本發(fā)明涉及生物技術(shù)可再生能源領(lǐng)域，具體為一種厭氧真菌甲烷菌共培養(yǎng)物及其厭氧發(fā)酵小麥秸稈生產(chǎn)甲烷的方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食作物，播種面積廣泛，每年伴隨產(chǎn)生的秸稈數(shù)量也是非常巨大的。近年來(lái)，在全球范圍內(nèi)，隨著人口數(shù)量的增加，生活質(zhì)量提高導(dǎo)致的對(duì)能源的需求急劇上升。傳統(tǒng)的能源物質(zhì)面臨枯竭的危險(xiǎn)，且這些傳統(tǒng)能源物質(zhì)在使用時(shí)產(chǎn)生了大量溫室氣體，污染環(huán)境。小麥秸稈，作為可再生能源物質(zhì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。但是目前我國(guó)農(nóng)村的大量小麥秸稈資源完全處于高消耗、高污染、低利用率、低產(chǎn)出狀況，小麥秸稈作為能源物質(zhì)沒(méi)有得到合理開(kāi)發(fā)利用。通過(guò)厭氧消化可再生資源(木質(zhì)纖維素)產(chǎn)生的生物氣(甲烷)，被認(rèn)為是一種能夠替代化石燃料理想的能源。

木質(zhì)纖維素是小麥秸稈的主要成分，木質(zhì)纖維素的水解是整個(gè)厭氧消化中的限速步驟，也是整個(gè)技術(shù)的難點(diǎn)。木質(zhì)纖維素素生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維和木質(zhì)素組成，木質(zhì)素和半纖維素結(jié)合的共價(jià)鍵將纖維素分子包埋其中，木質(zhì)素中醚鍵和碳-碳鍵形成的具有三維結(jié)構(gòu)高分子芳香類(lèi)化合物，這些強(qiáng)的鍵抑制水解酶的作用。因此，需要對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理。常見(jiàn)的預(yù)處理木質(zhì)纖維素方法有機(jī)械法、熱處理法、化學(xué)處理，這些都能有效的促進(jìn)厭氧消化，但這些預(yù)處理方法成本高，不環(huán)保。普通的微生物處理也存在較多缺陷，單一微生物處理效果不好，人工構(gòu)件的復(fù)合菌群效果也不理想，各菌種間存在相互拮抗的表現(xiàn)，導(dǎo)致預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率低。

專(zhuān)利cn105505995a本專(zhuān)利提出一種利用瘤胃微生物預(yù)處理水稻秸稈提高甲烷產(chǎn)量的方法，取得了一定效果，但該方法采用瘤胃液進(jìn)行預(yù)處理，瘤胃液的來(lái)源受限，必須是屠宰反芻動(dòng)物后方能獲得；其次，瘤胃液中成分復(fù)雜，處理效果不穩(wěn)定；再次，直接取出的瘤胃液必須立即使用，不方便儲(chǔ)存運(yùn)輸，適用范圍受到限制；最后，瘤胃液中成分多樣，氣味不好，不方便使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是客服上述技術(shù)的不足，提出一種自然共存的厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物體系及使用該共培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵小麥秸稈生產(chǎn)甲烷的方法。

本發(fā)明中厭氧發(fā)酵使用的菌種，是厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養(yǎng)物，piromycesyaktz+m.ruminantium，該共培養(yǎng)物保藏于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.12952，保藏時(shí)間為2016年11月25日，分類(lèi)名稱(chēng)為：一株厭氧真菌piromyces與反芻獸甲烷短桿菌(methenobrevibacterruminantium)的共培養(yǎng)物。seqidno.1為piromycesyaktz的its1序列，seqidno.2為m.ruminantium的16srdna序列。

本發(fā)明的另一目的是提供一種厭氧發(fā)酵小麥秸稈的方法，具體包括如下步驟：

（1）piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物菌劑的制備

將piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物菌液以10%（v/v）接種量接種到厭氧培養(yǎng)基中，加入1%（w/v）風(fēng)干粉碎的小麥秸稈作為底物，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，置39℃厭氧培養(yǎng)72h即得到高活力菌劑。

厭氧培養(yǎng)基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4°c離心20min后的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。

加入小麥秸稈作為底物后除氧。高溫高壓滅菌。

作為優(yōu)選，復(fù)合抗生素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素，在厭氧培養(yǎng)基溶液中的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。

（2）小麥秸稈發(fā)酵生產(chǎn)甲烷

吸取步驟（1）制備的菌劑，按10%（v/v）接種量接入以1%（w/v）小麥秸稈為底物的與步驟（1）相同的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，39°c厭氧培養(yǎng)7天。

作為優(yōu)選，復(fù)合抗生素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素，在厭氧培養(yǎng)基溶液中的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。

本發(fā)明中采用的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantiu是從青藏高原天祝南泥灣牧場(chǎng)的全放牧牦牛瘤胃內(nèi)容物中分離的自然共存的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養(yǎng)物，牦牛瘤胃中的微生物協(xié)同降解低質(zhì)野草為牦牛提供生存必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使牦牛適應(yīng)青藏高原的嚴(yán)酷環(huán)境而生存。長(zhǎng)期的自然選擇和進(jìn)化使牦牛瘤胃成為一個(gè)高效木質(zhì)纖維素降解酶系統(tǒng)，與人為混合的厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物相比，牦牛瘤胃自然存在的厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和高效的木質(zhì)纖維素降解能力。采用piromycesyaktz+m.ruminantium發(fā)酵小麥秸稈，產(chǎn)甲烷量可達(dá)到3.7mmol/gdm。

在發(fā)酵過(guò)程中添加復(fù)合抗生素，可防止共培養(yǎng)物體系不受細(xì)菌污染，提高厭氧發(fā)酵效率。

同時(shí)，本發(fā)明中采用的共培養(yǎng)物可以通過(guò)保藏在體外存活傳代，突破了使用瘤胃液的時(shí)間和地域限制，便于推廣，為生產(chǎn)提供了極大的方便。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基如下：

厭氧培養(yǎng)基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4°c離心20min后的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。

鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。

加入小麥秸稈為底物后除氧。高溫高壓滅菌。

實(shí)施例一、piromycesyaktz+m.ruminantium菌劑的制備。

吸取1mlpiromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物接種到20ml體積的亨氏厭氧管中的9ml以風(fēng)干粉碎的小麥秸稈為底物的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素，加入復(fù)合抗生素后，培養(yǎng)基溶液終濃度青霉素：1600iu/ml和硫酸鏈霉素：2000iu/ml，39℃厭氧培養(yǎng)72h，即達(dá)到生長(zhǎng)高峰，此時(shí)發(fā)酵液為高活力菌劑。

實(shí)施例二、厭氧發(fā)酵秸稈生產(chǎn)甲烷。

在100ml體積厭氧發(fā)酵瓶中盛45ml液體基本培養(yǎng)基，以0.5g風(fēng)干粉碎后的小麥秸稈作為底物，除氧，滅菌。把傳代培養(yǎng)72h的piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物用無(wú)菌注射器吸取5ml接種到上述加有小麥秸稈的厭氧培養(yǎng)基中，同時(shí)加入復(fù)合抗生素（培養(yǎng)基溶液終濃度青霉素：1600iu/ml和硫酸鏈霉素：2000iu/ml），39°c厭氧培養(yǎng)7天。共設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，隔24h測(cè)定厭氧瓶中的甲烷量。通過(guò)氣相色譜法測(cè)定甲烷：使用氣相色譜儀（gc522，伍豐儀器，中國(guó)），配置有g(shù)ps101柱（2m×3mm），熱導(dǎo)檢測(cè)器，汽化室250°c，柱溫100°c，檢測(cè)器溫度150°c，載氣為氮?dú)狻?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantium高效降解小麥秸稈的同時(shí)產(chǎn)生大量甲烷，具體結(jié)果如下表：

注:^b，^c，^d表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(p<0.05)。

共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantium在7天內(nèi)降解小麥秸稈達(dá)到的最高值3.7mmol/gdm。

通過(guò)以上我們可以看到，牦牛瘤胃自然共培養(yǎng)物piromycesyaktz+m.ruminantium共培養(yǎng)物降解小麥秸稈的同時(shí)產(chǎn)生大量甲烷，降解小麥秸稈產(chǎn)生最高產(chǎn)量ch43.7mmol/gdm，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

sequencelisting

<110>甘肅省科學(xué)院生物研究所

<120>一種厭氧真菌甲烷菌共培養(yǎng)物及其發(fā)酵秸稈產(chǎn)甲烷的方法

<160>2

<210>1

<211>394

<212>dna

<213>piromycesyaktz

<400>1

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