本發(fā)明屬于生物微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片及其制作方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞是組成和維持生命的最基本單元，近年來(lái)針對(duì)細(xì)胞的研究極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)診斷、生命科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。研究表明，處于相同外部環(huán)境中的群體細(xì)胞存在個(gè)體差異且混合液中的細(xì)胞會(huì)相互影響，對(duì)群體細(xì)胞的研究只能得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果，會(huì)忽略個(gè)體差異，造成稀有異常細(xì)胞信號(hào)(稀有細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)信息和對(duì)外界刺激的反應(yīng))的淹沒，進(jìn)而無(wú)法得到可靠的相關(guān)信息。因此，對(duì)單細(xì)胞的研究具有非常重要的意義。細(xì)胞研究的前提是對(duì)細(xì)胞的精確操作。近年來(lái)，伴隨微機(jī)電系統(tǒng)的發(fā)展，微流控芯片技術(shù)也得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離、聚焦、富集及旋轉(zhuǎn)等操作，但是這些操作都主要針對(duì)群體細(xì)胞，而單細(xì)胞排列與控制技術(shù)則針對(duì)個(gè)體細(xì)胞，僅需要一次實(shí)驗(yàn)就可同時(shí)大規(guī)模捕獲排列單細(xì)胞并賦予單細(xì)胞位置信息，達(dá)到聚焦、分析及控制單細(xì)胞的目的。為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單細(xì)胞的同時(shí)監(jiān)測(cè)、降低實(shí)驗(yàn)成本、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程、提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性，必須開發(fā)高通量、高可靠性、低成本的單細(xì)胞排列與控制芯片。

目前，能夠用于單細(xì)胞排列的方法主要包括微吸管、光鑷、二維介電泳、光誘導(dǎo)介電泳、磁捕獲、聲表面波捕獲與流體動(dòng)力學(xué)捕獲。其中，微吸管操作單細(xì)胞與細(xì)胞膜直接接觸，可能造成細(xì)胞的損傷影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、釋放細(xì)胞操作難度較高且通量低、自動(dòng)化程度低；光鑷裝置成本高、對(duì)細(xì)胞的作用力小、通量低；二維介電泳芯片電極產(chǎn)生的電場(chǎng)強(qiáng)度在通道高度方向呈指數(shù)下降，導(dǎo)致位于上層液面的細(xì)胞無(wú)法被捕獲而效率較低且很難控制單細(xì)胞的釋放；光誘導(dǎo)介電泳芯片制作復(fù)雜對(duì)工藝要求較高、產(chǎn)生的光介電泳力也不夠大而且使用的激光器價(jià)格高不便于集成；磁單細(xì)胞捕獲需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記，標(biāo)記會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，而且無(wú)法進(jìn)行單細(xì)胞釋放操作、芯片體積較大不利于系統(tǒng)集成；聲表面波操作生物細(xì)胞的原理仍不成熟，芯片的效率還很低，也不能進(jìn)行單細(xì)胞的控制；流體動(dòng)力學(xué)單細(xì)胞排列技術(shù)屬于被動(dòng)式細(xì)胞捕獲技術(shù)，利用制作的陣列化微結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞捕獲與排列，但是結(jié)構(gòu)比較固定、不能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的釋放?？傮w來(lái)說(shuō)，已經(jīng)開發(fā)的單細(xì)胞排列與控制芯片所利用的原理單一，導(dǎo)致精度高的成本高，效率高的不能重復(fù)利用且不能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的釋放，甚至?xí)?duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有的單細(xì)胞分析用芯片可靠性低、成本高及不易釋放單細(xì)胞的技術(shù)問(wèn)題，提供了一種流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片及其制作方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片，整體為三明治式結(jié)構(gòu)，從上至下依次為導(dǎo)管接頭、上基底、上層微電極、微通道、微墻陣列、下層微電極和下基底，所述上基底上設(shè)置有兩個(gè)便于實(shí)驗(yàn)緩沖液進(jìn)樣與出樣的通孔，所述導(dǎo)管接頭固定在上基底上表面的通孔處，所述上基底的下表面設(shè)置上層微電極，所述下基底的上表面設(shè)置下層微電極，上層微電極和下層微電極均為ito金屬制成的叉指電極，上層微電極與下層微電極垂直相交設(shè)置，所述微墻陣列為微米級(jí)的圓形深孔，每個(gè)圓形深孔內(nèi)僅能容納一個(gè)單細(xì)胞，微墻陣列位于微通道的下方，且每個(gè)微墻位于上層微電極與下層微電極交叉處的中心。

所述上基底與下基底均為1.1mm厚的透明玻璃，所述上層微電極與下層微電極的厚度均為185nm。

所述微墻陣列采用負(fù)光刻膠su-8經(jīng)過(guò)光刻顯影制作而成，所述微墻直徑15μm、高6μm。

所述微通道采用pdms薄膜制作，所述微通道厚20μm。

一種流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片的制作方法，包括以下步驟：

(1)微電極的制作：將沉積有ito薄膜的玻璃依次置于丙酮、乙醇、去離子水中分別超聲清洗10min，烘干后進(jìn)行hmds處理，并在ito面均勻涂厚2μm的正光刻膠；前烘后利用掩膜版進(jìn)行曝光；后烘后顯影去除被曝光部分的膠；堅(jiān)膜后置于ito刻蝕液中去除多余金屬，剝離去除多余光刻膠，形成設(shè)計(jì)的微電極結(jié)構(gòu)；

(2)微墻陣列的制作：取一片制備的微電極置于等離子鍵合機(jī)內(nèi)使表面改性為親水；使用勻膠機(jī)旋涂厚6μm的su-8負(fù)光刻膠，置于熱板上前烘，起始溫度設(shè)置為65℃、每過(guò)5min增加5℃、溫度到達(dá)95℃時(shí)停留15min；利用微墻掩膜版與下層微電極對(duì)準(zhǔn)后曝光；同樣的溫度后烘，置于pgmea中顯影并于135℃的熱板上堅(jiān)膜形成微墻陣列；

(3)微通道的制作：使用1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷對(duì)硅片表面進(jìn)行硅烷化處理使其變?yōu)槭杷砻妫话凑?0:1的比例均勻混合pdms預(yù)聚物與固化劑，去除氣泡；在硅烷化處理的硅片上旋涂厚20μm的薄膜并加熱固化得到pdms薄膜微通道；

(4)芯片的組合與封裝：利用手持電鉆在上基底上分別打出直徑1mm的兩個(gè)孔作為實(shí)驗(yàn)緩沖液進(jìn)出口，清洗烘干后經(jīng)過(guò)氧等離子體對(duì)pdms薄膜的上表面和ito微電極面進(jìn)行表面改性后，貼緊加熱鍵合；再次置于氧等離子體中處理后置于硅烷化試劑中5min；取出吹干后迅速貼于下層su-8微墻上，并置于烘箱中每分鐘升溫2℃、溫度到達(dá)150℃保持1h后自然降溫取出；最后將打孔的pdms導(dǎo)管接頭鍵合于芯片玻璃上基底上表面的實(shí)驗(yàn)緩沖液的進(jìn)出口處，使用ab膠密封加固接縫處，得到最終的三明治式芯片。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明設(shè)計(jì)的三明治式流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片將介電泳的非侵入、免標(biāo)記、易控制與流體動(dòng)力學(xué)的高效率、低成本結(jié)合，克服了現(xiàn)有芯片原理單一產(chǎn)生的效率低、可靠性低、成本高且不易釋放單細(xì)胞的問(wèn)題。

2.本發(fā)明使用三明治式芯片結(jié)構(gòu)，微墻位于帶有ito微電極的上層玻璃基底和帶有ito微電極的下層玻璃基底之間，一方面可以將流體動(dòng)力學(xué)與介電泳結(jié)合增加捕獲力度后實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和單細(xì)胞的控制釋放，另一方面本三明治式芯片中的微電極排布可以類似于三維電極，相對(duì)二維的芯片結(jié)構(gòu)，可以克服電場(chǎng)在通道高度方向的衰減，提高芯片捕獲效率，相對(duì)三維的芯片結(jié)構(gòu)，又避免了三維電極復(fù)雜的制作工藝，使電極結(jié)構(gòu)更加靈活多樣。

3.使用的玻璃基底和ito金屬微電極透光性能良好，便于實(shí)驗(yàn)的觀察，生物兼容性良好、成本特別低廉、特別是ito金屬導(dǎo)電性能良好、在免疫分析中不會(huì)產(chǎn)生額外的背景噪音且容易腐蝕成形，因此，整個(gè)芯片的成本特別低廉。

4.使用su-8制作微墻陣列，相對(duì)現(xiàn)有的微墻制作技術(shù)避免了干法刻蝕玻璃或者硅片，僅使用光刻顯影就可以成型，工藝簡(jiǎn)單且可靠，su-8生物可兼容且是疏水材料又避免了細(xì)胞的黏附。

5.微墻陣列和相對(duì)應(yīng)微電極的數(shù)量可以根據(jù)需要擴(kuò)展。

6.使用氧等離子與硅烷化處理方法進(jìn)行芯片的鍵合封裝，更加簡(jiǎn)單、牢固、可靠。

7.將制作的芯片與設(shè)計(jì)的pcb轉(zhuǎn)接板連接后，通過(guò)控制pcb板上的撥碼開關(guān)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)微墻中電信號(hào)的通斷達(dá)到單細(xì)胞的釋放，從而可以實(shí)現(xiàn)非目標(biāo)單細(xì)胞的鑒定與篩查。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的芯片整體效果圖；

圖2為本發(fā)明的芯片結(jié)構(gòu)分體示意圖；

圖3為本發(fā)明的芯片側(cè)視圖；

圖4為本發(fā)明的單層微電極版圖；

圖5為圖4中虛線部分的放大圖；

圖6為本發(fā)明的雙層微電極俯視示意圖；

圖7為本發(fā)明的微墻陣列示意圖；

圖8為本發(fā)明的微通道示意圖；

圖9為本發(fā)明的芯片的內(nèi)部流場(chǎng)仿真結(jié)果；

圖10為本發(fā)明的芯片的電極全部接通時(shí)芯片內(nèi)的電場(chǎng)分布仿真結(jié)果一

圖11為本發(fā)明的芯片的電極全部接通時(shí)芯片內(nèi)的電場(chǎng)分布仿真結(jié)果二

圖12為本發(fā)明的芯片的電極斷開b行(2)列電極后的電場(chǎng)分布仿真結(jié)果一

圖13為本發(fā)明的芯片的電極斷開b行(2)列電極后的電場(chǎng)分布仿真結(jié)果二

圖14為本發(fā)明的芯片工作原理示意圖；

圖15為本發(fā)明芯片沒有施加外部交流電信號(hào)時(shí)的俯視圖；

圖16為本發(fā)明芯片接通所有電極時(shí)的示意圖；

圖17為本發(fā)明芯片斷開b行(2)列對(duì)應(yīng)電極的示意圖；

圖18為本發(fā)明的芯片外部信號(hào)轉(zhuǎn)接板示意圖；

圖19為本發(fā)明的芯片捕獲的2×3陣列細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖20為圖19對(duì)應(yīng)的熒光圖；

圖21為本發(fā)明的芯片釋放第二行第一列單細(xì)胞后的結(jié)果；

圖22為圖21對(duì)應(yīng)的熒光圖；

圖中：1-導(dǎo)管接頭，2-上基底，3-上層微電極，4-微通道，5-微墻陣列，6-下層微電極，7-下基底，8-單細(xì)胞，9-八位撥碼開關(guān)，10-連接芯片的焊盤，11-連接函數(shù)信號(hào)發(fā)生器的焊盤，12-方形通孔。

具體實(shí)施方式

如圖1、2、3所示，一種流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片，整體為三明治式結(jié)構(gòu)，由七部分組成，由上至下依次為導(dǎo)管接頭1、上基底2、上層微電極3、微通道4、微墻陣列5、下層微電極6及下基底7；其中，導(dǎo)管接頭1是使用聚二甲基硅氧烷pdms制作的塊狀結(jié)構(gòu)，用于實(shí)驗(yàn)緩沖液的進(jìn)樣與出樣；上基底2使用厚1.1mm透明的玻璃，作為上層微電極3的基底材料；如圖4、5所示，上層微電極3采用ito金屬制作成集成叉指電極；微通道4采用pdms薄膜，并使用刀片切出包含有全部陣列微墻的通道結(jié)構(gòu)（如圖8所示）；如圖6、7所示，微墻陣列5是微米級(jí)的圓形深孔，采用負(fù)光刻膠su-8經(jīng)過(guò)光刻顯影制得，每個(gè)微墻位于上下層微電極交叉處的中心，用以產(chǎn)生流體水動(dòng)力增強(qiáng)介電泳對(duì)細(xì)胞的捕獲效率；下層微電極6仍為ito金屬叉指電極（如圖4所示）；下層微電極6與上層微電極3在空間上垂直相交設(shè)置（如圖6所示），下基底7同樣使用厚1.1mm透明的玻璃制作，作為下層微電極6和微墻陣列5的基底材料，本發(fā)明中的微墻陣列5和相對(duì)應(yīng)微電極的數(shù)量可以根據(jù)需要擴(kuò)展。

根據(jù)仿真優(yōu)化結(jié)果，所述的ito微電極厚185nm，pdms微通道厚20μm，su-8微墻直徑15μm、高6μm。

三明治式流體增強(qiáng)介電泳單細(xì)胞排列與控制芯片的制作工藝為：首先做出上下層微電極基底；然后在下層微電極上制作微墻陣列；利用氧等離子鍵合法將pdms導(dǎo)管接頭與打了孔的上層電極鍵合；硅烷化處理硅片后制作出pdms薄膜，同樣用氧等離子法鍵合于上層微電極面；結(jié)合氧等離子鍵合與硅烷化溶液浸泡將上下基底鍵合，得到芯片成品。其具體的制作步驟為：

(1)微電極的制作：將沉積有ito薄膜的玻璃依次置于丙酮、乙醇、去離子水中分別超聲清洗10min，烘干后進(jìn)行hmds處理增強(qiáng)光刻膠與ito的粘附性并在ito面均勻涂厚2μm的正光刻膠；前烘后利用設(shè)計(jì)的掩膜版進(jìn)行曝光；后烘后顯影去除被曝光部分的膠；堅(jiān)膜后置于ito刻蝕液中去除多余金屬，剝離去除多余光刻膠，形成設(shè)計(jì)的微電極結(jié)構(gòu)。

(2)微墻陣列的制作：取一片制備的微電極置于等離子鍵合機(jī)內(nèi)使表面改性為親水；使用勻膠機(jī)旋涂厚6μm的su-8負(fù)光刻膠，置于熱板上前烘，起始溫度設(shè)置為65℃、每過(guò)5min增加5℃、溫度到達(dá)95℃時(shí)停留15min；利用設(shè)計(jì)的微墻掩膜版與下層微電極對(duì)準(zhǔn)后曝光；同樣的溫度后烘（起始溫度設(shè)置為65℃、每過(guò)5min增加5℃、溫度到達(dá)95℃時(shí)停留15min），置于pgmea中顯影并于135℃的熱板上堅(jiān)膜形成微墻陣列。

(3)微通道的制作：使用1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷對(duì)硅片表面進(jìn)行硅烷化處理使其變?yōu)槭杷砻?；按?0:1的比例均勻混合pdms預(yù)聚物與固化劑，去除氣泡；在硅烷化處理的硅片上旋涂厚20μm的薄膜并加熱固化得到pdms薄膜微通道。

(4)芯片的組合與封裝：利用手持電鉆在上層微電極基底上分別打出直徑1mm的兩個(gè)孔作為實(shí)驗(yàn)緩沖液進(jìn)出口，清洗烘干后經(jīng)過(guò)氧等離子體對(duì)pdms薄膜的上表面和ito微電極面進(jìn)行表面改性后，貼緊加熱鍵合；再次置于氧等離子體中處理后置于硅烷化試劑中5min；取出吹干后迅速貼于下層su-8微墻上，并置于烘箱中每分鐘升溫2℃、溫度到達(dá)150℃保持1h后自然降溫取出；最后將打孔的pdms導(dǎo)管接頭鍵合于芯片玻璃上基底上表面的實(shí)驗(yàn)緩沖液的進(jìn)出口處，使用ab膠密封加固接縫處得到最終的三明治式芯片。

圖9是芯片內(nèi)部一個(gè)微墻處的流場(chǎng)仿真，可以看出流體會(huì)流入微墻，因此細(xì)胞會(huì)受流體力作用流入微墻，從而增強(qiáng)介電泳芯片捕獲細(xì)胞的效率；圖10和圖11是電極全部接通時(shí)芯片內(nèi)的電場(chǎng)分布，可以看出在電極交叉處的電場(chǎng)強(qiáng)度最大，在正介電泳力和流體力的作用下可以捕獲單細(xì)胞如圖14所示，圖12和圖13是斷開b行(2)列電極后的電場(chǎng)分布，可以看出此處電場(chǎng)變?yōu)樨?fù)，在負(fù)介電泳力和流體力作用下，可以釋放對(duì)應(yīng)微墻中的單細(xì)胞。綜合圖9、10、11、12、13、14，以4×4陣列為例得到芯片兩種工作模式，圖15是沒有施加外部交流電信號(hào)時(shí)的俯視圖，圖16為接通所有電極，每個(gè)微墻處會(huì)捕獲一個(gè)單細(xì)胞，此時(shí)為陣列化捕獲模式；圖17為斷開b行(2)列對(duì)應(yīng)電極的信號(hào)后，b(2)處的單細(xì)胞被釋放，此時(shí)為選擇性釋放模式。

圖18是設(shè)計(jì)制作的含有4個(gè)8位撥碼開關(guān)的pcb信號(hào)轉(zhuǎn)接板，將芯片的焊盤分別連接至對(duì)應(yīng)的引線，通過(guò)撥碼開關(guān)的通斷可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的獨(dú)立控制。圖19是捕獲的2×3陣列細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖20是對(duì)應(yīng)的熒光圖；圖21是釋放第二行第一列單細(xì)胞后的結(jié)果，圖22是對(duì)應(yīng)的熒光圖。

本發(fā)明突破傳統(tǒng)原理單一的微流控芯片，結(jié)合了介電泳的非侵入、免標(biāo)記、易控制與流體動(dòng)力學(xué)的高效率、低成本，克服了現(xiàn)有芯片的缺點(diǎn)，制作了高通量、高可靠性、高效率、易控制單細(xì)胞的單細(xì)胞排列與控制芯片，對(duì)單細(xì)胞的分析檢測(cè)具有十分重要的意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。