本發(fā)明屬于基因工程和生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，通過(guò)單一重組微生物將可發(fā)酵糖高效生物轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇的方法。

背景技術(shù)：

1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑應(yīng)用于油墨、印染、涂料、潤(rùn)滑劑、抗凍劑等行業(yè)，其最主要的用途是作為聚酯和聚氨酯合成的單體，特別是與對(duì)苯二甲酸聚合生成聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT與PET(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更優(yōu)良的性能，例如更好的耐污染性、韌性和回彈性以及抗紫外性能等，此外還具有耐磨、吸水性低、低靜電等優(yōu)點(diǎn)。因此PTT被認(rèn)為是PET的升級(jí)產(chǎn)品，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前，1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法通常是以環(huán)氧丙烷或者丙烯為原料通過(guò)復(fù)雜的催化過(guò)程合成1，3-丙二醇。化學(xué)合成法的缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多，選擇性差，操作條件需高溫高壓，設(shè)備投資巨大，原料為不可再生資源。因此，化學(xué)法生產(chǎn)1，3-丙二醇的工藝技術(shù)路線目前基本已經(jīng)淘汰。

生物法生產(chǎn)1，3-丙二醇目前主要包含兩條技術(shù)路線：一、以甘油為原料利用天然微生物生產(chǎn)1，3-丙二醇；二、以葡萄糖為原料利用重組微生物生產(chǎn)1，3-丙二醇。具體介紹如下。

一種是以甘油為原料利用天然微生物生產(chǎn)1，3-丙二醇。自然界存在天然的微生物，如克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、丁酸梭狀芽胞桿菌(Clostridium butyricum)及弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)可以在厭氧或者微氧的條件下將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，其代謝途徑主要包括兩步反應(yīng)，第一步：甘油在甘油脫水酶的作用下脫水生成3-羥基丙醛，第二步：3-羥基丙醛在1，3-丙二醇脫氫酶的催化下還原成1，3-丙二醇。其中甘油脫水酶由3個(gè)亞基構(gòu)成，其編碼基因?yàn)閐haBCE(或者dhaB123)。甘油脫水酶在催化甘油脫水的過(guò)程中會(huì)自動(dòng)失活，需要在激活因子的作用下重新被激活。甘油脫水酶激活因子的編碼基因?yàn)閐haG和dhaH。同時(shí)自然界中還存在1，2-丙二醇脫水酶及其激活因子可以催化甘油或者1,2-丙二醇的脫水，其編碼基因?yàn)閜duCDEGH。1，3-丙二醇脫氫酶是一個(gè)NADH依賴的醇脫氫酶，其編碼基因?yàn)閐haT。其他一些醇脫氫酶如大腸桿菌里yqhD基因編碼的NADPH依賴的醇脫氫酶也可以催化3-羥基丙醛還原生產(chǎn)1，3-丙二醇。甘油在還原生成1，3-丙二醇的過(guò)程，需要消耗還原力NADH或者NADPH，這些還原力是通過(guò)甘油氧化成其他副產(chǎn)物如乙酸、乳酸，2，3-丁二醇等產(chǎn)生的。

目前，工業(yè)上利用甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的工藝主要采用克雷伯氏肺炎桿菌(如中國(guó)專(zhuān)利CN 200810105722.8)。這個(gè)工藝路線的主要缺點(diǎn)是：一、克雷伯氏肺炎桿菌為條件致病菌，其生產(chǎn)過(guò)程中生物安全性需要嚴(yán)格控制；二、大量副產(chǎn)物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整個(gè)后提取過(guò)程變得十分復(fù)雜；三、1，3-丙二醇的得率低，通常1，3-丙二醇對(duì)甘油的質(zhì)量得率低于40％。

現(xiàn)有技術(shù)中還有一種是以葡萄糖為原料利用重組大腸桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。自然界不存在可以直接轉(zhuǎn)化葡萄糖生成1，3-丙二醇的微生物。杜邦公司通過(guò)在大腸桿菌內(nèi)外源表達(dá)來(lái)自釀酒酵母的甘油合成途徑(甘油3-磷酸脫氫酶及甘油3-磷酸酶)和來(lái)自克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫水酶及其激活因子并利用大腸桿菌自身的NADPH依賴的醇脫氫酶YqhD，實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到1，3-丙二醇的一步轉(zhuǎn)化(CN 200380104657.2)。這一工藝路線的缺點(diǎn)是大腸桿菌是生物安全性較差，大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)需要使用昂貴的原料酵母粉，因此該技術(shù)不利于產(chǎn)業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生物安全度高、產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便且成本低廉的利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明提出的1,3-丙二醇合成途徑如圖1所示。葡萄糖或者蔗糖等可發(fā)酵糖通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生磷酸二羥基丙酮，后者在磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶催化下生成二羥基丙酮，后者進(jìn)一步在甘油脫氫酶的催化下合成成甘油。甘油在甘油脫水酶及醇脫氫酶的作用下最終生成1,3-丙二醇。該途徑不同于杜邦公司采用的1,3-丙二醇合成方法，主要區(qū)別是杜邦公司通過(guò)表達(dá)甘油3-磷酸脫氫酶及甘油3-磷酸脂酶來(lái)合成中間產(chǎn)物甘油，而本發(fā)明提出的途徑可以在不同微生物里實(shí)現(xiàn)從葡萄糖到1,3-丙二醇的合成。

本發(fā)明提供的一種利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建能夠過(guò)表達(dá)磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶、甘油脫氫酶、甘油脫水酶及其激活因子、醇脫氫酶的重組微生物；

(2)以含可發(fā)酵糖的原料為底物進(jìn)行好氧發(fā)酵。

本發(fā)明的方法中，所述重組微生物的構(gòu)建方法為：1)構(gòu)建分別能夠過(guò)表達(dá)磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶和甘油脫氫酶的重組菌或重組質(zhì)粒；2)構(gòu)建構(gòu)建分別能夠過(guò)表達(dá)甘油脫水酶及其激活因子和醇脫氫酶的重組菌或重組質(zhì)粒；3)將步驟1)獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入步驟2)獲得的重組菌中，或?qū)⒉襟E2)獲得的重組菌電轉(zhuǎn)化入步驟1)獲得的重組菌中，篩選獲得能夠過(guò)表達(dá)磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶、甘油脫氫酶、甘油脫水酶及其激活因子、醇脫氫酶的重組微生物。

所述的微生物為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母。

本發(fā)明利用谷氨酸棒桿菌作為宿主微生物來(lái)構(gòu)建1,3-丙二醇的合成途徑。谷氨酸棒桿菌是一種食品安全級(jí)的微生物，廣泛應(yīng)用于氨基酸的生產(chǎn)，比如谷氨酸和賴氨酸的生產(chǎn)。利用谷氨酸棒桿菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇解決了生物安全性的問(wèn)題。

本發(fā)明所述磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶來(lái)源于谷氨酸棒桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甘油脫氫酶來(lái)源于大腸桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶hdpA獲得方法是：以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組為模板，以hdpA-F(cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG)和hdpA-R(CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT)為引物進(jìn)行PCR，獲得hdpA基因(hdpA基因序列如SEQ ID NO.1)約0.9kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

本發(fā)明的甘油脫氫酶gldA以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，以gldA-F(CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC)和gldA-R(atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC)為引物進(jìn)行PCR，獲得gldA基因(gldA基因序列如SEQ ID NO.2)約1.2kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

優(yōu)選地，所述甘油脫水酶及其激活因子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，甘油脫水酶及其激活因子來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，甘油脫水酶及其激活因子是以克雷伯氏肺炎桿菌HR526的基因組為模板，以pdu-F(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)和pdu-R(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCG)為引物進(jìn)行PCR，獲得包括甘油脫水酶及其激活因子的pduCDEGH操縱子片段(序列如SEQ ID NO.3)并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，除了表達(dá)來(lái)自克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫水酶外，表達(dá)其他來(lái)源的甘油脫水酶同樣可以實(shí)現(xiàn)相同的功能。

本發(fā)明的利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，所述醇脫氫酶來(lái)自大腸桿菌或肺炎克雷伯菌。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，醇脫氫酶yqhD的制備方法是，以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，以引物yqhD-F(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCAC)和yqhD-R(ATATCTCCTTttaGCGGGCGGCTTCG)為引物進(jìn)行PCR，獲得醇脫氫酶基因yqhD片段(序列如SEQ ID NO.3所示)并進(jìn)行純化。

本發(fā)明的利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，步驟(2)所述含可發(fā)酵糖的原料為糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米漿、木糖、木質(zhì)纖維素水解液或甘油。

步驟(2)的發(fā)酵條件為，28-35℃，pH值5-8，溶氧值10％?？赏ㄟ^(guò)流加氨水控制發(fā)酵體系的pH值。

優(yōu)選地，發(fā)酵溫度為30-32℃，pH值為6-7。

發(fā)酵培養(yǎng)基包含糖，KH₂PO₄，MgSO₄，MnSO₄，F(xiàn)eSO₄,玉米漿，(NH₄)₂SO₄，鹽酸硫胺素，維生素B12。

本發(fā)明的利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法還包括發(fā)酵過(guò)程中流加碳源，以及發(fā)酵培養(yǎng)基中含有硫胺素和維生素B12。

上述方法在提高1,3-丙二醇產(chǎn)量中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明通過(guò)在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)內(nèi)源的磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基因hdpA來(lái)強(qiáng)化磷酸二羥基丙酮脫磷酸生成二羥基丙酮，引入外源的甘油脫氫酶將二羥基丙酮轉(zhuǎn)化成甘油，甘油在外源的甘油脫水酶及其激活因子以及醇脫氫酶的作用下最終生成1,3-丙二醇。谷氨酸棒桿菌能夠利用不同的廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵，還可以使用廉價(jià)的玉米漿作為營(yíng)養(yǎng)成分替代昂貴的酵母粉，可以進(jìn)一步降低原料的成本，同時(shí)解決了生物安全性以及菌株對(duì)底物與產(chǎn)物的耐受性問(wèn)題。發(fā)酵過(guò)程中的菌體可以作為產(chǎn)品，用在飼料添加劑當(dāng)中。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，1,3-丙二醇得率高，副產(chǎn)物少，有利于進(jìn)一步簡(jiǎn)化1,3-丙二醇的分離過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明利用重組微生物發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1過(guò)表達(dá)磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基因和來(lái)源于大腸桿菌的甘油脫氫酶基因gldA

以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組為模板，以引物hdpA-F(cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG)和hdpA-R(CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT)為引物進(jìn)行PCR，獲得hdpA基因(hdpA基因序列如SEQ ID NO.1)約0.9kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，以引物gldA-F(CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC)和gldA-R(atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC)為引物進(jìn)行PCR，獲得gldA基因(gldA基因序列如SEQ ID NO.2)約1.2kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

將大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-K18mob2(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI進(jìn)行酶切，利用Gibson Assembly試劑盒(NEB)將hpdA片段和gldA片段一步連接到pEC-K18mob2上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pEC-hdpA-gldA。

利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pEC-hdpA-gldA通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中，電擊條件為電壓2.5KV，電阻600Ω，電容25μF(電擊杯寬度為2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得重組菌，命名為C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA。

實(shí)施例2過(guò)表達(dá)來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫水酶及其激活因子pduCDEGH和來(lái)自大腸桿菌的醇脫氫酶基因yqhD

以克雷伯氏肺炎桿菌HR526的基因組為模板，以引物pdu-F(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)和pdu-R(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCG)為引物進(jìn)行PCR，獲得包括甘油脫水酶及其激活因子的pduCDEGH操縱子片段(序列如SEQ ID NO.3所示)并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，以引物yqhD-F(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCAC)和yqhD-R(ATATCTCCTTttaGCGGGCGGCTTCG)為引物進(jìn)行PCR，獲得醇脫氫酶基因yqhD片段(序列如SEQ ID NO.4所示)并進(jìn)行純化。

將大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19【公開(kāi)于Jakoby,M.J.,Ngouto-Nkili,C.E.and Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.JOURNAL BioTechniques13,437-441(1999)】用XbaI進(jìn)行酶切，利用Gibson Assembly試劑盒(NEB)將pduCDEGH操縱子片段和yqhD片段一步連接到pXMJ19上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pXMJ-yqhD-pdu。

利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pXMJ-yqhD-pdu通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA中，電擊條件如實(shí)施例1所示。在含5mg/L的氯霉素和25mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得重組菌，命名為C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu。

實(shí)施例3重組谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將谷氨酸棒桿菌野生菌株ATCC13032以及實(shí)施例1制得的重組菌株C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA，實(shí)施例3制得的重組菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu在LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。從該新鮮平板上單菌落接種到含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml帶檔板搖瓶中，32℃，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)。

種子培養(yǎng)基的配方包括(g/L)：葡萄糖25，(NH₄)₂SO₄ 5.0,K₂HPO₄ 1.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.005,FeSO₄ 0.005,玉米漿30，卡那霉素0.025。

以10％的接種量將種子液接種到2L發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，發(fā)酵采用5L的發(fā)酵罐，控制溫度為32℃，通氣量為1vvm，調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平保持在10％以上，通過(guò)流加氨水控制pH值穩(wěn)定在7.0左右。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括(g/L)：葡萄糖100，(NH₄)₂SO₄ 30.0,K₂HPO₄2.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.010,FeSO₄ 0.010,玉米漿15，生物素0.0005,鹽酸硫胺素0.005，維生素B12 0.005。

發(fā)酵48小時(shí)，利用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物野生菌株ATCC13032不產(chǎn)甘油以及1,3-丙二醇，C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA產(chǎn)52g/L的甘油但不產(chǎn)1,3-丙二醇。C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu產(chǎn)32g/L的1,3-丙二醇，得率達(dá)到每克葡萄糖產(chǎn)0.32g 1,3-丙二醇。發(fā)酵中沒(méi)有產(chǎn)生甲酸、丁二酸、2,3-丁二醇等副產(chǎn)物，相對(duì)其他工藝來(lái)講，便于后續(xù)的提純工藝。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 清華大學(xué)

<120> 一種利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法

<130> KHP171111659.2

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> hdpA

<400> 1

atgacagtga acatttcata tctgaccgac atggacggcg tcctcatcaa agagggcgag 60

ataattccgg gtgcagatcg ttttcttcag tctctcaccg ataacaatgt ggagtttatg 120

gttttgacca acaactccat tttcaccccg agggatcttt ctgcacgtct taagacttcc 180

ggtttggaaa tcccgccgga gcgtatttgg acttctgcaa ccgccactgc tcacttcctg 240

aaatcccagg tcaaggaggg cacagcctat gttgttggcg agtccggtct gaccactgcg 300

ttgcataccg cgggttggat tttgacggat gcaaatcctg agtttgttgt cctgggcgaa 360

acccgcacat attccttcga ggcaatcact actgcgataa atctgatttt gggtggcgct 420

cgctttattt gcaccaaccc ggatgtcact ggaccttcac caagtggcat tttgcctgct 480

actggctctg tcgccgcact tattaccgca gctactggcg ctgagcctta ttacatcggc 540

aagccaaacc ctgtgatgat gcgcagtgcg ctgaacacca tcggggcgca ttccgagcac 600

actgtcatga tcggcgaccg catggacacc gacgtgaaat ctggtttgga agccggcctg 660

agcaccgtgc tggttcgaag cggaatttcc gacgacgccg agatccgccg ctaccccttc 720

cgcccaactc acgtgatcaa ttccatcgcc gatcttgccg attgctggga cgatcctttc 780

ggtgacggtg catttcacgt accagatgag cagcagttca ctgactag 828

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> gldA

<400> 2

atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60

ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120

ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180

attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240

gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300

aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360

gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420

ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480

cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540

gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600

gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660

gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720

agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780

accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840

acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900

catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960

aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020

ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080

cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104

<210> 3

<211> 5089

<212> DNA

<213> pduCDEGH

<400> 3

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga tggtttcgtt 60

aaggagtgga ttgaagaggg ctttatcgcg atggaaagcc ctaacgatcc caaaccttct 120

atccgcatcg tcaacggcgc ggtgaccgaa ctcgacggta aaccggttga gcagttcgac 180

ctgattgacc actttatcgc gcgctacggc attaatctcg cccgggccga agaagtgatg 240

gccatggatt cggttaagct cgccaacatg ctctgcgacc cgaacgttaa acgcagcgac 300

atcgtgccgc tcactaccgc gatgaccccg gcgaaaatcg tggaagtggt gtcgcatatg 360

aacgtggtcg agatgatgat ggcgatgcaa aaaatgcgcg cccgccgcac gccgtcccag 420

caggcgcatg tcactaatat caaagataat ccggtacaga ttgccgccga cgccgctgaa 480

ggcgcatggc gcggctttga cgaacaggag accaccgtcg ccgtggcgcg ctacgcgccg 540

ttcaacgcca tcgccctgct ggtgggttca caggttggcc gccccggcgt cctcacccag 600

tgttcgctgg aagaagccac cgagctgaaa ctgggcatgc tgggccacac ctgctatgcc 660

gaaaccattt cggtatacgg tacggaaccg gtgtttaccg atggcgatga cactccatgg 720

tcgaaaggct tcctcgcctc ctcctacgcc tcgcgcggcc tgaaaatgcg ctttacctcc 780

ggttccggtt ctgaagtaca gatgggctat gccgaaggca aatcgatgct ttatctcgaa 840

gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcc ggggtgcaag gcctgcagaa tggctccgtc 900

agctgtatcg gcgtaccgtc cgccgtgccg tccgggatcc gcgccgtact ggcggaaaac 960

ctgatctgct cagcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgatcaaac ctttacccac 1020

tcggatatgc ggcgtaccgc gcgtctgctg atgcagttcc tgccaggcac cgacttcatc 1080

tcctccggtt actcggcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggttc caacgaagat 1140

gccgaagact tcgatgacta caacgtgatc cagcgcgacc tgaaggtcga tggcggcctg 1200

cggccggtgc gtgaagagga cgtgatcgcc attcgcaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260

gcggtatttg ccggcatggg tttgccgcct attacggatg aagaagtaga agccgccacc 1320

tacgcccacg gttcaaaaga tatgcctgag cgcaatatcg tcgaggacat caagtttgct 1380

caggagatca tcaacaagaa ccgcaacggc ctggaagtgg tgaaagccct ggcgaaaggc 1440

ggcttccccg atgtcgccca ggacatgctc aatattcaga aagccaagct caccggcgac 1500

tacctgcata cctccgccat cattgttggc gagggccagg tgctctcggc cgtgaatgac 1560

gtgaacgatt atgccggtcc ggcaacaggc taccgcctgc aaggcgagcg ctgggaagag 1620

attaaaaata tcccgggcgc gctcgatccc aatgaacttg gctaaggggt gaaaaatgga 1680

aattaacgaa acgctgctgc gccagattat cgaagaggtg ctgtcggaga tgaaatcagg 1740

cgcagataag ccggtctcct ttagcgcgcc tgcggcttct gtcgcctctg ccgcaccggt 1800

cgccgttgcg cctgtgtccg gcgacagctt cctgacggaa atcggcgaag ccaaacccgg 1860

cacgcagcag gatgaagtca ttattgccgt cgggccagcg tttggtctgg cgcaaaccgc 1920

caatatcgtc ggcattccgc ataaaaatat tctgcgcgaa gtgatcgccg gcattgagga 1980

agaaggcatc aaagcccggg tgatccgctg ctttaagtct tctgacgtcg ccttcgtggc 2040

agtggaaggc aaccgcctga gcggctccgg catctcgatc ggtattcagt cgaaaggcac 2100

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ccagccgcgc cgacaaacga caccgttcgc cagccaaaag ttagcgacta cccgttagcg 2520

acccgccatc cggagtgggt caaaaccgct accaataaaa cgctcgatga cctgacgctg 2580

gagaacgtat taagcgatcg cgttacggcg caggacatgc gcatcactcc ggaaacgctg 2640

cgtatgcagg cggcgatcgc ccaggatgcc ggacgcgatc ggctggcgat gaactttgag 2700

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cgcccatacc gttccaccca ggcggagcta ctggcgatcg ctgatgacct cgagcatcgc 2820

taccaggcac gactctgtgc cgcctttgtt cgggaagcgg ccgggctgta catcgagcgt 2880

aagaagctga aaggcgacga ttaacagggg gtaagcatgc gctatatcgc tggcattgat 2940

attggcaact cctcgacaga agtcgccctg gcgacggtcg atgacgcagg tgtgctgaac 3000

actcgccaca gcgcgttggc tgaaaccacg ggtataaaag gcacattacg aaatgtgttc 3060

ggtatccagg aggcgctaac gcaggcggca aaagcggccg gcattcagct cagcgatatt 3120

tcgcttattc gcattaacga agccacgccg gtcattggcg atgtggcgat ggaaaccatc 3180

acggaaacca tcatcaccga gtccaccatg atcggccata acccgaagac acccggcggc 3240

gtcggactgg gggtcggcat caccatcaca ccagaggcgc tgctgtcctg ctccgcggac 3300

actccctata ttctggtggt ctcctcggcc tttgactttg ccgatgtcgc cgcgatggtc 3360

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gtgctggtca ataaccggct acagcaaccg ctaccggtga tcgacgaagt tcagcatatc 3480

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gaaacgctct ccaaccccta cggtattgcg accgttttcg atctcaacgc cgaggagacc 3600

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cagatggccc tcatcgcccg tgaaattgag cacaaactgc agattgcggt tcaggtgggc 4080

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gtcgaaagcc tgtttcatct gcgtcatgaa gacggcagcg tccagttttt tccgtcggcc 4380

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gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

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cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

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cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

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atatctcctt ttagcgggcg gcttcg 26