一株高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法。本發(fā)明通過基因工程克隆?構(gòu)建?重組獲得了一株產(chǎn)殼聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115?LX菌株，由該菌株按照本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液殼聚糖酶酶活可達500～1000U/ml，酶活性很高，無需提純，可直接用于殼聚糖的降解。在殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。CGMCC No.1066020150323
【專利說明】
一株高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖是一種直線型的多糖，由0-(l，4)-D-氨基葡萄糖組成。在自然界中，這種聚 合物部分是乙?；?。事實上，殼聚糖用來廣泛的描述聚合物，這種聚合物由D-氨基葡萄糖 和N-乙酰-D氨基葡萄氨殘基組成。
[0003] 殼聚糖大分子的分子量通常在幾十萬左右，因其分子中內(nèi)外氫鍵的相互作用，只 能溶于少數(shù)的稀酸溶液中，而不能溶于水中。殼寡糖是利用殼聚糖為原料，通過生物工程技 術(shù)降解制備獲得的2~10個氨基葡萄糖以0_(1，4)糖苷鍵連接而成的寡聚糖。由于殼寡糖分 子量小，水溶性好，易吸收，功能作用強，生物活性高等特點，在國外素有人體第六大生命要 素、軟黃金之美譽，作為新世紀前瞻性生物技術(shù)產(chǎn)品，其在醫(yī)藥、功能性食品、日化、農(nóng)業(yè)、飼 料添加等領(lǐng)域具備廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]殼聚糖水解酶主要有殼聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非專一性水解酶等。殼聚 糖酶是殼聚糖的專一性水解酶，能特異性將殼聚糖水解成聚合度為2~8的殼寡糖，是制備 殼寡糖的主要研究方向。
[0005] 目前制備殼寡糖的方法主要有化學(xué)降解法和酶解法，采用化學(xué)法降解寡糖得率 低，產(chǎn)物分離困難，而且對環(huán)境污染嚴重。酶解法則具有反應(yīng)條件溫和，寡糖得率高，不造成 環(huán)境污染等優(yōu)點。所以如何獲得高效的殼聚糖酶是目前行業(yè)的迫切需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一株產(chǎn)殼聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-LX株(本發(fā)明簡稱重組菌GS115-LX株）；
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述巴斯德畢赤酵母GS115-LX株高效產(chǎn)酶的發(fā)酵培 養(yǎng)方法。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實施的：
[0009] 1.一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX株，該菌株 已于2015年03月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 10660。
[0010] 2.殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母GS115-LX株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液酶活可達500 ~1000U/ml ;
[0011] 3.權(quán)利要求2所述的殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母GS115-LX株的發(fā)酵產(chǎn)酶的培 養(yǎng)方法如下：
[0012] (1)發(fā)酵過程中所用培養(yǎng)基配方：
[0013] 1)固體培養(yǎng)基:酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1 ? 8%，加水至100%，pH 自然，115 °C滅菌20min;
[0014] 2)搖瓶種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至 100%，pH自然，115°C滅菌20min;
[0015] 3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85%磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加 水至總體積為1L，121°C滅菌3 0m i n;
[0016] 4)補料培養(yǎng)基：甲醇。
[0017] (2)發(fā)酵培養(yǎng)方法：
[0018] 1)斜面培養(yǎng)
[0019] 將GS115-LX菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后置于恒溫 培養(yǎng)箱中在溫度28~30 °C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面培養(yǎng)物；
[0020] 2)種子培養(yǎng)
[0021] 使用接種環(huán)取一環(huán)步驟1)得到的斜面培養(yǎng)物接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后置于 恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng)物； [0022] 3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0023 ]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)體積計1 %~2 %接種量，將步驟2)得到的種子 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后恒溫28~30°C，控制轉(zhuǎn)速300r/min，壓力 0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，向發(fā)酵罐中補加甲醇，補加的總量約為初始發(fā)酵液 體積的25%~30%，再繼續(xù)培養(yǎng)2~3天，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束所得到的發(fā)酵液酶活可達500 ~1000U/ml 〇
[0024]本發(fā)明【具體實施方式】
[0025] 1 ?菌種
[0026] 本發(fā)明獲得該菌株的具體方法如下：
[0027] 對產(chǎn)殼聚糖酶假單胞菌L2菌株（自行采集)的殼聚糖酶編碼基因choAl進行序列優(yōu) 化后，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PPIC9K-LX并轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母(Pichia 口881:〇1^8)63115株 (由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院獲贈）所得，該株菌命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)GS115-LX菌株，并已于2015年03月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中 國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為 CGMCC No. 10660。巴斯德畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，表達載體需與宿主染色體發(fā)生同 源重組，外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達，外源基因穩(wěn)定性很好。
[0028] choA基因來源于假單胞菌L2菌株并通過PCR擴增得到，擴增引物分別為：
[0029] choAFl: 5' -CAGGCTACGACCCCCCAC-3'(序列 1)
[0030] choARl: 5' -TCACTGCCACGACATGTTCTTC-3'(序列2)，
[0031] 引物設(shè)計依據(jù)McchoA基因序列，PCR擴增使用FastPfu DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物純化后 加A，并克隆到pMD18_T載體上得到P18t_choA載體。測序后choA與GenBank中的序列比對。缺 失信號肽序列的choA基因序列，通過在線稀有密碼子分析軟件和畢赤酵母密碼子豐度數(shù)據(jù) 庫分析優(yōu)化choA序列密碼子，并在畢赤酵母中異源表達（http : //www. kazusa . or . jp/ codon/) mRNA的結(jié)構(gòu)使用在線RNA二級結(jié)構(gòu)軟件進行預(yù)測(http: //www. genebee .msu. su/ services/rna2_reduced.html)。人工完成密碼子豐度平衡、GC含量和RNA二級機構(gòu)后，choA 序列優(yōu)化完成。合成優(yōu)化后的choA序列并可溶到pUC57載體上，得到載體pUC-choA-opt。優(yōu) 化與未優(yōu)化兩個序列以合成的DNA或pl8T-choA質(zhì)粒為模板通過PCR擴增得到，擴增所用引 物為：
[0036] 表達His標簽的序列通過反向引物插入到PCR產(chǎn)物中。將得到的PCR產(chǎn)物克隆到畢 赤酵母表達載體pPIC9K的SnaBI和AvrII位點之間，得到載體p9K-choA_opt和p9K-choA_un (未優(yōu)化）；利用通用引物測序后(5 ' A0X1正向引物測序:5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 '（序 列7)，載體利用限制性內(nèi)切酶SacI或Dral線性化并通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115感受 態(tài)細胞中。通過SacI載體線性化后的載體轉(zhuǎn)化后，得到Mut+的轉(zhuǎn)化子，（甲醇利用型His+Mut + )在畢赤酵母基因組中插入到A0X1基因中：然而，Bgin線性化后的載體得到了Muts轉(zhuǎn)化子 (慢性甲醇利用His+Mut s)，重組置換A0X1基因。轉(zhuǎn)化后，在MD培養(yǎng)基上通過各種濃度的G418 篩選，30°C培養(yǎng)2天。
[0037] 菌株性狀特征:菌落呈圓形，乳白色，表面光滑。
[0038] 該菌株表達的殼聚糖酶為胞外酶，存在于上清中，且純度較高，雜蛋白較少，去菌 體留發(fā)酵液上清即可使用。
[0039]菌株保存方法:40 %甘油管-20 °C保藏6個月，40 %甘油管-80 °C保藏2年。
[0040] 2.本發(fā)明還涉及所述基因工程菌GS115-LX株高效產(chǎn)酶的發(fā)酵方法。
[00411 (1)該發(fā)酵方法涉及的培養(yǎng)基如下：
[0042] 1)固體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至100%， 115°C 滅菌 20min;
[0043] 2)搖瓶種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至 100%，115°C滅菌20min;
[0044] 3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85 %磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加 水至總體積為1L，121°C滅菌3 0m i n;
[0045] 4)補料培養(yǎng)基：甲醇。
[0046] (2)該培養(yǎng)方法具體步驟如下：
[0047] 1)斜面培養(yǎng)
[0048] 將GS115-LX菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后置于恒溫 培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面菌種；
[0049] 2)種子培養(yǎng)
[0050]使用接種環(huán)取一環(huán)步驟1)得到的斜面培養(yǎng)物接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后置于 恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng)物； [00511 3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0052]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)體積計1 %~2 %接種量，將步驟2)得到的種子 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后恒溫28~30°C，控制轉(zhuǎn)速300r/min，壓力 0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，向發(fā)酵罐中補加甲醇，補加的總量約為初始發(fā)酵液 體積的25%~30%，再繼續(xù)培養(yǎng)2~3天，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束所得到的發(fā)酵液酶活可達500 ~1000U/ml〇
[0053]本發(fā)明涉及的微生物資源信息
[0054] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)殼聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115-LX株，該菌株是對產(chǎn)殼聚糖酶假單胞細菌L2的殼聚糖酶編碼基因choAl進行序列優(yōu) 化后，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PPIC9K-LX并轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115所得，該株菌被命名為 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX株，并已于2015年03月23日送交北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 10660。
[0055]產(chǎn)殼聚糖酶假單胞細菌L2
[0056]假單胞菌L2本發(fā)明人2012年由河北分離獲得的一株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，該菌株最 適合的培養(yǎng)條件為28°C，pH6.8,可利用葡萄糖、麥芽糖、甘油等碳源，該菌株可以利用氨態(tài) 氮，不可以利用硝態(tài)氮和尿素，同時該菌株不產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶。巴斯德畢赤酵母 GS115株，該菌株為分子生物學(xué)領(lǐng)域所常用的宿主菌株，是由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院獲 贈。
【附圖說明】
[0057]圖1本發(fā)明涉及的高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌構(gòu)建原理示意圖。
[0058]本發(fā)明的積極意義
[0059] 本發(fā)明涉及一株高效殼聚糖酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法。本發(fā)明通過基因工程克隆-構(gòu)建-重組獲得了一株產(chǎn)殼聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母GS115-LX株，由該菌株按 照本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液殼聚糖酶酶活可達500~1000U/ml， 酶活性很高，無需提純，可直接用于殼聚糖的降解。在殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的 應(yīng)用前景。 實施例
[0060] 下面，通過具體的實施例對本發(fā)明進行更具體的描述，但本發(fā)明的范圍并不僅限 于此；
[0061] 在下面實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為業(yè)內(nèi)人士所熟識的常規(guī)方 法。
[0062] 在下述實施例中所使用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑購 買得到。
[0063] 儀器說明：恒溫培養(yǎng)箱:型號GHX-9080B金壇市瑞華儀器有限公司
[0064]恒溫搖床:型號QHZ-98A太倉華美生化儀器廠
[0065]發(fā)酵罐系統(tǒng)一一鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責任公司
[0066] 實施例1
[0067] --GS115-LX菌株的發(fā)酵培養(yǎng)(100L罐）
[0068]培養(yǎng)基成分：
[0069] 1)固體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1 ? 8%，加水至100%， 115°C 滅菌 20min;
[0070] 2)搖瓶種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至 100%，115°C滅菌20min;
[0071] 3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85 %磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加 水至總體積為1L，121°C滅菌3 0m i n;
[0072] 4)補料培養(yǎng)基：甲醇。
[0073]在以后的實驗中，培養(yǎng)基的配方不改變，均使用此培養(yǎng)基。
[0074] 首先，斜面培養(yǎng)，將GS115-LX菌株保藏的甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基 的斜面上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面菌 種；
[0075] 然后，使用接種環(huán)取一環(huán)GS115-LX菌株斜面菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后 置于恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30 °C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng) 物；
[0076] 100L罐發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)按罐體積40%的裝液量進行稱料 后滅菌，將制備好的種子液按發(fā)酵液體積的2%進行無菌接種，接種后設(shè)置培養(yǎng)條件，恒溫 28~30°C，控制轉(zhuǎn)速300r/min，壓力0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，開始向發(fā)酵罐 中緩慢補加甲醇，本罐補加的總量為10.5L，再繼續(xù)培養(yǎng)2天；
[0077] 酶活檢測，取發(fā)酵液100ml，10000r/min離心5min，取上清液用常規(guī)的DNS法檢測酶 活，經(jīng)檢測殼聚糖酶酶活達675U/ml，發(fā)酵結(jié)束。
[0078] 實施例2
[0079] --GS115-LX菌株的發(fā)酵培養(yǎng)(100L罐）
[0080]培養(yǎng)基成分：
[0081 ] 1)固體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2 %，瓊脂1.8 %，加水至100 %， 115°C 滅菌 20min;
[0082] 2)搖瓶種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至 100%，115°C滅菌20min;
[0083] 3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85 %磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加 水至總體積為1L，121°C滅菌3 Om i n;
[0084] 4)補料培養(yǎng)基：甲醇。
[0085] 在以后的實驗中，培養(yǎng)基的配方不改變，均使用此培養(yǎng)基。
[0086] 首先，斜面培養(yǎng)，將GS115-LX菌株保藏的甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基 的斜面上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面菌 種；
[0087] 然后，使用接種環(huán)取一環(huán)GS115-LX菌株斜面菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后 置于恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30 °C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng) 物；
[0088] 100L罐發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)按罐體積40%的裝液量進行稱料 后滅菌，將制備好的種子液按發(fā)酵液體積的2%進行無菌接種，接種后設(shè)置培養(yǎng)條件，恒溫 28~30°C，控制轉(zhuǎn)速300r/min，壓力0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，開始向發(fā)酵罐 中緩慢補加甲醇，本罐補加的總量為12L，再繼續(xù)培養(yǎng)2天；
[0089] 酶活檢測，取發(fā)酵液100ml，10000r/min離心5min，取上清液用常規(guī)的DNS法檢測酶 活，經(jīng)檢測殼聚糖酶酶活達981U/ml，發(fā)酵結(jié)束。
[0090] 實施例3
[0091 ] --GS115-LX菌株的發(fā)酵培養(yǎng)(500L罐）
[0092]培養(yǎng)基成分：
[0093] 1)固體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至100%， 115°C 滅菌 20min;
[0094] 2)搖瓶種子培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至 100%，115°C滅菌20min;
[0095] 3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85 %磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加 水至總體積為1L，121°C滅菌3 0m i n;
[0096] 4)補料培養(yǎng)基：甲醇。
[0097] 首先，斜面培養(yǎng)，將GS115-LX菌株保藏的甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基 的斜面上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面菌 種；
[0098] 然后，一級種子培養(yǎng)，使用接種環(huán)取一環(huán)斜面菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后 置于恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30 °C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng) 物；
[00"] 100L罐中的二級種子培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)基按照罐體積40%的裝液量稱量培養(yǎng)基后 滅菌，然后將一級種子液按罐液體積的2%進行無菌接種，接種后設(shè)置培養(yǎng)條件，溫度28~ 30°C，轉(zhuǎn)速300r/min，壓力0 ? 05MPa，通風比0 ? 5vvm，培養(yǎng)1天后，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐；
[0100] 500L罐發(fā)酵培養(yǎng)，將基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基按罐體積的40%的裝液量稱量培養(yǎng)基后滅菌， 然后將培養(yǎng)好的二級種子液按罐液體積的2%進行無菌接種，接鐘后設(shè)置培養(yǎng)條件，溫度28 ~30°C，轉(zhuǎn)速300r/min，壓力0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，開始向發(fā)酵罐中緩慢 補加甲醇，本罐補加的總量為50L，再繼續(xù)培養(yǎng)2天；
[0101] 酶活檢測，取發(fā)酵液l〇〇ml，10000r/min離心5min，取上清液用常規(guī)的DNS法檢測酶 活，經(jīng)檢測殼聚糖酶酶活達875U/ml，發(fā)酵結(jié)束。
【主權(quán)項】
1. 一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX菌株，該菌株已 于2015年03月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 10660。2. 如權(quán)利要求1所述一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母GS115-LX株，其特征在于該 菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液殼聚糖酶酶活可達500~1000U/ml。3. 如權(quán)利要求2所述的一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌巴斯德畢赤酵母GS115-LX株的發(fā)酵產(chǎn)殼聚 糖酶的培養(yǎng)方法如下： (1) 發(fā)酵過程中所用培養(yǎng)基配方： 1) 固體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2 %，瓊脂1.8 %，加水至100 %，pH自 然，115 °C 滅菌 20min; 2) 搖瓶種子培養(yǎng)基:酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，加水至100 %，pH 自然，115 °C滅菌20min; 3) 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85 %磷酸10ml，硫酸鈣3g，硫酸鉀3g，七水硫酸鎂5g，甘油20g，加水至 總體積為1L，121°C滅菌3 0m i η; 4) 補料培養(yǎng)基：甲醇； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)方法： 1) 斜面培養(yǎng)將GS115-LX菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后 置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)2~3d，得到斜面培養(yǎng)物； 2) 種子培養(yǎng)使用接種環(huán)取一環(huán)以上的斜面培養(yǎng)物接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后置 于恒溫搖床中培養(yǎng)，在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)1~2d，得到種子培養(yǎng) 物； 3) 發(fā)酵培養(yǎng)按照以發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)體積計1%~2%接種量，將以上得到 的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后恒溫28~30°C，控制轉(zhuǎn)速300r/min，壓力 0.05MPa，通風比0.5vvm，培養(yǎng)1~2天后，向發(fā)酵罐中補加甲醇，補加的總量約為初始發(fā)酵液 體積的25%~30%，再繼續(xù)培養(yǎng)2~3天，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束所得到的發(fā)酵液酶活可達500 ~1000U/ml〇
【文檔編號】C12N9/42GK105820966SQ201510906780
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年12月10日
【發(fā)明人】蘇海榆, 孫杉杉, 徐志文
【申請人】領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司