采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測dna鏈斷裂的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒，包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有DAPI熒光染料的試劑管、裝有裂解液的試劑管、裝有堿性電泳緩沖液的試劑管、裝有Tris緩沖液的試劑管、裝有正常熔點瓊脂糖NMA的試劑管、裝有低熔點瓊脂糖LMA的試劑管被放置在所述小孔內(nèi)。本實用新型可更加靈敏、快捷、簡便、安全、有效、直觀的檢測DNA鏈斷裂。
【專利說明】 采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]經(jīng)典的DNA鏈斷裂檢測技術(shù)包括密度梯度沉降法、羥基磷灰石柱層析分析法、熒光快速測定法、脈沖電場凝膠電泳法、熒光原位雜交法(FISH)以及放射自顯影法等。其中蔗糖密度梯度離心法的缺點為敏感性差，不能用于差異較小的實驗條件，操作步驟繁瑣、處理時間較長、誤差較大，定性的實驗意義大于定量的實驗意義，實驗條件要求較高，便利性不夠。脈沖電場凝膠電泳法的缺點為實驗持續(xù)時間長，實驗操作復(fù)雜，耗用多種實驗材料，設(shè)備、試劑昂貴，需要交變電場、酵母體系、各種分子實驗體系、凝膠電泳體系等等，實驗具有局限性，比較適用于由于電離輻射所致的DNA鏈的斷裂檢測，具有一定的危險性，因為所采用的熒光染料是由有一定毒性的溴化乙錠。
實用新型內(nèi)容
[0003]為了解決上述技術(shù)問題，本實用新型的目的在于提供一種用于采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒，可以更加靈敏、快捷、簡便、安全、有效、直觀的檢測DNA鏈斷
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[0004]為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有DAPI熒光染料的試劑管(4)、裝有裂解液的試劑管(5)、裝有堿性電泳緩沖液的試劑管(6)、裝有Tris緩沖液的試劑管(7)、裝有正常熔點瓊脂糖NMA的試劑管⑶、裝有低熔點瓊脂糖LMA的試劑管(9)被放置在所述小孔內(nèi)。
[0005]其中，裂解液為由2.5Μ NaClUOOmM EDTAUOmM Tris與I %肌氨酸鈉混合而成，用前加入1% TritonX-100、10%二甲基亞砜，最終PH為10。
[0006]其中，堿性電泳緩沖液為由ImM EDTA與300mM NaOH混合而成且PH>13。
[0007]其中，所述襯墊(2)上設(shè)有6個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成2排平行排列。
[0008]通過以上技術(shù)方案，本實用新型的有益效果如下:
[0009](I)適用性比較廣，能夠用于再生障礙性貧血、范可尼貧血、血小板減少、三系降低、兩系降低等所有可能存在DNA鏈斷裂的各種疾病的臨床輔助診斷中；
[0010](2)標(biāo)本需求量少；
[0011](3)能夠的清晰的分離并且得到單個有核細(xì)胞的損傷情況，結(jié)果直觀；
[0012](4)實驗過程簡單、效果明顯，更加靈敏、快速；
[0013](5)節(jié)約成本，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益；
[0014](6)采用低毒的熒光染料，無需放射性標(biāo)記，更加安全。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016]圖中，1-盒體，3-盒蓋，2-襯墊，4-裝有DAPI熒光染料的試劑管、5_裝有裂解液的試劑管、6-裝有堿性電泳緩沖液的試劑管、7-裝有Tris緩沖液的試劑管、8-裝有正常熔點瓊脂糖NMA的試劑管、9-裝有低熔點瓊脂糖LMA的試劑管。

【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本實用新型的【具體實施方式】作進(jìn)一步描述，本實用新型的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本實用新型的范圍構(gòu)成任何限制。
[0018]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]如圖1所示，本實用新型提供了一種用于采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒，其包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊2上設(shè)有小孔，裝有DAPI熒光染料的試劑管(4)、裝有裂解液的試劑管(5)、裝有堿性電泳緩沖液的試劑管
(6)、裝有Tris緩沖液的試劑管(7)、裝有正常熔點瓊脂糖NMA的試劑管⑶、裝有低熔點瓊脂糖LMA的試劑管(9)被放置在所述小孔內(nèi)。
[0021]其中，所述襯墊(2)上設(shè)有6個小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成2排平行排列。
[0022]彗星實驗又稱單細(xì)胞凝膠電泳實驗，是由Ostling等于1984年首次提出的一種通過檢測DNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術(shù)。它能有效地檢測并定量分析細(xì)胞中DNA單，雙鏈缺口損傷的程度。當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴散到細(xì)胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性條件下，DNA片段可進(jìn)入凝膠發(fā)生遷移，而在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來。由于這些DNA的分子量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過程中帶負(fù)電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移形成“彗星”狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球形。
[0023]實驗儀器及試劑:
[0024]全磨砂載玻片需要依次經(jīng)過清水沖洗、蒸餾水沖洗、100%乙醇沖洗浸泡，然后烘箱烘干；
[0025]裂解液:2.5M NaClUOOmM EDTAUOmM Tris與I %肌氨酸鈉混合而成，用前加入1% TritonX-100、10%二甲基亞砜，最終 PH 為 10
[0026]堿性電泳緩沖液:lmMEDTA、300mM NaOH 且 PH>13
[0027]Tris 緩沖液:0.4M、PH7.5
[0028]乙醇梯度洗滌液:50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液
[0029]1640培養(yǎng)基:添加10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基
[0030]正常熔點瓊脂糖NMA
[0031]低熔點瓊脂糖LMA
[0032]DAPI熒光染料
[0033]其中，裂解液、堿性電泳緩沖液、Tris緩沖液、正常熔點瓊脂糖NMA、低熔點瓊脂糖LMA, DAPI熒光染料位于試劑盒中的試劑管(4)-(9)。
[0034]檢測步驟如下:
[0035]配置0.8%正常熔點瓊脂糖，將50?55°C全磨砂載玻片，依次浸入熱的瓊脂糖中，保濕盒中平放保存，37°C培養(yǎng)箱中過夜處理，作為第一層膠備用；
[0036]取10?30ul外周血或骨髓血與Iml RPMI1640培養(yǎng)基(添加有10%胎牛血清)混勻，2000rpm離心5min，沉淀用20?40 μ I RPMI1640(添加有10%胎牛血清)重懸，樣品制備完成；
[0037]配置0.5?0.6%低熔點瓊脂糖，待溫度降至42°C時，將低熔點瓊脂糖與樣品按照3:1?2:1的比例配置第二層膠100 μ I ;
[0038]將第二層膠均勻地鋪到第一層膠上，加蓋蓋玻片，4°C下處理lOmin，使第二層膠凝結(jié)；
[0039]移除蓋玻片，然后將整個載玻片水平浸入4°C裂解液中，4°C處理3_15h，使所有細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)被破壞，使得RNA以及蛋白分子釋放出來。
[0040]采用4°C雙蒸水清洗三次，每次5min，終止裂解液的作用。
[0041]將載玻片置于水平電泳槽中，倒入4 °C堿性電泳緩沖液(ImMEDTA, 300mMNa0H, PH>13)，沒過膠面0.25cm,解旋15min左右，使得DNA雙鏈解旋成單鏈。
[0042]在25v的電壓與300mA的電流下低溫避光，電泳1min左右，在電壓存在的情況下，損傷的DNA分子會向正極移動，從而出現(xiàn)彗星圖像。
[0043]取出載玻片，用蒸餾水沖洗之后，0.4MTris (PH7.5)中和2?3次，使得堿性電泳緩沖液失去作用。
[0044]依次采用50%、70%、80%、90%、100%乙醇在常溫下脫水各一次，每次51^11，使得瓊脂糖膠脫水，得到更加清晰的圖像。
[0045]采用8 μ I DAPI染色后,加蓋蓋玻片。
[0046]在常溫以及4°C下分別處理后，熒光顯微鏡鏡檢，使得熒光染料徹底浸入細(xì)胞中，染色更加均勻、清晰。
[0047]上面已經(jīng)舉例說明了本實用新型的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實用新型的精神和范圍下可以對本實用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA鏈斷裂的試劑盒，其特征在于包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有DAPI熒光染料的試劑管⑷、裝有裂解液的試劑管(5)、裝有堿性電泳緩沖液的試劑管(6)、裝有Tris緩沖液的試劑管(7)、裝有正常熔點瓊脂糖NMA的試劑管(8)、裝有低熔點瓊脂糖LMA的試劑管(9)被放置在所述小孔內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(2)上設(shè)有6個小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成2排平行排列。
【文檔編號】G01N27/447GK204142680SQ201420429802
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】傅廷嬌, 熊凱, 程宇, 梁超, 王緒華, 陳忠, 黃士昂, 方國偉 申請人:北京海思特臨床檢驗所有限公司