一種龜甲膠及其制品的檢測物及其液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測龜甲膠及其制品的方法，其利用龜甲膠制品與其他仿制品基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明的方法，能夠快速檢測龜甲膠及其制品中的驢、馬、牛、豬、羊、鹿等偽品成分，從而分辨真?zhèn)巍１景l(fā)明還涉及多肽，及其由所述多肽與相應(yīng)載體組成的組合物。此外，還包括所述多肽及其組合物在檢測龜甲膠及其制品中驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。
【專利說明】一種龜甲膠及其制品的檢測物及其液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分的檢測物及其檢測方法，具體可應(yīng)用于龜甲膠及其制品的真?zhèn)舞b定，屬于中藥檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]龜甲，即龜科動物烏龜(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲，屬于傳統(tǒng)名貴中藥。據(jù)最新版的中國藥典記載，服用龜甲能夠滋陰潛陽，益腎強骨，養(yǎng)血補心。近些年來，隨著生物學水平的提高，龜甲的相關(guān)研究也不斷深入。有研究表明，龜甲粉末及其提取物不僅能夠增強肝功能、緩解壓力，還具有抗癌以及調(diào)節(jié)免疫抵抗力的功效。以龜甲為原料而制成的兩類產(chǎn)品龜苓膏和龜甲膠在整個中藥市場上占據(jù)著重要的位置。
[0003]據(jù)2010年版中國藥典記載，龜甲膠是以龜甲為原料，經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，性咸、甘、涼，歸肝、腎、心經(jīng)。能夠滋陰、養(yǎng)血、止血，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等。長期服用龜甲膠還有利于增強機體自身調(diào)節(jié)，能夠延年益壽，也利于陰虛陽亢患者的身體康復(fù)。隨著生活水平的不斷提高，與阿膠類似，龜甲膠也成為人們進補的首選之一。
[0004]由于龜甲自身比較名貴，藥用價值顯著，并且龜肉也常常用于烹飪各類補品供人們食用，近些年來對各種龜類的捕殺現(xiàn)象十分嚴重，甚至于某些龜類品種瀕臨滅絕。因此，龜甲原料的供應(yīng)非常有限，并且價格高昂，也直接影響到了龜甲膠的生產(chǎn)。在龜甲膠市場上存在某些假冒偽劣產(chǎn)品，其制作原料并非龜甲，而是由其他動物雜皮、碎骨代替，包括豬皮、牛皮，甚至病死動物之皮，臟皮、爛皮等。該類假冒偽劣產(chǎn)品一旦成形，無論外觀、色澤、氣味都與正品龜甲膠及其相似，真?zhèn)坞y辨。服用這些偽品不僅沒有任何療效，還很可能對身體有害，后果十分嚴重。
[0005]膠類中藥由動物的皮、骨、甲等熬制而成膠類物質(zhì)，包括阿膠、龜甲膠、鹿角膠等，具有典型民族特色的傳統(tǒng)中藥。膠類中藥一般經(jīng)長時間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存在差異，采用紅外、近紅外、X-衍射等方法對膠類中藥純品進行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準確等情況。膠類中藥中龜源性成分的鑒別，已有學者從DNA角度進行鑒別，但只是定性，存有假陰性與假陽性現(xiàn)象，且操作較為復(fù)雜。有報道稱從多肽的角度利用質(zhì)譜檢測膠類中藥中龜源性成分，結(jié)果準確可靠。但目前還沒有從膠原多肽的角度，一次性鑒別龜甲膠及其制品中偽品成分的檢測方法。
[0006]膠類中藥中主要成分為膠原蛋白多肽，不同動物的膠原蛋白氨基酸序列存在差異，除烏龜之外的不同物種中，含有的穩(wěn)定存在的同一多肽可作為龜甲膠中偽品成分的特征性多肽，通過限制性內(nèi)切酶酶切，利用質(zhì)譜完全可以對龜甲膠進行溯源鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對上述問題，提供了一種龜甲膠及其制品的檢測物及其真?zhèn)舞b定方法，該方法操作簡單，特征性強，靈敏度高，可用于龜甲膠及其制品中偽品成分的溯源鑒定。[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]首先，本發(fā)明提供了一種檢測龜甲膠及其制品的方法，其利用龜甲膠制品與其他仿制品基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
[0010]優(yōu)選的，所述龜甲膠制品選自龜甲膠制成的食品、保健品或藥品中的一種，且配方中不含有驢、馬、牛、豬、羊、鹿源性成分。
[0011]優(yōu)選的，所述其他仿制品是指驢、馬、牛、豬、羊或鹿中的一種或幾種熬制而成的膠類物質(zhì)。
[0012]更具體地，所屬包括如下步驟:
[0013](I)選取龜甲膠制品與其他仿制品基因組中特異性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示；
[0014](2)將龜甲膠或其制品溶解，或提取所述龜甲膠或其制品的蛋白多肽類成分并溶解，隨后加入限制性內(nèi)切酶進行酶切；
[0015](3)將步驟(2)得到的酶切后的溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀，以龜甲膠純品為基質(zhì)，加入步驟(I)所述氨基酸序列作為對照，并選擇該氨基酸序列的母離子m/z553.3及其子離子進行監(jiān)測。
[0016]如果檢出該離子的保留時間與對照品一致，且其子離子與對照品的子離子一致，則所述龜甲膠或其制品中含有該偽品成分；如果沒有與對照品保留時間一致的該離子，則不含有該偽品成分。
[0017]優(yōu)選的，步驟(2)中所述溶解所用的試劑是質(zhì)量百分數(shù)為1%、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性內(nèi)切酶為胰蛋白酶。
[0018]進一步地，本發(fā)明提供了一種檢測龜甲膠及其制品的分子標記物，該分子標記物的氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
[0019]進一步地，本發(fā)明提供了編碼所述的蛋白的基因。
[0020]進一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標記物在檢測龜甲膠中是否含有驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。
[0021]更進一步地，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含藥學有效量的所述的蛋白和一種或多種藥學上可接受的載體。
[0022]更進一步地，本發(fā)明提供了所述的藥物組合物在檢測龜甲膠中是否含有驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果如下:
[0024]采用本發(fā)明的方法，能夠快速檢測龜甲膠及其制品中的驢、馬、牛、豬、羊、鹿等偽品成分，從而分辨真?zhèn)?，盡管膠類中藥中膠原蛋白多肽有一定水解與破壞，但本發(fā)明基于其主要成分膠原蛋白中的差異性多肽，其含量高，受破壞程度很小，可對龜甲膠及其制品中是否含有驢、馬、牛、豬、羊或鹿等偽品成分進行鑒定。
[0025]本發(fā)明還涉及多肽，其氨基酸序列為Gly-Val-Gln-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg，及其由所述多肽與相應(yīng)載體組成的組合物。此外，還包括所述多肽及其組合物在檢測龜甲膠及其制品中驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是合成多肽及純品膠多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下選擇離子對m/z553.3 — 667.1、764.4、821.3監(jiān)測的質(zhì)譜圖；
[0027]圖2是合成多肽及加入5%偽品膠的混合膠多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下選擇離子對m/z553.3 — 667.1,764.4,821.3 監(jiān)測的質(zhì)譜圖；
[0028]圖3是合成多肽及龜甲膠制品(龜甲膠顆粒)在多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式下選擇離子對m/z553.3 — 667.1,764.4,821.3 監(jiān)測的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0030]本發(fā)明中特異性肽鏈的獲得:
[0031]I材料和試劑
[0032]材料:純品膠包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、龜甲膠、鹿角膠、羊皮膠，分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、龜甲、鹿角、羊皮煎煮獲得。
[0033]試劑:碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純，購自中國食品藥品檢定研究院)、合成多妝 Gly-V al-Gln-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg。
[0034]2樣品的檢測前處理
[0035]( I)膠樣品酶解溶液的制備
[0036]取1.0g待測膠樣品于500mL量瓶中，加少量1%NH4HC03溶液，超聲使樣品完全溶解，用1%NH4HC03溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液ImL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100 μ L，37 °C恒溫酶解6h。
[0037](2)合成多肽對照樣品酶解溶液的制備
[0038]稱取一定量的合成多肽，加入1%NH4HC03溶液(pH8.0)，搖勻，配制成濃度約為
0.3 μ g/mL,微孔濾膜過濾,備用。
[0039]3多肽的發(fā)現(xiàn)
[0040](I)離子的發(fā)現(xiàn)
[0041]取5 μ L酶解溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。液相條件=C18反相色譜柱(2.1mmX 100mm,
1.8 μ m)，流動相A為0.1%甲酸溶液【體積分數(shù)】，流動相B為乙腈，流速0.3mL/min ;梯度洗脫:0~40min，2%~50%流動相B (這里的百分數(shù)表示從O分鐘到第40分鐘，流動B由2%線性漸變?yōu)?0%、流動相A則由98%漸變?yōu)?0%)。質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式(ESI+)進行一級全掃，掃描范圍m/z400-m/zl000。
[0042]從各自膠樣品的質(zhì)譜全掃圖中提取離子m/z553.3，通過對比發(fā)現(xiàn)在7.65min左右只有龜甲膠中沒有該離子峰，而阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠和鹿角膠中均含有。通過多批次樣品的檢測與驗證表明上述結(jié)論正確。說明:可以通過檢測龜甲膠中的離子m/z553.3，來確定是否摻雜驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性等偽品成分。
[0043](2)多肽的氨基酸序列初步推測[0044]利用三重四極桿質(zhì)譜，對上述找出的離子進行子離子掃描，確認該離子帶雙電荷，通過序列拼接，推測出多肽的部分序列。根據(jù)推測的部分序列，在NCBKhttp: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進行序列檢索，結(jié)合其的特點(龜中沒有，而驢、馬、牛、豬、羊或鹿中均有，且被胰蛋白酶酶切后分子量約為1105.6)，推導(dǎo)出該多肽可能的序列Gly-Val-Gln-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg。根據(jù)肽鏈的CID斷裂理論,計算該多肽可能的子離子如下:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測龜甲膠及其制品的方法，其利用龜甲膠制品與其他仿制品基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所/Jn ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述龜甲膠制品選自龜甲膠制成的食品、保健品或藥品中的一種，且配方中不含有驢、馬、牛、豬、羊、鹿源性成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述其他仿制品是指驢、馬、牛、豬、羊或鹿中的一種或幾種熬制而成的膠類物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任意一項所述的方法，其具體包括如下步驟: (1)選取龜甲膠制品與其他仿制品基因組中特異性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示； (2)將龜甲膠或其制品溶解，或提取所述龜甲膠或其制品的蛋白多肽類成分并溶解，隨后加入限制性內(nèi)切酶進行酶切； (3)將步驟(2)得到的酶切后的溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀，以龜甲膠純品為基質(zhì)，加入步驟(I)所述氨基酸序列作為對照，并選擇該氨基酸序列的母離子m/z553.3及其子離子進行監(jiān)測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述溶解所用的試劑為1%、ρΗ值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性內(nèi)切酶為胰蛋白酶。
6.一種檢測龜甲膠及其制品的分子標記物，該分子標記物的氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
7.編碼權(quán)利要求6所述的蛋白的基因。
8.權(quán)利要求6所述的分子標記物在檢測龜甲膠中是否含有驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包含藥學有效量的權(quán)利要求6所述的蛋白和一種或多種藥學上可接受的載體。
10.權(quán)利要求9所述的藥物組合物在檢測龜甲膠中是否含有驢、馬、牛、豬、羊或鹿源性成分中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/02GK103630622SQ201310518572
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】段小波, 秦玉峰, 尤金花, 周祥山, 田守生, 郭尚偉, 嵇傳良, 牛偉霞 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司