本發(fā)明涉及一種預(yù)測高甘油三酯血癥的易感性的方法與試劑，更具體的說是通過測定與高甘油三酯血癥相關(guān)基因WNT10A的多態(tài)性預(yù)測受試者對于高甘油三酯血癥的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是一種異族性甘油三酯蛋白合成或降解障礙。指血中的甘油三酯以乳糜微粒和前β-脂蛋白中含量升高，是冠心病、高血壓、糖尿病等代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。

高甘油三酯血癥主要有以下臨床表現(xiàn)：

甘油三酯高的后果是容易造成“血稠”，即血液中脂質(zhì)含量過高導(dǎo)致的血液粘稠，在血管壁上沉積，漸漸形成小斑塊，即動(dòng)脈粥樣硬化。而血管壁上的這些塊狀沉積會(huì)逐漸擴(kuò)大面積和厚度，使血管內(nèi)徑變小、血流變慢，血流變慢又加速了堵塞血管的進(jìn)程，嚴(yán)重時(shí)血流甚至被中斷。除了血流中斷，阻塞物脫落還能造成血栓；甘油三酯高的后果無論發(fā)生在哪個(gè)部位，對人體損傷都很嚴(yán)重。如果在心臟，可引起冠心病、心梗；在大腦，可發(fā)生腦卒中、中風(fēng)；發(fā)生在眼底，會(huì)導(dǎo)致視力下降、失明；如在腎臟，可引起腎衰；發(fā)生在下肢，則出現(xiàn)肢體血流不暢導(dǎo)致壞死。

高甘油三酯血癥主要通過血液的生化檢查來檢測。

正常的甘油三酯水平：兒童<l00mg/dL(1.13mmol/L)，成人<150mg/dL(1.7mmol/L)，臨界性高甘油三酯血癥：250—500mg/dL(2.83-5.65mmol/L)，明確的高甘油三酯血癥：大于500mg/dL(5.65mmol/L)。

本發(fā)明主要針對明確的高甘油三酯血癥，即血清甘油三酯水平高于500mg/dL(5.65mmol/L)。

目前主要通過單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與甘油三酯水平之間的關(guān)聯(lián)研究來尋找可預(yù)測個(gè)體高甘油三酯血癥的遺傳因子。

SNP是指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1％，SNPs是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有70.1％為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換：如G/A或T/C，29.1％為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶)是人類基因組中最易發(fā)生變化的位點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多態(tài)性的80-90％，是最常見的遺傳變異。

由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個(gè)基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)三百萬個(gè)。SNP以其密度高(平均每1kb就有1個(gè))、代表性強(qiáng)(位于基因內(nèi)部的SNP可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平)、遺傳穩(wěn)定性好(同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言)、易于自動(dòng)化分析(因SNP在人群中多為雙等位基因標(biāo)記，可簡單以“+/－或1/0”直接分型)等特點(diǎn)成為很好的遺傳標(biāo)志。

本領(lǐng)域的研究顯示，具體的某個(gè)SNP基因型與特定疾病的相關(guān)性和預(yù)期該疾病的易感性高低之間的關(guān)系是非常復(fù)雜的。即使是同一基因上的不同SNP位點(diǎn)，與某一疾病的相關(guān)性或易感性之間的關(guān)系也無從互相參考，甚至同一個(gè)SNP位點(diǎn)對于不同人種也存在著顯著的甚至是質(zhì)的差別。

本發(fā)明中，我們研究了WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因與高甘油三酯血癥易感性的關(guān)系。WNT是一大類與胚胎發(fā)育，干細(xì)胞維持與分化，細(xì)胞增殖、遷移、極性決定、死亡及癌癥發(fā)生有關(guān)的分泌型糖蛋白家族。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)WNT10A在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。WNT10A與配體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的β-catenin，促進(jìn)β-catenin的蓄積和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活TCF/LEF信號(hào)通路，誘導(dǎo)核中c-myc和Cyclin D1的激活，從而調(diào)節(jié)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過程。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)WNT10A在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如腎癌，結(jié)直腸癌等。在腫瘤中，WNT10A可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力。目前尚無關(guān)于WNT10A基因多態(tài)性位點(diǎn)與高甘油三酯血癥相關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明中，我們首次發(fā)現(xiàn)了WNT10A基因第3外顯子區(qū)rs147680216G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與高甘油三酯血癥易感性之間的關(guān)系。通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的WNT10A基因第1外顯子區(qū)rs147680216G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，能夠預(yù)測受試者對高甘油三酯血癥的易感性：WNT10A基因第3外顯子區(qū)rs147680216G/A的基因型為GG時(shí)，受試者的易感性最低；攜帶A等位基因時(shí)，受試者的易感性升高。

本發(fā)明提供了一種分離核酸，具有SEQ ID NO:1所示的堿基序列，其+401位即是變異位點(diǎn)，以字母“R”標(biāo)示出。該核酸序列為WNT10A rs147680216G/A位點(diǎn)側(cè)翼序列。圖1為WNT10A基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖，附圖中包含有4個(gè)外顯子，rs147680216G/A位點(diǎn)標(biāo)在WNT10A基因圖中第3外顯子區(qū)的相應(yīng)位置。

本發(fā)明的主要目的是提供一種預(yù)測高甘油三酯血癥易感性的方法。

本發(fā)明的的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)測高甘油三酯血癥易感性的系統(tǒng)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種預(yù)測高甘油三酯血癥易感性的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鑒定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑在制備用于檢測受試者的高甘油三酯血癥的易感性的試劑中的用途，其包括：(1)在來自所述受試者的樣本中測定WNT10A基因的rs147680216位點(diǎn)的基因型，以及(2)將所測定的基因型與參照基因型進(jìn)行比較，其中與參照基因型相比的所述基因型的差異用于評(píng)價(jià)高甘油三酯血癥的易感性。

所述的樣品包括體液。

所述的體液包括外周血、血清、血漿、痰、滑液、房水、羊水、乳汁、精液、前列腺液、考珀液、女性射出液、汗液、排泄物、淚液、囊液、胸腔積液、腹水液、心包液、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿液、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、胰液、支氣管肺抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。

一種評(píng)價(jià)高甘油三酯血癥易感性的方法，接收包括受試者WNT10A基因rs147680216位點(diǎn)的基因型的相關(guān)數(shù)據(jù)，將所述受試者的基因型與被認(rèn)為具有低易感性的參照基因型進(jìn)行比較，以及在受試者的基因型與參照基因型不同的情況下發(fā)出警告信號(hào)。

一種用于評(píng)價(jià)高甘油三酯血癥易感性的系統(tǒng)，包括接收器、數(shù)據(jù)庫和處理器；其中，接收器用于接收包括受試者WNT10A基因rs147680216位點(diǎn)的基因型的相關(guān)數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)有被認(rèn)為具有低易感性的參照基因型數(shù)據(jù)，處理器用于將受試者的WNT10A基因rs147680216位點(diǎn)的基因型的相關(guān)數(shù)據(jù)與參考基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以及在受試者的基因型與參照基因型不同的情況下發(fā)出警告信號(hào)。

所述參照基因型是指rs147680216位點(diǎn)的基因型為GG。該基因型為非風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

一組用于評(píng)價(jià)高甘油三酯血癥易感性的引物，為序列表SEQ ID NO:2和序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

一種評(píng)價(jià)高甘油三酯血癥易感性的試劑盒，由下述試劑組成：

30μL 10×PCR緩沖液；

5μL 10mMdNTP混合液；

5μL TaqDNA聚合酶,濃度為2U/μL；

2.5μL F1引物，濃度為10pM/μL，為為序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

2.5μL R1引物10pM/μL，濃度為10pM/μL，為為序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

235μL純水。

使用方法：

(1)通過PCR擴(kuò)增WNT10A基因的第3外顯子區(qū)部分片段，制備混合液：10×PCR反應(yīng)緩沖液3μL，10mM/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pM/L上游引物0.5μL，10pM/L下游引物0.5μL，基因組DNA 2μL，加純水至30μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸25s，總共35個(gè)循環(huán)，72℃總延伸2min。PCR前于每一體系中加入20μL的石蠟油，以防止液體揮發(fā)。

(2)基因型判定：將PCR產(chǎn)物直接測序，根據(jù)熒光信號(hào)的差異判定基因型。

本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品來源無限制，如：體液(血液、腹水及尿液等)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。調(diào)整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴(kuò)增出含ADI1基因突變位點(diǎn)的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴(kuò)增含ADI1基因變異點(diǎn)的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。

本發(fā)明優(yōu)先適用于測定根據(jù)WNT10A基因的突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定WNT10A基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當(dāng)?shù)奶囟ㄔ噭?，如DNA片段和/或用于PCR擴(kuò)增步驟的引物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明首次闡明了WNT10A基因多態(tài)性位點(diǎn)與高甘油三酯血癥的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測高甘油三酯血癥易感性的方法，該方法可用于高甘油三酯血癥的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以便公眾對發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

附圖說明

圖1為WNT10A基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖

圖2A為WNT10A rs147680216位點(diǎn)GG基因型測序結(jié)果

圖2B為WNT10A rs147680216位點(diǎn)GA基因型測序結(jié)果

具體實(shí)施方式

用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下：

10×PCR緩沖液：10mM Tris-HCL(pH＝8.3)，0.5M氯化鉀(KCL)，10mM氯化鎂(MgCL)，0.01％(W/V)白明膠

dNTP：脫氧核苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸

TE：10mM Tris-HCI(pH＝7.5)，1mM EDTA(pH＝8.0)

實(shí)施例1血液樣本收集和基因組DNA的提取

(1)按按中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)入選病例，共選取來自廣西無血緣關(guān)系的高甘油三酯血癥患者100例，同地區(qū)的健康對照志愿者148例。所有受檢者均為漢族且簽署書面知情同意書，這項(xiàng)研究得到衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所倫理審核委員會(huì)的認(rèn)可，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》：人體醫(yī)學(xué)研究的倫理原則。

(2)根據(jù)下列方法，制備人基因組DNA。①首先在已標(biāo)號(hào)的1.5mLEP管中加1000μL紅細(xì)胞裂解液，后加入400μLEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3-5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；②13000rpm離心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480μL核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20μL蛋白酶K(用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65℃孵箱10分鐘，(期間不時(shí)上下混勻，確保無凝塊)；④拿出后降至室溫，加300μL蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；⑤將上清液移至新EP管中，加入670μL預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團(tuán)塊，13000rpm離心2分鐘；⑥棄上清液并確保沉淀留在EP管中，加入670μL70％乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；⑦棄上清，使管內(nèi)乙醇揮發(fā)干凈；⑧加入TE溶液(400μL)，充分溶解，對提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/μL，置于4℃?zhèn)溆?，剩余基因組DNA置-20℃冰箱保存。

實(shí)施例2變異位點(diǎn)的識(shí)別鑒定

本發(fā)明采用PCR-測序分析法對WNT10A基因的第3外顯子區(qū)的+401位點(diǎn)(其等位位點(diǎn)為T/C)的基因型進(jìn)行檢測。圖2為WNT10A基因變異位點(diǎn)的測序圖。

1、PCR-測序引物的確定

從Genebank中查取rs147680216G/A附近的DNA堿基序列(SEQ ID N0:1)，引物設(shè)計(jì)在Oligo7.0軟件下完成。目的片段定位在WNT10A基因內(nèi)，全長為330bp，確定了正義鏈F1(+198bp-+216bp)與反義鏈R1(+507bp-+527bp)，特異性引物序列如下：

F1：5’-GAAGCTGCACCGCTTACAAC-3’(SEQ ID N0:2)

R1：5’-TAACACAGTTCCCCAGTGGC-3’(SEQ ID N0:3)

2、PCR-測序反應(yīng)體系及條件

通過PCR擴(kuò)增WNT10A基因第3外顯子區(qū)部分片段，PCR反應(yīng)體系為：10×PCR反應(yīng)緩沖液3μL，10mM/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pM/L上游引物0.5μL，10pM/L下游引物0.5μL，基因組DNA 1μL，加去離子水至30μL。PCR時(shí)于每一體系中加入20μL石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸25s，總共35個(gè)循環(huán)，72℃總延伸2min。

3、測序判定基因型

PCR產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后送華大基因測序部進(jìn)行測序驗(yàn)證。結(jié)果見圖2A和圖2B所示。

實(shí)施例3基因SNP與高甘油三酯血癥的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)方法：運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性。利用SPSS11.0軟件中Pearson卡方檢驗(yàn)計(jì)算WNT10A基因rs147680216G/A位點(diǎn)的等位基因、基因型在高甘油三酯血癥病例組與正常對照組間的分布頻率，高甘油三酯血癥的患病風(fēng)險(xiǎn)OR值及其95％CI可信區(qū)間，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果：位于2q35區(qū)域的WNT10A基因上rs147680216G/A位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例與對照組間的分布詳見表1。

表1：WNT10A(rs147680216G/A)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例對照組間的分布

注：OR：比值比；CI：可信區(qū)間。*A等位基因?yàn)橐谆几吒视腿パY的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。受試者分為高甘油三酯血癥的風(fēng)險(xiǎn)等位基因(GA)攜帶者，和非風(fēng)險(xiǎn)等位基因(GG)攜帶者。

由表1可見，WNT10A(rs147680216G/A位點(diǎn))的A等位基因，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位基因，在患者群體中的分布頻率顯著高于其在健康正常人群中的等位基因分布頻率(0.050vs.0.009)，具有顯著性差異(P<0.001)，而且A位點(diǎn)的OR值為8.879，95％CI：2.464-31.989；在高甘油三酯血癥的風(fēng)險(xiǎn)等位基因(GA)攜帶者和非風(fēng)險(xiǎn)等位基因(GG)攜帶者中，風(fēng)險(xiǎn)基因型在病例組中的分布頻率顯著高于對照組中的(P＝0.006)，均表明WNT10A基因rs147680216G/A位點(diǎn)與高甘油三酯血癥患病呈正相關(guān)，可能增加高甘油三酯血癥發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)施例4檢測試劑盒

制備檢測高甘油三酯血癥相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出WNT10A基因SNP+401位點(diǎn)的引物對，及其他PCR-HRM相應(yīng)試劑。本發(fā)明試劑盒供10人份檢測應(yīng)用，于-20℃避光保存，其組分、含量和來源包括：

30μL 10×PCR緩沖液(Pharmacia),

5μL 10mMdNTP混合液(Pharmacia),

5μL TaqDNA聚合酶(2U/μL)(Takara)，

2.5μL F1引物(SEQ ID N0:2)(10pM/μL)，

2.5μL R1引物(SEQ ID N0:3)(10pM/μL)，

235μL純水。

經(jīng)PCR-測序檢測后，可輕易檢測出WNT10A基因第3外顯子區(qū)rs147680216G/A多態(tài)性。

本發(fā)明具有實(shí)用性的例證：

本發(fā)明的WNT10A基因多態(tài)性的檢測方法可用于分析人常染色體2q35區(qū)的WNT10A基因上的rs147680216A等位基因，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位基因，應(yīng)用于對高甘油三酯血癥的輔助性診斷和評(píng)估個(gè)體的高甘油三酯血癥患病風(fēng)險(xiǎn)如何，以利于開展高甘油三酯血癥的早期干預(yù)和治療。

利用本發(fā)明闡述WNT10A基因rs147680216G/A位點(diǎn)的堿基變異，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)WNT10A表達(dá)的活性分子，促進(jìn)高甘油三酯血癥新藥研發(fā)。

本發(fā)明建立的檢測WNT10A基因多態(tài)性的核酸序列和高甘油三酯血癥相關(guān)位點(diǎn)，可高靈敏度，特異性的應(yīng)用于高甘油三酯血癥基因輔助診斷的試劑盒。

如上所述，得出結(jié)論，WNT10A基因rs 147680216G/A位點(diǎn)的多態(tài)性與高甘油三酯血癥具顯著相關(guān)性。因此，根據(jù)本發(fā)明測定此多態(tài)性，可用于高甘油三酯血癥的基因輔助診斷。

本發(fā)明敘述了WNT10A基因高甘油三酯血癥相關(guān)的新突變位點(diǎn)，并提供了一種測定WNT10A基因多態(tài)性的方法，而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測定基因的多態(tài)性。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種測定高甘油三酯血癥相關(guān)基因多態(tài)性的基因輔助診斷方法。

序列表

<110> 北京醫(yī)院

<120> 一種預(yù)測高甘油三酯血癥的易感性的方法與試劑

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 人屬，人種

<220>

<221> R

<222> (401)..(401)

<223> R=A or G

<400> 1

ttctttgact ctgtttcctt gtgccagact ctcctgcata ctgggcttca gtttctcctt 60

ggaatgatga gaaaggtggg ctggagaatg gggtgtcaag gcccctccag agtccatgtg 120

ttctgggtct ttaaccacag gtttccgaga gagcgctttt gcctacgcca tcgcagcagc 180

tggcgtggtg cacgccgtgt ccaatgcgtg tgccctgggc aaactgaagg cctgtggctg 240

tgatgcgtcc cggcgagggg acgaggaggc cttccgtagg aagctgcacc gcttacaact 300

ggatgcactg cagcgtggta agggcctgag ccatggggtc ccggaacacc cagccctgcc 360

cacagccagc ccaggcctgc aggactcctg ggagtggggc rgctgcagcc ccgacatggg 420

cttcggggag cgcttttcta aggactttct ggactcccgg gagcctcaca gagacatcca 480

cgcgagaatg aggcttcaca acaaccgagt tgggaggcag gtgagagccc cacccctggg 540

tctgcttcaa atctctttgc ctagggccta ccccttgccc tggcctacct ctcttctgag 600

gaccacgttg ctcccacatg tcacaccttg gcaatcttct cgttgaccct gtctaattca 660

acaaacatgc actgagtatg cactgtgcac caggcactgg actaggcctg gggatacagg 720

gcagaaacaa gccctgttgc cctggatcag cataccacct gctgagcaac ctgcttctcc 780

tacttcctcg ggtgatcacc c 801

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列，F(xiàn)1引物

<400> 2

gaagctgcac cgcttacaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列，R1引物

<400> 3

taacacagtt ccccagtggc 20