本發(fā)明涉及硼酸頻哪醇酯作為識別受體的羅丹明類化合物作為過氧化亞硝酸鹽比色比率熒光探針，其可在特定條件下對過氧化亞硝酸鹽快速高選擇性識別中應用，或者其可測定樣品中過氧化亞硝酸鹽的濃度。

背景技術：

過氧化亞硝酸鹽是由一氧化氮和過氧化物反應所生成的活性氧化劑，具有殺菌消毒的作用，在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。若過氧化亞硝酸鹽異常積累，其以及二級代謝物可以和蛋白質類、脂類及核酸類物質反應，進而促進細胞毒性作用導致細胞死亡和促進炎癥反應，可以引起阿爾茨海默病、關節(jié)炎、自身免疫性疾病等其他病癥從而對人類健康構成巨大威脅。因此，檢測生物體內過氧化亞硝酸鹽的濃度已經成為一個重要的課題。

當前，常見的過氧化亞硝酸鹽的檢測手段主要是電化學方法(如陽極溶出伏安法、氧化還原電位法等)。但這種手段在實際應用中既昂貴又繁瑣，且常常需要特殊的實驗儀器以及高技能專業(yè)人員進行操作。因此，高效、廉價、簡捷的過氧化亞硝酸鹽檢測手段成為重要的研究課題。

在各種離子/分子的檢測方法中，比色熒光探針檢測法由于操作簡單，可在現(xiàn)場進行使用，選擇性和靈敏度高，檢測范圍廣，響應時間快速，檢測過程對樣品沒有破壞而極為引人注目。但是目前報道的熒光探針仍存在一些問題，包括靈敏度不理想、選擇性差、ph穩(wěn)定性差以及合成復雜等?？傊?，發(fā)展高靈敏度高選擇性、合成簡單的比色熒光探針是本領域技術人員急需解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本領域急需一種制備簡單的快速高靈敏高選擇性識別過氧化亞硝酸鹽的比色熒光探針，從而能夠有效檢測過氧化亞硝酸鹽。為此，本發(fā)明合成了一類新穎的過氧化亞硝酸鹽的比色熒光探針，其合成步驟簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性高、和/或選擇性高，和/或能夠快速識別過氧化亞硝酸鹽。

具體而言，本發(fā)明提供了一種過氧化亞硝酸鹽比色熒光探針，其為羅丹明類化合物，以硼酸頻哪醇酯為特異性識別受體，其結構如下：

優(yōu)選的，本發(fā)明的熒光探針是：

在本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽比色熒光探針的制備方法中，反應溫度是25－120℃；反應時間是2-24h；和/或羅丹明類化合物與4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯的摩爾比為約1：1至1：2，優(yōu)選為1：1.5或1：1.6。

本發(fā)明還提供了用于檢測樣本(例如河水樣本)中過氧化亞硝酸鹽濃度的檢測制劑或試劑盒，其包含本發(fā)明的探針。優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測制劑或試劑盒還包含產品的使用說明書。還優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含用于測定樣本中的過氧化亞硝酸鹽濃度的緩沖劑。

本發(fā)明還提供了檢測樣本(例如河水樣本)中過氧化亞硝酸鹽濃度的方法，其包括將本發(fā)明的探針與待測樣本接觸的步驟。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測樣本(例如河水樣本)中過氧化亞硝酸鹽濃度的制劑中的用途。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測樣本(例如河水樣本)中過氧化亞硝酸鹽濃度的試劑盒中的用途。

本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽熒光探針可與過氧化亞硝酸鹽進行作用，產生熒光光譜的變化，從而實現(xiàn)對過氧化亞硝酸鹽的定量檢測

具體而言，本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽熒光探針分別與過氧化氫、次氯酸、溴離子以及其他離子進行作用均不能導致熒光光譜的明顯改變，從而實現(xiàn)對過氧化亞硝酸鹽的選擇性識別。

可選擇地，本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽熒光探針的穩(wěn)定性好，進而能夠長期保存使用。

進一步的，本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽熒光探針是快速高選擇性過氧化亞硝酸鹽比色比率探針，且合成簡單，有利于商業(yè)化的推廣應用。

附圖說明

圖1是不同濃度過氧化亞硝酸鹽(0－8μm)對探針(5μm)吸收光譜的影響及定量線性關系。

圖2是不同濃度hg²⁺(0－2μm)對探針(5μm)熒光光譜的影響及線性定量關系。

圖3是探針(5μm)對過氧化亞硝酸鹽(5μm)響應時間的測試結果。

圖4是不同分析物對探針(5μm)熒光光譜的影響。其中：1.空白；2.鉀離子k⁺；3.鈣離子ca²⁺；4.鈉離子na⁺；5.鎂離子mg²⁺；6.鋁離子al³⁺；7.鋅離子zn²⁺；8.鐵離子fe³⁺；9.亞鐵離子fe²⁺；10.銅離子cu²⁺；11.硝酸根離子no3^-；12.亞硝酸根離子no2^-；13.半胱氨酸cys；(3mm)14.谷胱甘肽gsh(3mm)；15.過氧化氫h2o2(200μm)；16.過氧化叔丁醇tbhp；17.羥基自由基·oh；18.過氧叔丁醇自由基·o^tbu；19.一氧化氮no；20.單線態(tài)氧¹o2；21.超氧化鉀ko2；22.次氯酸鈉naclo；23.碳酸根co3^2-；24.亞硫酸氫根hso3^-；25.碳酸氫根hco3^-；26.溴離子br^-；27.硫離子s^2-；28.過氧化亞硝酸鹽onoo^-。

圖5是探針對過氧化亞硝酸鹽的裸眼檢測，其中探針濃度為20μm，過氧化亞硝酸鹽濃度分別為0、10、15、20μm，測試體系為乙醇：水(1:9，v/v)，pbs(20mm,ph＝7.4)測試溫度為25℃。

具體實施方式：

本發(fā)明提供了上述快速高選擇性過氧化亞硝酸鹽熒光探針的合成路線、方法及其光譜性能。

本發(fā)明的過氧化亞硝酸鹽熒光探針是一類以硼酸頻哪醇酯為識別受體的羅丹明類化合物，其具有以下結構通式

上式中：r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8，r9，r10，r11，r12，r13，r14，r15和r16為氫原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8，r9，r10，r11，r12，r13，r14，r15和r16可以相同或不同。

該類過氧化亞硝酸鹽比色比率熒光探針的合成路線和方法如下：

具體地，本發(fā)明的熒光探針可以通過如下方法制備，將一定摩爾比(例如1：1－1：2)的羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)和4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯溶于二甲氨基甲酰胺(dmf)中，再加入碳酸銫和碘化鉀，然后室溫下攪拌一段時間(例如24h)，然后萃取、旋蒸得到粗產品。使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到淺粉色純凈產品588.6mg，產率為90﹪。

因此，本發(fā)明還提供了4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯在制備用于檢測過氧化亞硝酸鹽的比色比率熒光探針中的用途。

本發(fā)明還提供了羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)在制備用于檢測過氧化亞硝酸鹽的比色比率熒光探針中的用途。

本發(fā)明的快速超靈敏高選擇性識別過氧化亞硝酸鹽比色比率熒光探針的顯著特征是能夠快速高選擇性地識別過氧化亞硝酸鹽，能夠準確對過氧化亞硝酸鹽進行定量分析。

下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，應該明白，本發(fā)明并不受下述實施例的限制。

實施例1

(方案1)將460mg(1.0mmol)羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)、297mg(1.0mmol)4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸銫和160mg(1.0mmol)碘化鉀溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常溫攪拌24h，之后萃取旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到純凈產品569mg，產率為87﹪。

(方案2)將460mg(1.0mmol)羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)、356.4mg(1.2mmol)4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸銫和160mg(1.0mmol)碘化鉀溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常溫攪拌24h，之后萃取旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到純凈產品582mg，產率為89﹪。

(方案3)將460mg(1.0mmol)羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)、445.5mg(1.5mmol)4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸銫和160mg(1.0mmol)碘化鉀溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常溫攪拌24h，之后萃取旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到純凈產品589mg，產率為90﹪。

(方案4)將460mg(1.0mmol)羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物)、475.2mg(1.6mmol)4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸銫和160mg(1.0mmol)碘化鉀溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常溫攪拌24h，之后萃取旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到純凈產品588.6mg，產率為90﹪。

(方案5)將460mg(1.0mmol)羅丹明類化合物(例如1,6-二羥基萘和4-二乙氨基酮酸的合成產物1)、594mg(2.0mmol)4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸銫和160mg(1.0mmol)碘化鉀溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常溫攪拌24h，之后萃取旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)體系進行柱色譜分離，得到純凈產品582.6mg，產率為89﹪。

實施例2

本發(fā)明的發(fā)明人進行了如下測試：不同濃度onoo^-(0-8μm)對探針(5μm)吸收光譜的影響以及定量線性關系。上述測定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中進行的，所使用的探針是實施例1中所制備的探針，且所有光譜測試都是在25℃下加入onoo^-作用3min后測得的。結果參見圖1。

從圖1可以看出，隨著過氧化亞硝酸鹽的濃度增加吸收光譜逐漸上升，并且溶液顏色由無色變?yōu)闇\紫色。

實施例3

不同濃度onoo^-(0－2μm)對探針(5μm)熒光光譜的影響。上述測定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中進行的，所使用的探針是實施例1中所制備的探針，且所有光譜測試都是在25℃下作用3min后測得的。結果參見圖2。

從圖2可以看出，伴隨著探針溶液中onoo^-濃度的增加，560nm處的熒光光譜逐漸下降，同時630nm處的熒光光譜逐漸升高，且在0-2μm的onoo^-濃度范圍內，onoo^-的濃度和熒光強度的比值顯現(xiàn)線性關系。因此，本發(fā)明的探針能利用比率熒光法精確地確定待測樣本中過氧化亞硝酸鹽的含量。

實施例4

探針(5μm)對onoo^-(5μm)響應時間的測試結果。上述測定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中進行的，所使用的探針是實施例1中所制備的探針，且所有光譜測試都是在25℃下測得的。結果參見圖3。

從圖3可以看出，加入等量過氧化亞硝酸鹽后，熒光強度極速升高，并且在5秒之后保持最大值。

實施例5

不同分析物對探針(5μm)熒光光譜的影響。其中：1.空白；2.鉀離子k⁺；3.鈣離子ca²⁺；4.鈉離子na⁺；5.鎂離子mg²⁺；6.鋁離子al³⁺；7.鋅離子zn²⁺；8.鐵離子fe³⁺；9.亞鐵離子fe²⁺；10.銅離子cu²⁺；11.硝酸根離子no3^-；12.亞硝酸根離子no2^-；13.半胱氨酸cys；(3mm)14.谷胱甘肽gsh(3mm)；15.過氧化氫h2o2(200μm)；16.過氧化叔丁醇tbhp；17.羥基自由基·oh；18.過氧叔丁醇自由基·o^tbu；19.一氧化氮no；20.單線態(tài)氧¹o2；21.超氧化鉀ko2；22.次氯酸鈉naclo；23.碳酸根co3^2-；24.亞硫酸氫根hso3^-；25.碳酸氫根hco3^-；26.溴離子br^-；27.硫離子s^2-；28.過氧化亞硝酸鹽onoo^-(5μm),它們的濃度(除特殊標注外)均為500μm。所有測試條件是20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中進行的，所使用的探針是實施例1中所制備的探針，且所有光譜測試都是在25℃下作用3min后測得的。結果參見圖4。具體地，移取50μl的探針儲備液(1mm)放進10ml比色管中，然后加入1ml乙醇和5ml超純水，再移取20μl上述分析物儲備液加入比色管內，然后移取2.0ml的pbs溶液(ph7.4,100mm)加入比色管內，最后用超純水定容至10ml。搖勻，靜置3min，即可測定。結果如圖4所示。

從圖4可以看出，探針對過氧化亞硝酸鹽具有很高的選擇性，能夠專一性地和過氧化亞硝酸鹽進行反應，反應前后，熒光光譜有明顯變化，而其他離子與探針作用后熒光強度并不發(fā)生明顯變化。

實施例六

探針對過氧化亞硝酸鹽的裸眼檢測，見圖5，其中探針濃度為20μm，過氧化亞硝酸鹽濃度分別為0、10、15、20μm，測試體系為乙醇：水(1:9，v/v)，pbs(20mm,ph＝7.4)測試溫度為25℃。

由圖5可以得到，隨著過氧化亞硝酸鹽的濃度不斷增加，溶液顏色逐漸由無色變?yōu)樽仙?，能夠對過氧化亞硝酸鹽進行方便快捷的裸眼檢測。

雖然用上述實施方式描述了本發(fā)明，應當理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進行進一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發(fā)明的保護范圍之內。