本發(fā)明涉及一種基于馬爾堡病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：馬爾堡病毒(marburgvirus，marv)屬于絲狀病毒科，為單股不分節(jié)段負(fù)鏈rna病毒，在電鏡下呈細(xì)絲狀，是烈性傳染病馬爾堡出血熱的病原體。該病毒在1967年由德國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)(siegertr,shuhl.germedmon,1968,13(1):1–2.)，迄今已在非洲等地出現(xiàn)散在性暴發(fā)十余次，感染造成數(shù)百人死亡，死亡率大于80％，2005年在安哥拉暴發(fā)的馬爾堡出血熱死亡率高達(dá)90％(jonathans.townerml.virol,2006,80(13):6497–6516.)。marv感染后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的出血熱，破壞人體的多種臟器和免疫系統(tǒng)。自然狀態(tài)下該病毒主要通過(guò)直接接觸患者的體液傳播，病毒感染后，相關(guān)疾病癥狀很快出現(xiàn)，包括頭痛、肌痛、發(fā)熱、多器官功能衰竭等。目前，沒(méi)有有效的疫苗及藥物用于馬爾堡病毒感染的預(yù)防及治療。馬爾堡病毒基因組全長(zhǎng)19.1kb，基因組分別編碼核衣殼蛋白(nucleoprotein,np)、病毒蛋白(viralprotein)vp35、vp40、包膜糖蛋白(glycoprotein，gp)、vp30、vp24以及聚合酶大蛋白l(mirece,geisbertjb,plosone9(4):e94355.)。病毒顆粒表面被有包膜，包膜上覆蓋著由gp三聚體組成的長(zhǎng)度為5-10nm的棘突。病毒顆粒的核心部位是基因組rna和與其緊密連接的核衣殼蛋白組成核衣殼復(fù)合體，緊密連接能防止其被rnase降解，這些蛋白包括np、vp30、vp35和l。gp蛋白屬ⅰ型跨膜蛋白，gp處在病毒包膜外側(cè)，能介導(dǎo)病毒與目標(biāo)細(xì)胞的粘附與融合。gp為病毒外部唯一蛋白，是主要抗原部分，是目前研究疫苗首選抗原。gp全長(zhǎng)基因有2046個(gè)堿基，由一個(gè)orf編碼合成681aa，形成的gp前體被furin酶切割(位點(diǎn)為435aa與436aa之間)形成gp1和gp2兩個(gè)亞基，由二硫鍵連接形成一個(gè)gp單體，三個(gè)gp單體構(gòu)成一個(gè)成熟的gp。gp1分子量大約為160kda，存在大量抗原表位，其aa1-18為信號(hào)肽，aa33-188為受體結(jié)合區(qū)(receptorbindingdomain，rbd)。受體結(jié)合區(qū)被證明是抗體直接作用的主要位點(diǎn)(flyakai,ilinykhpa.cell,2015,160(5):893–903.)，是介導(dǎo)病毒黏附的關(guān)鍵區(qū)域，此區(qū)域糖基化位點(diǎn)較多。aa277-455是黏蛋白樣區(qū)(mucin-likedomain，mld)，此區(qū)域高度糖基化，覆蓋在gp1和gp2之間，逃逸免疫作用，該區(qū)域存在增強(qiáng)抗體表位，能增強(qiáng)病毒的感染效率。病毒一旦進(jìn)入細(xì)胞，胞內(nèi)的組織蛋白酶識(shí)別gp，切割其上面糖帽和黏蛋白樣區(qū)域，切割后的gp識(shí)別胞內(nèi)npc1受體，使原本被緊密束縛的gp2發(fā)生重排，形成六螺旋束，催化病毒與細(xì)胞膜融合(takaohashiguchi,marniel.fusco.2015,cell160,904–912)。近十年來(lái)，隨著馬爾堡病毒致病機(jī)制的闡明，目前，馬爾堡病毒疫苗的研究已取得了顯著進(jìn)展，已研究的疫苗包括滅活疫苗、dna疫苗、病毒顆粒樣蛋白疫苗、rad載體疫苗、rvsv載體疫苗等，抗原主要為包膜糖蛋白gp。近期抗體-馬爾堡gp蛋白相互作用及結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果表明，馬爾堡gp的aa33-188受體結(jié)合區(qū)(receptorbindingdomain,rbd)為抗體直接作用的主要位點(diǎn)(hashiguchietal.,2015,cell160,904–912)。由于嵌入完整gp蛋白的病毒載體疫苗具有一定的復(fù)制能力及恢復(fù)毒性的風(fēng)險(xiǎn)，安全問(wèn)題是這類疫苗不可忽視和亟待克服的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供如下m1)或m2)或m3)所示的蛋白質(zhì)：m1)馬爾堡病毒的gp蛋白自n端起第436-648位氨基酸；m2)馬爾堡病毒的gp蛋白自n端起第402-562位氨基酸；m3)馬爾堡病毒的gp蛋白自n端起第19-648位氨基酸。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)或其截短體。上述蛋白質(zhì)或其截短體中，所述截短體為如下(1)-(5)中任一所示：(1)氨基酸序列是序列2第436-648位所示的蛋白質(zhì)；(2)氨基酸序列是序列2第402-562位所示的蛋白質(zhì)；(3)在序列2第436-648位或序列2第402-562位所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；(4)將序列2第436-648位或序列2第402-562位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；(5)與序列2第436-648位或序列2第402-562位所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)為如下(6)-(9)中任一所示：(6)氨基酸序列是序列2第19-648位所示的蛋白質(zhì)；(7)在序列2第19-648位所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；(8)將序列2第19-648位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；(9)與序列2第436-648位或序列2第402-562位所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或其截短體的編碼基因。上述編碼基因中，上述m1)或m2)所述蛋白質(zhì)或上述截短體的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所示：1)序列1中自5’末端起第1306位至第1944位核苷酸所示的dna分子；2)序列1中自5’末端起第1204位至第1686位核苷酸所示的dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna分子雜交且編碼m1)或m2)所述蛋白質(zhì)或截短體的dna分子；4)與1)或2)或3)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼m1)或m2)所述蛋白質(zhì)或截短體的dna分子；上述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)-7)任一所示：5)序列1中自5’末端起第55-1944位核苷酸所示的dna分子；6)在嚴(yán)格條件下與5)限定的dna分子雜交且編碼上述蛋白質(zhì)的dna分子；7)與5)或6)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼上述蛋白質(zhì)的dna分子。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供下述(a1)-(a4)中的任一種生物材料：(a1)含有上述編碼基因的表達(dá)盒；(a2)含有上述編碼基因的重組載體；(a3)含有上述編碼基因的重組菌；(a4)含有上述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料在制備免疫原和/或抗原中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述免疫原或抗原是針對(duì)馬爾堡病毒或馬爾堡病毒包膜蛋白gp的。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料作為抗原在制備針對(duì)馬爾堡病毒的抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料在制備預(yù)防和/或治療馬爾堡病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料在預(yù)防和/或治療馬爾堡病毒引起的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或其截短體和/或上述編碼基因和/或上述生物材料在如下a1)-a6)中任一種中的應(yīng)用：a1)抑制病毒感染；a2)制備抑制病毒感染的產(chǎn)品；a3)抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合；a4)制備抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的產(chǎn)品；a5)抑制病毒入侵；a6)制備抑制病毒入侵的產(chǎn)品。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為上述蛋白質(zhì)或其截短體；所述產(chǎn)品的功能為如下b1)-b3)中任一種：b1)抑制病毒感染；b2)抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合；b3)抑制病毒入侵；所述產(chǎn)品為藥物或疫苗。上述應(yīng)用或上述產(chǎn)品中，所述病毒為馬爾堡病毒。本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種多抗。本發(fā)明提供的多抗是以上述蛋白質(zhì)或其截短體為免疫原制備得到的。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)暴露于gp蛋白表面的后部區(qū)域(aa436-648)在gp蛋白功能的發(fā)揮中具有關(guān)鍵作用，且該區(qū)域含有豐富的gp蛋白抗原表位。本發(fā)明提供的抗原片段是來(lái)自馬爾堡病毒包膜蛋白gp的一段序列(aa436-648)。本發(fā)明提供的抗原片段gp2具有與gp蛋白相似的抗原潛力，免疫產(chǎn)生的中和抗體能夠有效抑制病毒的感染。與完整的gp蛋白抗原相比，該抗原片段不具有g(shù)p蛋白的生物學(xué)功能(不具有g(shù)p1亞基與gp2亞基的功能，在病毒進(jìn)入過(guò)程中只發(fā)揮輔助功能)，因此不能使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，該片段用于病毒載體疫苗的構(gòu)建時(shí)具有更好的安全性，也更方便用于多價(jià)疫苗制備。附圖說(shuō)明圖1為1％瓊脂糖凝膠分析pvax1-gp△，pvax1-rbs，pvax1-rbsp，pvax1-fu，pvax1-空載體的電泳圖。圖2為重組蛋白gp1△的表達(dá)及純化后sds-page電泳分析圖。圖3為重組蛋白gp2△的表達(dá)及純化后sds-page電泳分析圖。圖4為重組蛋白gpm的表達(dá)及純化后sds-page電泳分析圖圖5為重組質(zhì)粒第三次免疫小鼠血清的elisa分析圖。圖6為gp蛋白和gp1△、gp2△、gpm蛋白第三次免疫小鼠血清的elisa分析圖。圖7為concanavalina(cona)或gp蛋白刺激后gp免疫組與gp2△免疫組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)分析。圖7a為cona刺激后gp免疫組與gp2△免疫組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)分析：圖7b為gp蛋白刺激后gp免疫組與gp2△免疫組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)分析。圖8為pvax1-gp△，pvax1-fu，gp，gp2△免疫組免疫血清對(duì)假病毒感染靶細(xì)胞的中和活性分析圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中所用的酶，除特殊說(shuō)明外，均購(gòu)自neb公司。下述實(shí)施例中所用的細(xì)胞培養(yǎng)基及血清，除特殊說(shuō)明外，均購(gòu)自gibco公司。下述實(shí)施例中所用的載體pvax1購(gòu)自invitrogen公司。下述實(shí)施例中所用的載體puc57-mgp從金唯智公司購(gòu)買，mgp基因的genbank號(hào)為dq447659.1。下述實(shí)施例中所用的6周齡balb/c雌性小鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：scxk-(軍)2012-0004。下述實(shí)施例中所用的il-2elisakit、ifn-γelisakit、小鼠淋巴細(xì)胞分離液和cellcountingkittetraz均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為：dkw12-2020，dkw12-2000、dkw33-r0100和424501。下述實(shí)施例中所用的goat-antimouseigghrp-conjugatedantibody、goat-antimouseigg1hrp-conjugatedantibody和goat-antimouseigg2ahrp-conjugatedantibody均購(gòu)自abcam公司。下述實(shí)施例中所用的briteliteplusluminesencereportergeneassaysystem購(gòu)自pe公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為6066766。下述實(shí)施例中所用的hek293t細(xì)胞購(gòu)自cloneth。下述實(shí)施例中所用的pnl4-3.luc.re質(zhì)粒在文獻(xiàn)“l(fā).duetal.,developmentofasafeandconvenientneutralizationassayforrapidscreeningofinfluenzaha-specificneutralizingmonoclonalantibodies,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2010,397:580–585”中公開過(guò)，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。下述實(shí)施例中所用的concanavalina(cona)是sigama公司的產(chǎn)品，貨號(hào)：11028-71-0。實(shí)施例1、抗原及其片段的制備一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建同時(shí)構(gòu)建如下重組質(zhì)粒：pvax1-gp、pvax1-gp△、pvax1-rbs、pvax1-rbsp和pvax1-fu。具體步驟如下：(一)設(shè)計(jì)并合成引物設(shè)計(jì)用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pvax1-gp、pvax1-gp△、pvax1-rbs、pvax1-rbsp和pvax1-fu的引物，引物序列如表1所示。表1、用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的引物序列g(shù)pf5’-ccggaattcgccaccatgaaaactacttgcttattaatgpr5’-ccgctcgagcttgtcatcgtcgtccttgtagtcttagccgatgtatttagtgaagp△f5’-ccggaattcgccaccatgctgccaatcctggagatcgcgp△r5’-ccgctcgagttattacttgtcatcgtcgtccttgtagtcatcagaagtccaccacttgcrbsf5’-ccggaattcgccaccatggcttctaatattcagccacarbsr5’-ccgctcgagttattacttgtcatcgtcgtccttgtagtcgtgtctgtagccctgaccrbsp+5’-ccgagataatgcaatcagcacagcgatagacagcagtaacagaatgccgtgtctgtagccctgaccrbspr5’-ccgctcgagttattacttgtcatcgtcgtccttgtagtcagataatgcaatcagcacagfuf5’-ccggaattcgccaccatgccaactactactgttccaaafur5’-ccgctcgagttattacttgtcatcgtcgtccttgtagtccagtctacgcagacgaca(二)gp基因擴(kuò)增以puc57-mgp為模板，以gpf和gpr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1(gp基因)。gp基因的核苷酸序列如序列1所示。pcr反應(yīng)體系：puc57-mgp為模板1μl，2xq5high-fidelitydnapolymerase25μl，上游引物gpf2.5μl，下游引物gpr2.5μl，補(bǔ)加滅菌水至50μl。pcr程序：98℃預(yù)變性4分鐘；98℃變性10秒，57℃退火30秒，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2min,4℃保溫。(三)gp△、rbs、rbsp、fu基因擴(kuò)增1、以puc57-mgp為模板，以gp△f和gp△r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物2(gp△基因)。gp△基因的核苷酸序列如序列1中自5’末端起第55-1944位核苷酸所示。pcr擴(kuò)增的退火溫度為57℃，72℃延伸10秒。2、以puc57-mgp為模板，以rbsf和rbsr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物3(rbs基因)。rbs基因如序列1中自5’末端起第73-564位核苷酸所示。pcr擴(kuò)增的退火溫度為57℃，72℃延伸15秒。3、以puc57-mgp為模板，以rbsf和rbsp+為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物rbsp+,再以pcr擴(kuò)增產(chǎn)物rbsp+為模板，以rbsf和rbspr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物4(rbsp基因)。rbsp基因的核苷酸序列依次由序列1中自5’末端起第73-564位和第1966-2010位核苷酸分子組成。pcr擴(kuò)增的退火溫度為60℃，72℃延伸15秒。4、以puc57-mgp為模板，以fuf和fur為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物5(fu基因)。fu基因如序列1中自5’末端起第1204-1686位核苷酸所示。pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增退火溫度為58℃，72℃延伸15秒。(四)用限制性內(nèi)切酶ecori與xhoi分別雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物2、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物3、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物4和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物5，分別得到gp、gp△、rbs、rbsp和fu基因；用限制性內(nèi)切酶ecori與xhoi雙酶切載體pvax1，得到載體大片段；將gp、gp△、rbs、rbsp和fu基因分別與載體大片段連接，分別得到重組質(zhì)粒pvax1-gp，pvax1-gp△，pvax1-rbs，pvax1-rbsp和pvax1-fu。1％瓊脂糖凝膠分析重組質(zhì)粒pvax1-gp△，pvax1-rbs，pvax1-rbsp，pvax1-fu和pvax1空載體結(jié)果如圖1所示。并將重組質(zhì)粒pvax1-gp，pvax1-gp△，pvax1-rbs，pvax1-rbsp和pvax1-fu進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果正確。重組質(zhì)粒pvax1-gp表達(dá)帶有flag標(biāo)簽的gp蛋白(氨基酸序列如序列2所示)，重組質(zhì)粒pvax1-gp△表達(dá)帶有flag標(biāo)簽的gp△蛋白(氨基酸序列依次由序列2第19-648位氨基酸和序列2第682-689位氨基酸組成)，重組質(zhì)粒pvax1-rbs表達(dá)帶有flag標(biāo)簽的rbs蛋白(氨基酸序列依次由序列2第25-188位氨基酸和序列2第682-689位氨基酸組成)，重組質(zhì)粒pvax1-rbsp表達(dá)帶有flag標(biāo)簽的rbsp蛋白(氨基酸序列依次由序列2第25-188位氨基酸、序列2第656-670位氨基酸和序列2第682-689位氨基酸組成)和重組質(zhì)粒pvax1-fu表達(dá)帶有flag標(biāo)簽的fu蛋白(氨基酸序列依次由序列2第402-562位氨基酸和序列2第682-689位氨基酸組成)。二、重組蛋白gp的分段表達(dá)(一)重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、pet24a(+)-gp1△的構(gòu)建以puc57-mgp為模板，以gp1△f和gp1△r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到gp1△基因(gp1△基因的核苷酸序列為序列1第73-720位所示)，用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切g(shù)p1△基因，得到gp1△片段；用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切pet24a(+)載體(購(gòu)自novagen公司)，得到載體大片段；將gp1△基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pet24a(+)-gp1△。gp1△f：5’-cgcggatccatggcttctaatattcagccacaa-3’；gp1△r：5’-ccgctcgaggtgtgcagttggcagtggcag-3’。2、pet32a(+)-gpm的構(gòu)建以puc57-mgp為模板，以gpmf和gpmr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到gpm基因(gpm基因核苷酸序列為序列1第721-1560位所示)，用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切g(shù)pm基因，得到gpm基因片段；用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切pet32a(+)載體(購(gòu)自novagen公司)，得到載體大片段；將gpm基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pet32a(+)-gpm。gpmf：5’-cgcggatccgatgcaacaaaattaaacacaa-3’；gpmr：5’-ccgctcgagaccagatacgcagctcagcatcg-3’。3、pet24a(+)-gp2△的構(gòu)建以puc57-mgp為模板，以gp2△f和gp2△r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到gp2△基因(gp2△基因的核苷酸序列為序列1第1306-1944位所示)，用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切g(shù)p2△基因，得到gp2△片段；用限制性內(nèi)切酶bamhi與xhoi雙酶切pet24a(+)載體，得到載體大片段；將gp2△基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pet24a(+)-gp2△。gp2△f：5’-cgcggatccaatatcctgtggagagagggc-3’；gp2△r：5’-ccgctcgagatcagaagtccaccacttgcc-3’。將重組質(zhì)粒pet24a(+)-gp1△，pet32a(+)-gpm和pet24a(+)-gp2△進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果正確。重組質(zhì)粒pet24a(+)-gp1△表達(dá)gp1△蛋白，gp1△蛋白的氨基酸序列為序列2第25-240位，重組質(zhì)粒pet32a(+)-gpm表達(dá)gpm蛋白，gpm蛋白的氨基酸序列為序列2第241-520位氨基酸，重組質(zhì)粒pet24a(+)-gp2△表達(dá)gp2△蛋白，gp2△蛋白的氨基酸序列為序列2第436-648位。(二)重組菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pet24a(+)-gp1△，pet32a(+)-gpm和pet24a(+)-gp2△分別轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)，各取1μl質(zhì)粒加入相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，再冰浴180秒，向感受態(tài)中加入900μl無(wú)抗性lb培養(yǎng)基，37℃，150rpm復(fù)蘇45分鐘，將復(fù)蘇pet24a(+)-gp1△、pet24a(+)-gp2△菌液均勻涂布在卡那霉素抗性的lb平板，將復(fù)蘇pet32a(+)-gpm菌液均勻涂布在氨芐青霉素抗性的lb平板37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)，分別得到重組菌。(三)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取重組pet24a(+)-gp1△、pet24a(+)-gp2△菌的單克隆菌落，加入10ml50μg/ml卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)12h；按照體積比1:100接種菌液至1l50μg/ml卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)至od600＝0.5，大約2小時(shí)，加入iptg至終濃度1mm，30℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后離心收集gp1△和gp2△重組菌菌體。挑取重組pet32a(+)-gpm菌的單克隆菌落，加入10ml100μg/ml氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)12h；按照體積比1:100接種菌液至1l100μg/ml氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)至od600＝0.5，大約2小時(shí)，加入iptg至終濃度1mm，30℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后離心收集gpm重組菌菌體。(四)重組蛋白的純化對(duì)gp1△、gp2△重組菌菌體和gpm重組菌菌體進(jìn)行純化，分別得到純化后的重組蛋白gp1△，gp2△和gpm。其中，重組蛋白gp1△，gp2△為包涵體形式，gpm為可溶性表達(dá)，重組蛋白gp1△和gp2△的具體純化過(guò)程如下：用緩沖液a(50mmtris-hcl(ph8.0)，2mmedta，100mmnacl)漂洗菌體細(xì)胞，將漂洗過(guò)的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液b(50mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta，100mmnacl，1％np-40)中，冰水中超聲破碎(輸出比61％，工作5秒，間歇5秒，總時(shí)間30分鐘)4℃，10000rpm離心30分鐘，收集破菌包涵體；將包涵體沉淀用緩沖液ⅰ(50mmtris-hcl(ph8.0)，2mmedta，100mmnacl，0.5％tritonx-100(v/v)，4m脲素)、緩沖液ⅱ(50mtris-hcl(ph8.0)，2mmedta，100mmnacl，3％tritonx-100)、緩沖液ⅲ(50mmtris-hcl(ph8.0)，2mmedta，100mmnacl，0.5％tritonx-100，2m鹽酸胍)分別超聲洗滌一次，4℃，10000rpm離心30分鐘，收集包涵體沉淀；用含高濃度脲素的緩沖液c(8m脲素，50mmdtt，100mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta及脫氧膽酸鈉)溶解包涵體。0.45μm濾膜過(guò)濾后上ni親和柱進(jìn)行純化，結(jié)合buffer(20mmna3po4，500mmnacl，咪唑30mm，ph7.4)和洗脫buffer(20mmna3po4，500mmnacl，咪唑500mm，ph7.4)含8m尿素，將破菌上清、包涵體溶解液上清、目的蛋白洗脫液進(jìn)行sds-page電泳，gp1△如圖2所示，gp2△如圖3所示。macrosep超濾離心管(10k)(購(gòu)自millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液，分別得到純化后的大小約為24kd的重組蛋白gp1△和重組蛋白gp2△。重組蛋白gpm的具體純化過(guò)程如下：結(jié)合buffer(20mmna3po4，500mmnacl，咪唑30mm，ph7.4)重懸gpm重組菌菌體，超聲破菌(輸出比61％，工作5秒，間歇5秒，總時(shí)間30分鐘)，4℃，10000rpm離心30分鐘，收集破菌上清，0.45μm濾膜過(guò)濾后上ni親和柱進(jìn)行純化，收集穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液。將破菌上清、洗雜峰、洗脫buffer-50洗脫液、洗脫buffer-100洗脫液、洗脫buffer-150洗脫液、洗脫buffer-200洗脫液進(jìn)行sds-page電泳，結(jié)果如圖4所示。macrosep超濾離心管(10k)(購(gòu)自millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液，得到純化后的大小約為30kd(因?yàn)樵趐et32a(+)載體中融合了一個(gè)肽，導(dǎo)致顯示在40kd大小)的重組蛋白gpm。實(shí)施例2、抗原及其片段的免疫活性測(cè)定(一)免疫方法1、分組動(dòng)物選取6周齡balb/c雌性小鼠，分為生理鹽水1組、pvax1-gp△組、pvax1-rbs組、pvax1-rbsp組、pvax1-fu組、生理鹽水2組、bsa蛋白組、gp1△蛋白組、gpm蛋白組、gp2△蛋白組和gp混合蛋白組(gp1△蛋白、gp2△蛋白和gpm蛋白按照質(zhì)量比1:1:1混合)，每組12只小鼠。2、免疫方式生理鹽水1組、pvax1-gp△組、pvax1-rbs組、pvax1-rbsp組、pvax1-fu組采取后腿肌肉注射，不加佐劑，2周免疫一次(分別在第0天、第14天和第28天免疫)，100μg質(zhì)粒/只(質(zhì)粒濃度1mg/ml)，生理鹽水免疫體積為100μl/只，共3次，免疫前2天注射0.25％鹽酸普魯卡因刺激肌肉。生理鹽水2組、bsa蛋白組、gp1△蛋白組、gpm蛋白組、gp2△蛋白組、gp混合蛋白組采取皮下多點(diǎn)注射，2周免疫一次(分別在第0天、第14天和第28天免疫)。初免35μg蛋白/只(蛋白濃度100μg/ml)，生理鹽水免疫體積與蛋白組相同，共免疫3次，第二、三次免疫25μg蛋白/只。首次免疫采用弗氏完全佐劑(購(gòu)自sigma公司)，第二、三次免疫采用弗氏不完全佐劑(購(gòu)自sigma公司)，均按照質(zhì)量比1:1混合。3、采血方式及時(shí)間尾靜脈采血，采血時(shí)間為免疫前采血1次，每次免疫后第10天采血1次。(二)血清中抗體滴度測(cè)定1、所采各組小鼠的血液置于室溫凝固收縮2小時(shí)后，5000rpm離心5分鐘，收集上清，即為血清。2、重組混合蛋白gp(gp1△蛋白、gp2△蛋白和gpm蛋白按照質(zhì)量比1:1:1混合得到混合蛋白)鋪板(nunc酶標(biāo)板)，2μg/孔，4℃過(guò)夜，用pbst(含體積百分含量0.5％吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；將板用5g/100ml的脫脂牛奶的pbst(含體積百分含量0.5％吐溫-20)溶液37℃封閉2小時(shí)，pbst(含體積百分含量0.5％吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入步驟1得到的免疫血清，37℃孵育1小時(shí)，pbst(含體積百分含量0.5％吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入hrp標(biāo)記的goatanti-mouseigg抗體，37℃孵育1小時(shí)，pbst(含體積百分含量0.5％吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；100μl/孔加入tmb顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘，加入2m硫酸終止反應(yīng)，od450讀數(shù)(儀器為thermomultiscanfc酶標(biāo)儀)。生理鹽水1組、pvax1-gp△組、pvax1-rbs組、pvax1-rbsp組和pvax1-fu組血清中抗體滴度結(jié)果如圖5所示。生理鹽水2組、bsa蛋白組、gp混合蛋白組、gp1△蛋白組、gpm蛋白組和gp2△蛋白組血清中抗體滴度結(jié)果如圖6所示。圖5和圖6表明，無(wú)論采取重組質(zhì)粒免疫還是重組蛋白免疫，gp1△部分抗體滴度很低，gp2△抗體滴度高，與gp混合蛋白組效果類似。(三)脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析淋巴細(xì)胞增殖水平，可以判斷細(xì)胞免疫反應(yīng)水平。1、于最后一次免疫后，無(wú)菌條件下取生理鹽水組2、gp混合蛋白組和gp2△蛋白組小鼠的脾臟，按照mouse1×lymphocyteseparationmedium的說(shuō)明，從達(dá)優(yōu)小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾淋巴細(xì)胞并制備淋巴細(xì)胞懸液(重懸于rpmi1640培養(yǎng)基)，按照2.5×105cell/孔鋪96孔板，按100μl/孔分別加入重組混合蛋白gp溶液(25μg/ml，溶于rpmi1640培養(yǎng)基)或cona溶液(10μg/ml，溶于rpmi1640培養(yǎng)基)，每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。2、按照cellcountingkittetraz說(shuō)明，將按10μl/孔加入各細(xì)胞孔中，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后，測(cè)定od450，計(jì)算刺激指數(shù)(si＝刺激孔o(hù)d450/對(duì)照孔o(hù)d450)，結(jié)果如圖7所示。圖7表明，重組混合蛋白gp刺激時(shí)，gp2△蛋白組si低于gp混合蛋白組，表明gp2△蛋白組特異性細(xì)胞免疫水平弱于gp混合蛋白組；cona刺激時(shí)，gp2△蛋白組si高于gp混合蛋白組，表明gp2△蛋白組非特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)更為活躍，即抗原gp2△能在一定程度上提高機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平。蛋白gp(重組混合蛋白gp)作為特異性刺激源，可刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性增殖反應(yīng)，抗原gp含較多的t細(xì)胞表位，能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，而抗原gp2△含有的t細(xì)胞表位少于gp，誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)弱于抗原gp；cona是非特異性刺激源，抗原gp2△可能具有某種上調(diào)機(jī)體淋巴細(xì)胞絲裂原受體表達(dá)水平的功能，因此在cona刺激時(shí)，抗原gp2△免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)較抗原gp更為強(qiáng)烈。(四)假病毒感染中和實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的假型病毒的感染中和實(shí)驗(yàn)方法(arnabbasu,etal.journalofvirology,apr.2011,p.3106–3119；l.du,etal.res.commun.(2010),doi:10.1016/j.bbrc.2010.05.161)驗(yàn)證抗原片段gp2△和fu誘導(dǎo)產(chǎn)生有效中和抗體的能力，為抗原片段gp2△和fu應(yīng)用于疫苗或中和抗體的開發(fā)提供依據(jù)。具體步驟如下：1、假病毒包裝：hek293t細(xì)胞以8×105cell/孔鋪6孔板，37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，至90％融合度。2μgpnl4-3.luc.re質(zhì)粒與2μgpvax1-gp質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine3000(購(gòu)自invitrogen公司)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，離心后分裝，即為假病毒溶液。2、假病毒感染中和實(shí)驗(yàn)：于實(shí)驗(yàn)前一天，按1×104cell/孔將293t細(xì)胞鋪于96孔板，待到次日生長(zhǎng)至90％融合度。將10μl步驟(二)制備的生理鹽水1組、pvax1-gp△組、pvax1-fu組、gp2△蛋白組和gp混合蛋白組免疫血清與10μl步驟1制備的假病毒溶液混合于1mldmem培養(yǎng)基中，37℃孵育2小時(shí)，分別得到混合液。將200μl/孔混合液替換96孔板細(xì)胞培養(yǎng)基，每組血清設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，更換新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，按照briteliteplusluminesencereportergeneassaysystem說(shuō)明，使用perkinelmerenspiretm2300multiablereader儀器測(cè)定各組發(fā)光值，計(jì)算假病毒感染抑制率，結(jié)果如圖8所示。圖8表明，抗原片段gp2△(gp2△蛋白組)、fu(pvax1-fu組)、gp△(pvax1-gp△組)與gp(gp混合蛋白組)均能在一定程度上中和hiv-mgp假病毒，其中和能力與鹽水組比差異顯著，gp2△蛋白組和pvax1-fu組與gp組中和能力相當(dāng)。序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>基于馬爾堡病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用<160>2<210>1<211>2070bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgaaaactacttgcttattaatctctctgatcctgattcagggtgtgaagactctgcca60atcctggagatcgcttctaatattcagccacaaaacgttgattctgtttgctctggtaca120ctgcagaagacagaggatgtgcatctgatgggcttcacactgtcaggccagaaggtggct180gattctcctctggaagcttcaaaacgttgggcattccgtgcaggcgttccccctaagaac240gtggagtacacagagggtgaagaagctaagacatgttataacatttcagttacagatcca300tctggtaagtctctgctgctggacccaccaacaaatatccgtgactaccctaaatgtaag360actatccatcatatccagggccagaaccctcatgcacaaggtatcgctctgcacctgtgg420ggtgctttctttttatatgatagaattgcttctacaactatgtatagaggtaaagttttt480actgagggtaatattgctgctatgattgtgaataaaacagttcataaaatgatcttctct540cgtcagggtcagggctacagacacatgaatctgacatcaacaaataaatactggacatca600tctaacggcacacagacaaatgacactggctgcttcggcacattacaggaatacaattct660actaaaaaccagacttgcgcaccatctaaaaagccactgccactgccaactgcacaccca720gaagttaaattaacttcaacttcaacagatgcaacaaaattaaacacaactgatccaaat780tctgacgacgaagacctgactacatctggctctggttctggtgagcaggagccttacaca840acttcagatgcagctactaagcagggcctgtcatcaacaatgccacctactccatcacca900cagccttctactccacaacagggtggcaacaacacaaaccactctcagggcgttgtgaca960gaaccaggtaaaactaatacaacagctcagccttctatgccacctcacaacactacaaca1020atttcaacaaataacacttctaagcataacctgtctactccatctgttccaattcaaaat1080gctactaactacaatactcagtctacagcaccagagaacgagcagacatctgcaccttca1140aagacaactttattacctactgaaaatccaactacagctaaatctactaattcaactaaa1200tctccaactactactgttccaaacactactaataagtactcaacatcaccatctccaaca1260cctaactctacagctcagcacctggtgtatttccgtcgtaagcgtaatatcctgtggaga1320gagggcgatatgttccctttcctggacggcctgattaatgcacctattgattttgatcca1380gttccaaacacaaagactatcttcgacgaatcttcatcatcaggcgcttctgctgaagag1440gatcaacatgcttctcctaatatttcactgacactgtcatattttcctaaagtgaatgag1500aacacagctcactctggcgagaacgagaacgattgcgatgctgagctgcgtatctggtct1560gtgcaagaagatgacctggctgcaggtctgtcttggattccttttttcggtcctggcatc1620gagggcctgtacacagcaggcttaattaaaaatcagaataatctggtttgtcgtctgcgt1680agactggcaaatcagactgcaaaatctctggaactgctgctgcgtgttacaactgaggaa1740agaacattctctctgattaaccgtcatgcaattgacttcctgctggctagatggggcggt1800acttgcaaagtgctgggcccagactgctgcatcggcattgaagatctgtcccgtaacatt1860tctgaacagattgatcagattaaaaaagatgagcagaaagaaggcactggttggggcctg1920ggtggcaagtggtggacttctgattggggtgtgctgactaacctgggcattctgttactg1980ctgtctatcgctgtgctgattgcattatcttgcatttgtagaattttcactaaatacatc2040ggcgactacaaggacgacgatgacaagtaa2070<210>2<211>689<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2metlysthrthrcysleuleuileserleuileleuileglnglyval151015lysthrleuproileleugluilealaserasnileglnproglnasn202530valaspservalcysserglythrleuglnlysthrgluaspvalhis354045leumetglyphethrleuserglyglnlysvalalaaspserproleu505560glualaserlysargtrpalapheargalaglyvalproprolysasn65707580valglutyrthrgluglygluglualalysthrcystyrasnileser859095valthraspproserglylysserleuleuleuaspproprothrasn100105110ileargasptyrprolyscyslysthrilehishisileglnglygln115120125asnprohisalaglnglyilealaleuhisleutrpglyalaphephe130135140leutyraspargilealaserthrthrmettyrargglylysvalphe145150155160thrgluglyasnilealaalametilevalasnlysthrvalhislys165170175metilepheserargglnglyglnglytyrarghismetasnleuthr180185190serthrasnlystyrtrpthrserserasnglythrglnthrasnasp195200205thrglycyspheglythrleuglnglutyrasnserthrlysasngln210215220thrcysalaproserlyslysproleuproleuprothralahispro225230235240gluvallysleuthrserthrserthraspalathrlysleuasnthr245250255thraspproasnseraspaspgluaspleuthrthrserglysergly260265270serglygluglngluprotyrthrthrseraspalaalathrlysgln275280285glyleuserserthrmetproprothrproserproglnproserthr290295300proglnglnglyglyasnasnthrasnhisserglnglyvalvalthr305310315320gluproglylysthrasnthrthralaglnprosermetproprohis325330335asnthrthrthrileserthrasnasnthrserlyshisasnleuser340345350thrproservalproileglnasnalathrasntyrasnthrglnser355360365thralaprogluasngluglnthrseralaproserlysthrthrleu370375380leuprothrgluasnprothrthralalysserthrasnserthrlys385390395400serprothrthrthrvalproasnthrthrasnlystyrserthrser405410415proserprothrproasnserthralaglnhisleuvaltyrphearg420425430arglysargasnileleutrparggluglyaspmetphepropheleu435440445aspglyleuileasnalaproileasppheaspprovalproasnthr450455460lysthrilepheaspgluserserserserglyalaseralagluglu465470475480aspglnhisalaserproasnileserleuthrleusertyrphepro485490495lysvalasngluasnthralahisserglygluasngluasnaspcys500505510aspalagluleuargiletrpservalglngluaspaspleualaala515520525glyleusertrpileprophepheglyproglyilegluglyleutyr530535540thralaglyleuilelysasnglnasnasnleuvalcysargleuarg545550555560argleualaasnglnthralalysserleugluleuleuleuargval565570575thrthrglugluargthrpheserleuileasnarghisalaileasp580585590pheleuleualaargtrpglyglythrcyslysvalleuglyproasp595600605cyscysileglyilegluaspleuserargasnilesergluglnile610615620aspglnilelyslysaspgluglnlysgluglythrglytrpglyleu625630635640glyglylystrptrpthrserasptrpglyvalleuthrasnleugly645650655ileleuleuleuleuserilealavalleuilealaleusercysile660665670cysargilephethrlystyrileglyasptyrlysaspaspaspasp675680685lys當(dāng)前第1頁(yè)12