本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體涉及一種龜甲膠中龜、牛源性熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法與應(yīng)用。屬于膠類中藥動物源性檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

龜甲膠為龜科動物烏龜?shù)谋臣准案辜?，?jīng)水煎熬、濃縮制成的固體膠。味咸、甘，微寒，歸肝、腎和心經(jīng)，具有滋陰潛陽，益腎強(qiáng)骨，養(yǎng)血補(bǔ)心之功效，主要用于陰虛潮濕，骨蒸盜汗，頭暈?zāi)垦＃擄L(fēng)內(nèi)動，筋骨痿軟，心虛健忘等。長期服用龜甲膠利于增強(qiáng)機(jī)體自身調(diào)節(jié)，延年益壽，利于陰虛陽亢患者的身體恢復(fù)。隨著生活水平的不斷提高，龜甲膠成為人們進(jìn)補(bǔ)的首選之一。

據(jù)2015年版《中國藥典》記載，龜甲膠為龜甲經(jīng)水煎熬、濃縮制成的固體膠。由于龜甲屬于名貴藥材，加上近年來對各種龜類動物的嚴(yán)重捕殺，致使龜甲原料的供應(yīng)有限，隨著膠類市場的不斷發(fā)展，熬膠原料緊缺和原料價(jià)格的上漲，部分生產(chǎn)商制作原料用其他動物的雜皮包括豬皮、牛皮等、碎骨代替龜骨，以次充好。這些假冒偽劣產(chǎn)品無論是在外觀、色澤和氣味上都與正品龜甲膠無明顯差別，肉眼很難辨別真假。若消費(fèi)者長期服用這些偽劣產(chǎn)品，不僅沒有任何的治療效果，服用時間久了還有可能對身體造成傷害。劣質(zhì)龜甲膠產(chǎn)品的出現(xiàn)影響了整個龜甲膠產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。這就要求發(fā)展更加可信、靈敏的檢測技術(shù)來滿足監(jiān)管部門的質(zhì)量控制與監(jiān)管要求。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些基于DNA的生物學(xué)鑒定手段逐漸豐富起來，DNA分子法主要是利用顯示生物特征的各種生物物種所具有的不同DNA序列信息進(jìn)行鑒別，它可以突破依據(jù)感官檢測的局限性，與傳統(tǒng)分析方法相比，更加具有客觀性和準(zhǔn)確性。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為了食品藥品中動物源性成分種屬鑒定的核心方法。近年來實(shí)時熒光PCR技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，并使得成分含量的定量溯源成為可能，由于熒光定量PCR檢測整個檢測過程為閉管操作，所以有效的減少了實(shí)驗(yàn)過程中的污染的風(fēng)險(xiǎn)，目前廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

目前，龜甲膠中以DNA為基礎(chǔ)的溯源鑒定工作在不斷展開。專利CN103630646A通過質(zhì)譜法快速鑒別龜甲膠中龜源性成分，專利授權(quán)號（CN 103630634A）通過加入限制性內(nèi)切酶后利用質(zhì)譜法快速鑒別龜甲膠中是否含有驢、馬、牛、豬或羊源性成分。但這些方法均針對龜甲膠中多肽差異性進(jìn)行鑒定，而由于技術(shù)的局限性，靈敏度和假陽性比率相對較高，判定上不夠準(zhǔn)確。因此，傳統(tǒng)的鑒別方法不能滿足當(dāng)前龜甲膠真?zhèn)舞b別的要求。而利用實(shí)時熒光定量PCR檢測龜甲膠中龜、牛源性的研究目前在國內(nèi)還尚未報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種龜甲膠中龜、牛源性熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法與應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種龜甲膠中龜、牛源性熒光PCR檢測引物，包括兩對引物，其核苷酸序列如下：

（1）龜特異性引物：

正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

（2）牛特異性引物：

正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.4所示。

一種龜甲膠中龜、牛源性熒光PCR檢測探針，包括：

龜特異性探針P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

牛特異性探針P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’，如SEQ ID NO.6所示。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，龜特異性探針序列和牛特異性探針序列的5’端修飾有報(bào)告基團(tuán)，3’端修飾有淬滅基團(tuán)，其中所述報(bào)告基團(tuán)為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一種。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，

龜特異性探針P1序列為：5’-FAM-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.5所示；

牛特異探針P2序列為：5’-JOE-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-BHQ2 3’ ，如SEQ ID NO.6所示。

一種龜甲膠中龜、牛源性PCR檢測試劑盒，包括上述熒光PCR檢測引物、探針，以及龜甲膠DNA提取液和多重實(shí)時熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述PCR檢測試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系，所述內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系包括質(zhì)控體系引物、質(zhì)控體系探針和質(zhì)控體系序列，各核苷酸序列如下：

（1）質(zhì)控體系引物：

上游引物F：5’- CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA -3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物R：5’- CTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCGA -3’，如SEQ ID NO.8所示；

（2）質(zhì)控體系探針CntP：5’-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3’，如SEQ ID NO.9所示；

（3）質(zhì)控體系Isqc序列：

CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如SEQ ID NO.10所示。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，質(zhì)控體系探針CntP的5’端修飾有報(bào)告基團(tuán)，3’端修飾有淬滅基團(tuán)，其中所述報(bào)告基團(tuán)為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一種。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述PCR檢測試劑盒還包括龜和牛陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照品和空白對照品。作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述多重實(shí)時熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系包括：2×qPCR Master Mix 10μL，引物對10μM取1μL，探針用量P1（龜）和P2（牛）終濃度各0.25μM，DNA用量1～50ng/μL取2μL，用雙蒸水補(bǔ)足20μL。

上述引物、探針或試劑盒在鑒別龜甲膠中龜和牛源性成分中的應(yīng)用。

一種龜甲膠中龜、牛源性多重實(shí)時熒光定量PCR檢測（Multiplex Quantitative Real-time PCR）方法，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品DNA，選擇靶基因，并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和含有陽性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；

（2）使用上述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）設(shè)立陽性對照、陰性對照及空白對照，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出第n個循環(huán)時的熒光增加值ΔRn與擴(kuò)增曲線Ct值，根據(jù)不同探針熒光信號及擴(kuò)增曲線Ct值來判定龜甲膠中是否含有龜和牛源性成分。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟（1）中DNA的提取按照專利CN201410317118.7中阿膠DNA提取技術(shù)進(jìn)行提取。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟（1）中靶基因選自線粒體16SrDNA基因，因?yàn)橄啾然蚪M而言，線粒體在組織中拷貝數(shù)高，而且龜甲膠經(jīng)過深度加工后破壞程度相對小。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟（1）中，陽性內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：使用DNA隨機(jī)生成軟件產(chǎn)生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒有出現(xiàn)與之同源的DNA片段，在這段隨機(jī)DNA序列設(shè)計(jì)如SEQ ID NO.7所示的上游引物和如SEQ ID NO.8所示的下游引物序列，從而形成111bp的陽性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列（如SEQ ID NO.10所示），將這段陽性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列委托人工基因合成，合成片段連接載體PMD18-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，質(zhì)粒提取，并測序驗(yàn)證，得到能與龜和牛源性各自的特異性引物，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，從而構(gòu)建陽性內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒。各核苷酸序列見表1。

表1. 引物探針序列

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟（2）是將引物及探針放入同一反應(yīng)體系中共同擴(kuò)增，無需開管，避免污染。PCR反應(yīng)體系見表2。

表2. PCR反應(yīng)體系

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟（2）中的PCR擴(kuò)增條件為：95℃，10min；95℃，10s；63℃，35s，在此收集熒光信號，45個循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的試劑盒檢測靈敏度高、特異性好，可以實(shí)現(xiàn)龜甲膠中龜、牛源性成分的快速檢測。

本發(fā)明的檢測方法能夠快速的檢測到龜甲膠及其制品中龜、牛源性，從而辨別真?zhèn)危哂兄貜?fù)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、通量大、使用方便、耗時短的特點(diǎn)。同時，本發(fā)明的方法有效克服了龜甲膠成品經(jīng)過高溫炮制導(dǎo)致DNA降解而導(dǎo)致提取困難不完整的難題，在龜甲膠生產(chǎn)加工質(zhì)量監(jiān)控及監(jiān)管部門在監(jiān)管中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為FAM熒光修飾龜源性特異探針有擴(kuò)增曲線，說明待測樣本檢出龜源性成分。

圖2為JOE熒光修飾牛源性特異探針有擴(kuò)增曲線，說明待測樣本檢出牛源性成分。

圖3為FAM和JOE熒光修飾探針同時有擴(kuò)增曲線，說明待測樣本檢出龜和牛源性成分。

圖4為試劑盒龜源性檢測靈敏度擴(kuò)增曲線圖，檢測限為0.01ng。

圖5為試劑盒牛源性檢測靈敏度擴(kuò)增曲線圖，檢測限為0.01ng。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。

本發(fā)明中所用實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器如下：

實(shí)驗(yàn)材料：

鹿、龜、魚、牛、驢、馬、狐貍、水貂、貉子、狗、兔、雞、鴨、鵝、駱駝、玉米等動物皮張或新鮮組織，龜甲膠不同批次的樣品共20份，均購自濟(jì)南市各大藥店。

所用試劑：

動物組織提取試劑盒為OMEGA品牌。DNA分子量MakerDL1000、電泳上樣緩沖液等PCR反應(yīng)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。引物與探針由生工生物工程（上海）有限公司負(fù)責(zé)合成。2×TaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。DNA測序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心測序中心完成。

所用儀器：ABI 7500熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品，Takara PCR儀為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。5424 D型高速離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1

龜甲膠樣品DNA提取，采用專利201410317118.7（一種從阿膠中快速提取DNA的試劑盒及其提取方法）中公開的方法進(jìn)行提取，步驟不再贅述，提取的基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度。測定OD260/OD280值均為1.8～1.9左右，濃度在10ng/μl以上，說明DNA純度較高，濃度適中，符合PCR擴(kuò)增要求。

1、靶基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)：相比基因組而言，線粒體在組織中拷貝數(shù)高，而且龜甲膠經(jīng)過深度加工后破壞程度相對小，所以優(yōu)先選用線粒體16SrDNA基因。設(shè)計(jì)龜和牛通用外側(cè)引物及內(nèi)側(cè)引物，擴(kuò)增片段小，使引物與靶點(diǎn)更容易結(jié)合。引物探針序列見表1。

2、龜甲膠中龜源性成分的定量檢測：選用20μL的實(shí)時熒光多重PCR擴(kuò)增體系，含TaqMan reaction Mix（2x）10μl，Gui-P 2.0 μM, Bovine -P 2.0 μM，龜特異性正反向引物Gui F / Gui R 5.0 μM，牛特異性正反向引物NF /NR 5.0 μM，待測樣本總DNA 2.0 μL，用雙蒸水補(bǔ)足20 μL反應(yīng)體系。陰性模板對照加無菌雙蒸水。20μL反應(yīng)體系見表2。

3、本發(fā)明優(yōu)先選用PCR擴(kuò)增條件：PCR擴(kuò)增條件為：95℃3min； 95℃ 10s，62℃，35s，在此收集熒光信號，45個循環(huán)。

4、結(jié)果分析：每次試驗(yàn)設(shè)立陽性對照、陰性對照及空白對照，試驗(yàn)結(jié)束后打開分析軟件，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出ΔRn（第n個循環(huán)時的熒光增加值）與擴(kuò)增曲線Ct值，根據(jù)不同探針熒光信號及擴(kuò)增曲線Ct值來判定龜甲膠中是否含有龜和牛源性成分。結(jié)果見圖1，F(xiàn)AM熒光修飾龜源性特異探針有擴(kuò)增曲線時，說明待檢樣本檢出龜源性成分，圖2，JOE熒光修飾牛源性特異探針有擴(kuò)增曲線時，說明待檢樣本檢出牛源性成分，圖3，F(xiàn)AM熒光修飾龜源性特異探針和JOE熒光修飾牛特異探針同時有擴(kuò)增曲線時，說明為樣本同時檢出龜和牛源性成分。

實(shí)施例2 特異性驗(yàn)證

利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針，分別以鹿、龜、魚、牛、驢、馬、狐貍、水貂、貉子、狗、兔、雞、鴨、鵝、駱駝、玉米等動物皮張或新鮮組織的總基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，驗(yàn)證其引物和探針的特異性。其結(jié)果見表3，結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的探針及引物具有很強(qiáng)的特異性。

表3. 特異性驗(yàn)證試驗(yàn)

實(shí)施例3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將龜、?；蚪MDNA分別定量到50 ng，按10×梯度稀釋（10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5），每個梯度均取2.0 μL為模板量，（即：10 ng，1 ng，0.1 ng，0.01 ng，0.001 ng）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，評估本發(fā)明的檢測限。見圖4和圖5，結(jié)果表明本方法定量檢測限為0.1ng，說明本發(fā)明所提供的方法具有很高的靈敏度。

實(shí)施例4 實(shí)際樣品檢測應(yīng)用

市售樣本20份，不同品牌廠家及不同生產(chǎn)批次，按照本發(fā)明提供的檢測方法，提取DNA后進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，見表4，其中8份樣品檢測出龜源性，3份檢測出牛源性，5份樣本同時檢測出龜和牛源性成分，4份樣本未檢出龜和牛源性。說明本發(fā)明提供的檢測方法具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

表4. 實(shí)際樣本檢測

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心

<120> 一種龜甲膠中龜、牛源性熒光PCR檢測引物、探針組合物、試劑盒及檢測方

法與應(yīng)用

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 龜特異性引物F1

<400> 1

ctggggtagc ttggttcgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 龜特異性引物R1

<400> 2

gcctacgggc ccatatcaaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 牛特異性引物F2

<400> 3

ctgatggtgc aaccgctatc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 牛特異性引物R2

<400> 4

tctagggcag ggttttgtgt t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 龜特異性探針P1

<400> 5

ttttgccgga agcactttgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 牛特異性探針P2

<400> 6

ccggagtaat ccaggtcggt 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 質(zhì)控體系引物F

<400> 7

cctgtatcaa cacatagaag caata 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 質(zhì)控體系引物R

<400> 8

cttttacttc ttttaatctt tccga 25

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 質(zhì)控體系探針CntP

<400> 9

tgacgctagt aggcaagtac gctccatt 28

<210> 10

<211> 111

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 質(zhì)控體系IsqcP序列

<400> 10

cctgtatcaa cacatagaag caataatgga gcacgccgta agcttaacct gacgctagta 60

ggcaagtacg ctccattggt gacctcggaa agattaaaag aagtaaaagg a 111