質(zhì)粒pgex-4t-1；

圖3：pgex-4t-1/pias3exon235aa重組體酶切鑒定結(jié)果；

圖4：純化后的gst及gst-pias3exon235aa融合蛋白sds-page圖；

圖5：proteina/g純化后的pias3exon235aa抗體和純化前的抗pias3exon235aa血清sds-page圖；

圖6：間接elisa法測定抗體的效價(jià)；

圖7：pias3exon235aa抗體特異性的westernblot分析；

圖8：免疫組化檢測pias3在前列腺和前列腺癌組織中的表達(dá)；

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：抗gst-pias3exon235aa血清的在制備

1.pcr-pmd18-t/pias3exon235aa重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pias3mrna全長從genebank得到，基因序列號為genbank:nm_006099。pias3mrna序列從genebank得到，基因序列號為nm_006099。以cdna為模板，上游引物為5’-gaattcgtaggctcccctggtcctctagctcccattcccccaacgctgttggcccctggcaccctgc(含ecori酶切位點(diǎn))；下游：5’-ctcgagtcactggggcagaggggg(含xhoi酶切位點(diǎn))，應(yīng)用pcr成功擴(kuò)增出了pias3exon287-121氨基酸對應(yīng)dna序列長度105bp【圖1】。擴(kuò)增得到的片段與pmd18-t載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，在含amp⁺瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以ecori和sali單酶切鑒定。

2.原核表達(dá)載體pgex-4t-1的構(gòu)建

將含有pias3exon2特異表達(dá)肽段蛋白對應(yīng)基因序列的pmd18-t質(zhì)粒經(jīng)ecori和xhoi雙酶切后(片段105bp)，利用回收試劑盒獲得pias3基因該區(qū)片段，同時用相同的酶處理質(zhì)粒pgex-4t-1(約5kbp)【圖2】。然后將回收的pias3exon2特異表達(dá)肽段蛋白對應(yīng)基因序列片段和經(jīng)酶切的載體pgex-4t-1在t4dna連接酶作用下于16℃連接過夜。酶切鑒定重組體，結(jié)果顯示該pias3exon2特異表達(dá)肽段蛋白對應(yīng)基因序列正確【圖3】。

3.gst-pias3exon235aa融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

重組質(zhì)粒pgex-4t-1/pias3exon235aa轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，挑取單菌落接入lb/amp⁺培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按1∶50的比例轉(zhuǎn)接于含amp⁺的lb培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。在培養(yǎng)液的a600為0.5～0.6時，加入iptg至終濃度為0.08mmol/l，不加入iptg者為陰性對照，置25℃繼續(xù)培養(yǎng)4～5h。離心收集菌體，以sds-page進(jìn)行鑒定gst-pias3exon235aa融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。以5000r/min于4℃離心5mins，收集菌體,用60ml冰預(yù)冷的netn懸浮1l菌液的沉淀。用超聲裂解細(xì)菌,再以9600rpm，于4℃離心15min，取上清，過glutathione-sepharose4b柱，先以等體積洗脫緩沖液1(含20mm谷胱甘肽、50mmtris-cl，ph＝8.0)洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2(含100mm谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液,sds-page鑒定純化產(chǎn)物【圖4】。

4.兔抗pias3exon235aa抗血清的制備

以純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2wk后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，300μg純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強(qiáng)免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用elisa法測定抗體的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1∶1000000時，頸動脈放血，收集血清。

5.proteina/g純化抗pias3exon235aa血清

將proteina/gsepharosecl-4b填料緩慢裝柱，平衡柱子后加入經(jīng)過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結(jié)合，即親和層析使抗體結(jié)合在柱子上，經(jīng)2次洗滌后，加ph2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用sds-page和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。染色結(jié)果顯示純化效果明顯，純化后的樣品有清晰的輕、重鏈帶【圖5】。

實(shí)施例2:gst-pias3exon235aa抗體的分析及應(yīng)用

1.gst-pias3exon235aa抗體效價(jià)的測定

用gst-pias3exon235aa融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照,將純化后的gst-pias3exon235aa抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后,用間接elisa測定抗體的效價(jià)。結(jié)果顯示,免疫前的兔血清未測出抗融合蛋白gst-pias3exon235aa的抗體，gst-pias3exon235aa抗體的滴度高達(dá)1∶1000000以上【圖6】。

2.gst-pias3exon235aa抗體應(yīng)用于組織中pias3exon235aa蛋白的檢測

收集lncap和du145細(xì)胞，裂解超聲后用bca蛋白定量試劑盒對其進(jìn)行蛋白定量，之后將樣品按差異蛋白量進(jìn)行sds-page，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以5％脫脂奶粉封閉1h，依次滴加兔抗pias3exon235aa抗體(室溫2h，pbs洗3次)及山羊抗兔igg2hrp(室溫反應(yīng)1h，pbs洗滌3次),最后加底物dab顯色，并拍照。結(jié)果顯示【圖7】，我們制備的pias3deta抗體與lncap細(xì)胞所表達(dá)的pias3蛋白發(fā)生了抗原-抗體反應(yīng)而在marker指示的68kd處出現(xiàn)了一條特異的蛋白帶，證明pias3exon235aa抗體特異性好。

3.前列腺組織pias3蛋白定位分析

將人前列腺癌穿刺組織切片經(jīng)ph8.0edta熱修復(fù)后，pbs洗三次，每次5mins，滴加pbs(對照組)或兔抗pias3exon235aa抗體室溫1h，pbs洗3次；滴加二抗，室溫孵育30mins，pbs洗三次，每次5mins；dab染色，室溫染色3mins，自來水終止染色；蘇木精復(fù)染，脫水，封片并拍照。結(jié)果顯示【圖8】，pias3特異性的表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞，而在前列腺癌組織中表達(dá)缺失。

<110>東北師范大學(xué)

<120>利用gst表達(dá)體系制備抗人pias3高效價(jià)抗體及應(yīng)用

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<213>人（homosapiens）

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