本發(fā)明屬于食品生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種根際細菌Gynuellasunshinyii來源的低溫殼聚糖酶(GsCho46A)及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
：殼寡糖(Chitooligosaccharides,COS)是由海洋蝦蟹殼來源的殼聚糖降解生成的小分子寡糖。殼寡糖分子內(nèi)的D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通過β-1,4-糖苷鍵連接，聚合度(DP)通常介于2-10之間，分子量一般不超過3kDa。殼寡糖具有良好水溶性和豐富的生理活性，不同的DP的殼寡糖生理功能有所差異，其中DP6-8的殼寡糖在提高巨噬細胞吞噬能力、抑制腫瘤細胞生長、降低膽固醇、抗氧化和植物免疫誘抗等方面具有較強活性，在功能食品、抗癌藥物、免疫增強劑及作物生物制劑領(lǐng)域具有獨特而重要的應用。目前，常用的殼寡糖制備方法分別有：酶法水解、酸法水解、氧化降解和物理降解法。其中酶法降解殼聚糖具有反應條件溫和、不添加其他化學試劑、無副產(chǎn)物、低環(huán)境污染、產(chǎn)物分子量易于控制、產(chǎn)品的食用安全性高等優(yōu)點，是目前應用前景最廣、最為理想的殼聚糖降解方法，近年來已經(jīng)逐漸用于工業(yè)化生產(chǎn)，并且取得了良好的經(jīng)濟效益。酶法降解殼聚糖涉及到的專一性酶主要為殼聚糖酶(EC3.2.1.132)。殼聚糖酶遵從內(nèi)切反應機制隨機催化水解殼聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，可有效地將殼聚糖降解為水溶性的低分子殼聚糖或殼寡糖。國內(nèi)外研究者對于殼聚糖酶均展開了大量探索性研究，已報道的殼聚糖酶主要來源于細菌、真菌、部分植物及宏基因組。由于微生物來源的殼聚糖酶具有生產(chǎn)周期快、酶活力穩(wěn)定、生產(chǎn)容易放大等優(yōu)點，目前已成為殼聚糖酶研究的最重要來源。一些微生物來源的殼聚糖酶能夠高效水解殼聚糖制備殼寡糖，具有良好應用前景。如：Purpureocilliumlilacinum來源的殼聚糖酶水解殼聚糖可以制備得到DP2–6的活性殼寡糖，反應12h水解率達到85.8％，產(chǎn)物中殼二糖到殼六糖的比例分別為3.8％，43.91％，50.36％，0.46％，0.77％(Carbohyd.Polym.,2015,121:1–9.)。Aspergillussp.來源殼聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性，能夠水解殼聚糖生成DP2-7的殼寡糖(Int.J.Biol.Macromol.,2015,81:362–369.)。盡管酶法制備殼寡糖存在許多優(yōu)勢，但現(xiàn)有的殼聚糖酶普遍存在活力較低、應用性能較差、產(chǎn)物聚合度不可控、使用成本高等問題，目前尚無商品化專一性制備殼寡糖的殼聚糖酶制劑(Mar.Drugs,2014,12:5328–5356.)。此外，由于DP6-8的殼寡糖具有較高的生理活性，控制水解條件制備DP6-8的殼寡糖含量較高的殼寡糖產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。制備特定DP或DP區(qū)間的殼寡糖也是定性、定量研究殼寡糖構(gòu)效關(guān)系的關(guān)鍵前提。目前規(guī)?；a(chǎn)殼寡糖產(chǎn)品主要通過優(yōu)化酶解條件來控制殼寡糖產(chǎn)物聚合度。常用的方法主要通過加熱滅酶、調(diào)節(jié)水解液pH、加入蛋白變性劑等方式來控制酶解時間，使得反應終產(chǎn)物中DP6-8的殼寡糖含量達到最優(yōu)。但目前報道較多的殼聚糖酶均為高溫酶(50-60℃)，對反應容器控制條件要求較高，不利于工業(yè)生產(chǎn)精確控制酶解過程(公開號：CN102154241A；CN102250858A；CN102392035A；CN104371989A和CN105602921A)。而調(diào)節(jié)水解液pH、蛋白變性劑等工藝由于額外的化學試劑添加，對后續(xù)分離純化步驟帶來較大壓力。相比之下，低溫殼聚糖酶在此方面具有獨特優(yōu)勢，包括：(1)可縮短酶解過程加熱、冷卻時間，有效節(jié)約能耗；(2)無需高溫滅酶步驟，減少反應設(shè)備投資成本，可精準控制酶解過程；(3)整個酶解過程在溫和、低溫條件下進行，避免高溫造成的殼寡糖產(chǎn)品發(fā)黃、產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題。目前低溫殼聚糖酶的報道較少，部分公開的產(chǎn)低溫殼聚糖酶天然菌株產(chǎn)酶活力較低，不利于工業(yè)化應用(公開號：CN102653749A)。因此，發(fā)掘在低溫下具有較高活性的殼聚糖酶，探索低溫殼聚糖酶制備殼寡糖的酶解工藝，具有重要的工業(yè)應用價值和潛力。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)，將其命名為GsCho46A，a)氨基酸序列是SEQIDNO.2中第1-266位氨基酸殘基編碼的蛋白質(zhì)；b)在SEQIDNO.2第1-266位所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQIDNO.2中第1-266位所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白質(zhì)。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQIDNO.2第1-266位氨基酸殘基編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQIDNO.1第1-801位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。本發(fā)明的另一個目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的生物材料為下述B1)-B5)中的任一種：B1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體或含有B2)所述表達盒的重組載體；B4)含有B1)所述核酸分子的重組菌或含有B2)所述表達盒的重組菌或含有B3)所述重組載體的重組菌；B5)含有B1)所述核酸分子的細胞系或含有B2)所述表達盒的細胞系或含有B3)所述重組載體的細胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)核苷酸序列是SEQIDNO.1第1-801位所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；4)利用密碼子優(yōu)化后獲得的編碼SEQIDNO.2所示相同氨基酸序列及a)或b)所述條件的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼GsCho46A的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼GsCho46A的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsCho46A且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的SEQIDNO.2第1-266位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有編碼GsCho46A的核酸分子的表達盒(GsCho46A基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達GsCho46A的DNA，該DNA不但可包括啟動GsCho46A轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止GsCho46A轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動子及誘導型啟動子。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白質(zhì)的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)在作為殼聚糖酶中的應用。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)在水解殼聚糖中的應用。上述應用中，所述殼聚糖包括殼聚糖以及脫乙酰度為20-100％的脫乙酰幾丁質(zhì)。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)在制備殼寡糖以及幾丁寡糖中的應用。上述應用中，所述殼寡糖以及幾丁寡糖聚合度為2-10，脫乙酰度為20-100％。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌是將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降木?。上述重組菌中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因是通過重組載體導入宿主菌；所述重組載體為將上述蛋白質(zhì)的編碼基因插入表達載體的多克隆位點中得到的載體。所述重組載體具體為在載體pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位點間插入了SEQIDNO.1中第1-801位所示的DNA片段，且保持載體pET-28a(+)的其他序列不變得到的載體。上述重組菌中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因是SEQIDNO.1第1-801位所示的DNA分子。上述重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明還有一個目的是提供一種殼聚糖酶的制備方法。本發(fā)明提供的殼聚糖酶的制備方法包括如下步驟：誘導培養(yǎng)上述重組菌，得到殼聚糖酶。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種生產(chǎn)高聚合度(DP2-7)殼寡糖的方法。本發(fā)明提供的生產(chǎn)高聚合度殼寡糖的方法包括如下步驟：用上述蛋白質(zhì)水解殼聚糖，得到高聚合度殼寡糖。上述方法中，第一個發(fā)明目的所述的蛋白質(zhì)的濃度為0.1U/mL。上述方法中，β-1,3-葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)為0.1-4％。上述方法中，水解的條件為：pH4.5-6.0，20-30℃水解20-50min；所述水解的條件具體為：pH5.5，30℃水解20min。本發(fā)明所公開的殼聚糖酶具有優(yōu)良的酶學性質(zhì)：低溫條件下活性較高，對酶解設(shè)備要求較低；可通過溫度控制高效制備聚合度(DP)2-7的高聚合度殼寡糖；反應條件溫和，能源消耗少，無污染物產(chǎn)生。在酶法制備殼寡糖中具有重要的應用價值，具有重要的經(jīng)濟價值。本發(fā)明進一步通過下面的實施例進行闡述。附圖說明圖1顯示了大腸桿菌重組GsCho46A經(jīng)Ni-IDA親和層析純化的純化圖。其中，泳道M代表低分子量標準蛋白，泳道1代表破壁后的上清液，泳道2代表經(jīng)Ni-IDA親和層析后的蛋白。圖2顯示了溫度變化對GsCho46A酶活力的影響。所用緩沖液為：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)。圖3顯示了溫度變化對GsCho46A酶活穩(wěn)定性的影響。所用緩沖液為：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)。圖4顯示了GsCho46A對殼聚糖的水解特性。圖5顯示了GsCho46A水解殼聚糖產(chǎn)物的MALDI-TOFMS分析圖譜。水解時間為15min，圖中顯示水解產(chǎn)物的聚合度分布在2-7。圖6顯示了GsCho46A水解殼聚糖產(chǎn)物的MALDI-TOFMS分析圖譜。水解時間為120min，圖中顯示水解產(chǎn)物的聚合度分布在2-5。實施發(fā)明的最佳方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、基因GsCho46A及蛋白GsCho46A的獲得依據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中已提交的Gynuellasunshinyii全基因組序列信息(在文獻“Int.J.Syst.Evol.Micr.2015,65,1038–1043”中公開)，以其中編碼GlycosideHydrolase(GH)46家族未知假想蛋白(hypotheticalProtein；GenbankID:AJQ97965)的目的基因序列為模板序列，全基因合成目的基因。設(shè)計上游引物GsCho46A-up(5’-ATTCTAGCTAGCATGAATCCGTTCTGGCATTTTG-3’，下劃線示NheⅠ酶切位點)和下游引物GsCho46A-down(5’-ATTCCGCTCGAGTTAACGGATCGGCAGGATGAAAAC-3’，下劃線示XhoⅠ酶切位點)，以全基因合成的目的基因為模板，PCR擴增得到目的DNA片段。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，循環(huán)35次；最后72℃后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳回收，以NheⅠ和XhoⅠ雙酶切。將該雙酶切后的產(chǎn)物與經(jīng)相同雙酶切過的原核表達載體pET-28a(+)(美國Novagen公司，產(chǎn)品編號：69864-3)片段以T4DNA連接酶進行連接，得到重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌DH5α。挑選菌落PCR(PCR所用的引物和擴增條件與本段前述PCR的相同)驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子測序。測序結(jié)果表明：重組質(zhì)粒為在載體pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位點間插入了SEQIDNO.1中第69-801位所示的DNA片段，陽性轉(zhuǎn)化子即為含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α。將SEQIDNO.1中第1-801位所示的基因命名為基因GsCho46A，將該基因所編碼的蛋白命名為蛋白GsCho46A，其氨基酸序列如SEQIDNO.2中第1-266位所示。實施例2、重組殼聚糖酶(GsCho46A)的表達和純化及其性質(zhì)檢測一、重組殼聚糖酶(GsCho46A)的表達和純化將實施例1中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達至宿主大腸桿菌BL21(DE3)(北京博邁德基因技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：BC201-01)，得到重組菌，并將其接種至1LLB液體培養(yǎng)基(含50μgmL-1卡那霉素)，在37℃，200rpm條件下培養(yǎng)至OD600在0.6-0.8之間，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為1mM，30℃誘導過夜。離心收集菌體后，將菌體按照1:10(v/v)的比例，用緩沖液A(20mMTris-Hcl沖液，0.5MNaCl，20mM咪唑,pH7.9)重懸浮，然后于冰水浴中超聲破碎(200W，超聲3s，間歇4s，120次)，再離心收集上清液即為粗酶液，粗酶液中含有重組蛋白GsCho46A，即重組殼聚糖酶(GsCho46A)。基于pET28-a(+)質(zhì)粒中有編碼His-Tag標簽蛋白的序列，使用瓊脂糖Ni-IDA親和柱純化重組蛋白GsCho46A(即在SEQIDNO.2所示氨基酸序列的N端連接了His-Tag標簽序列(HHHHHH)的重組蛋白)。具體純化步驟如下：將粗酶液上樣于Ni-IDA柱進行純化。純化的具體步驟為(流速為1mLmin-1)：先用緩沖液A(20mMTris-Hcl沖液，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH7.9)洗脫至OD280小于0.05，然后用緩沖液B(20mMTris-Hcl沖液，0.5MNaCl，50mM咪唑，pH7.9)洗脫至OD280小于0.05，最后用緩沖液C(20mMTris-Hcl沖液，0.5MNaCl，200mM咪唑，pH7.9)洗脫。收集緩沖液C洗脫部分，得到純化的重組殼聚糖酶(GsCho46A)的溶液。經(jīng)SDS-PAGE(Laemmli，U.K.Nature，1970，227(5259):680-685)檢測蛋白純度(圖1)。結(jié)果顯示重組蛋白GsCho46A經(jīng)Ni-IDA親和柱一步純化可得電泳純蛋白，分子量大小約為30kDa。二、重組殼聚糖酶(GsCho46A)的性質(zhì)檢測1、GsCho46A的酶活力步驟一制備得到的重組殼聚糖酶(GsCho46A)的比酶活為260Umg-1。殼聚糖酶的酶活力的測定方法具體如下：在1.5mL離心管中先后加入350μL殼聚糖底物(0.5％,W/V；pH5.5，100mM醋酸-醋酸鈉緩沖液)及50μL適當稀釋的酶液，30℃反應10min，隨后采用DNS法測定反應液中的還原糖含量。酶活力單位(1U)定義為：在上述反應條件下，每分鐘生成1μmol的氨基葡萄糖所需要的酶量。其中，殼聚糖底物制備方法：將0.5g殼聚糖用適量100mM醋酸溶液溶解。隨后用100mM醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5。經(jīng)過這一處理，殼聚糖即形成均一、透明的溶液。2、GsCho46A的最適反應溫度測定將步驟一制備得到的純化的重組殼聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)中適當稀釋，然后分別在不同溫度下：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃按照步驟1中的方法測定殼聚糖酶的酶活力，以酶活力的最高值作為100％，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示重組殼聚糖酶(GsCho46A)的最適溫度為30℃，在20-40℃均具有較高活性。3、GsCho46A的溫度穩(wěn)定性測定將步驟一制備得到的純化的重組殼聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)中適當稀釋，然后分別在不同溫度下：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，保溫30min，隨后在冰水浴中冷卻30min，最后在30℃和pH5.5條件下按照步驟1中的方法測定殼聚糖酶的酶活力，以未經(jīng)熱處理的酶液作為對照，分別計算不同熱處理后酶液的殘余酶活力。以殘余酶活力占對照酶活力的百分比計算相對酶活力。結(jié)果如圖3所示。圖3顯示重組殼聚糖酶(GsCho46A)在35℃以下較為穩(wěn)定，酶活力能保持80％以上。實施例3、重組殼聚糖酶(GsCho46A)在酶法制備殼寡糖中的應用重組殼聚糖酶(GsCho46A)水解殼聚糖反應條件參照酶的最適反應條件：pH5.5，30℃，底物濃度1％，加酶量0.5U/mL，水解時間2h。水解液體積5L，攪拌轉(zhuǎn)速80-120rpm/min。分別于0，5，10，15，30，60，120min取樣，50度保溫10min滅酶終止反應。(1)薄層層析法(thinlayerchromatography，TLC)監(jiān)測水解產(chǎn)物采用Kieselgel60硅膠板(Merck)分析水解產(chǎn)物，展層液為正丁醇：甲醇：氨水：水(5:4:2:1，v/v/v)。樣品點樣2μL于硅膠板點樣點，將硅膠板用展層劑展開，吹干后在其表面均勻用顯色劑硫酸：甲醇(5:95,v/v)溶液浸濕，然后在130℃烘箱中烘烤5min顯色。(2)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，Maldi-tof-MS)分析水解產(chǎn)物為了鑒定GsCho46A的最終水解中寡糖組成，采用MALDI-TOFMS法分析GsCho46A水解殼聚糖水解產(chǎn)物。取反應液稀釋100倍，與等體積10mg/mL2,5-羥基苯甲酸水溶液混合均勻。樣品(1μL)上樣于Maldi載片使用ABSCIEXTOF/TOFTM4800系統(tǒng)采用陽離子模式分析樣品。實驗結(jié)果顯示，GsCho46A能夠水解殼聚糖生成一系列的低聚糖(圖4)，隨著反應進行，反應液中的殼寡糖聚合度主要分布在DP2-7(圖5)。經(jīng)過兩小時的水解，底物中的殼聚糖糖幾乎被完全水解為殼二糖-殼四糖(圖6)。利用GsCho46A的這一低溫反應特點，可以有效通過控制酶解溫度(30℃反應15min后，50℃終止反應)制備DP6-8含量較高的殼寡糖混合物。(3)殼寡糖產(chǎn)品精制1、工藝一將上述制備的殼寡糖水解液泵入離子交換柱，采用陰陽離子交換樹脂(大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂(D301型)；強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(001×7型))脫去料液中的鹽離子。將脫離子后的料液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60-70℃)濃縮至糖液固形物含量30-60％，噴霧干燥得到殼寡糖粉末。2、工藝二將上述制備的殼寡糖水解液經(jīng)膜過濾系統(tǒng)(納濾膜：截留量150；操作壓力0.4-0.8mP)濃縮，將料液濃縮至糖液固形物含量20-30％，期間脫去料液中的大部分離子，得到殼寡糖糖漿。最后將殼寡糖糖漿噴霧干燥得到殼寡糖粉末。工業(yè)應用本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)(在實施例中具體為重組蛋白GsCho46A)具有殼聚糖酶活性，具有260Umg-1的比酶活，最適反應pH為5.5，最適反應溫度為30℃，并且在35℃以下保持較高酶活力；該蛋白質(zhì)作為殼聚糖酶可以高效水解殼聚糖制備高聚合度(DP6-8)殼寡糖含量較高的殼寡糖混合物。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)具有良好的殼聚糖酶酶學性質(zhì)，在低聚糖制備以及食品、飼料等行業(yè)中具有良好的應用價值。上述的對實施例的描述是為便于該
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。<110>華東理工大學<120>一種低溫殼聚糖酶及其編碼基因與應用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>801<212>DNA<213>Gynuellasunshinyii<400>1atgaatccgttctggcatttggcaatcactctgacgtgcctgagtttccttgttatgccg60gtacaggcggcacagttaacggcgcagcaacgtctgttggccgatcagatcatcagtatt120ttcgaaaataacacgccggagctgcagtatgggtatgccgaggtactcgatgatggtcgt180ggcataaccgccggccgggccggttttacctctgcgaccggtgatatgctcgaagtgatt240caacgttacagccgccttcgtcccgataatattctggtgccgtttttgccgcgtctgcaa300cagctggcggcatcggaagatggcagtatcgaagggttgcagggattaccgcaacgctgg360gccgatgccagccagaaccctgtgtttcgtcaggttcaggatgacgtggtggatgagttg420tattttcaaccggccatggaacgggcagcggaactgggagcacaaatgcctctgactctg480ctggctctgtatgacgccattatccagcatggtgagggtgacgatggcgatggtctgccc540gccatgattgcccgtaccacggcgaaagtgaacggtattcctgctgaaggtgtcgatgaa600cgacgctggttaaaaacctttctcaaaatccgcaaacaggttttgcggcatccggccaat660cttgaaacagaggacgagtggtctgaatccaccggccgggtggatagtctgatgaaatta720ttgaaacagggtaataccgatcttcaccccccgatacgcatatcaacctggggcgatgta780ttcatattgccgatccgatag801<210>2<211>266<212>PRT<213>Gynuellasunshinyii<400>2MetAsnProPheTrpHisLeuAlaIleThrLeuThrCysLeuSer51015PheLeuValMetProValGlnAlaAlaGlnLeuThrAlaGlnGln202530ArgLeuLeuAlaAspGlnIleIleSerIlePheGluAsnAsnThr354045ProGluLeuGlnTyrGlyTyrAlaGluValLeuAspAspGlyArg505560GlyIleThrAlaGlyArgAlaGlyPheThrSerAlaThrGlyAsp657075MetLeuGluValIleGlnArgTyrSerArgLeuArgProAspAsn808590IleLeuValProPheLeuProArgLeuGlnGlnLeuAlaAlaSer95100105GluAspGlySerIleGluGlyLeuGlnGlyLeuProGlnArgTrp110115120AlaAspAlaSerGlnAsnProValPheArgGlnValGlnAspAsp125130135ValValAspGluLeuTyrPheGlnProAlaMetGluArgAlaAla140145150GluLeuGlyAlaGlnMetProLeuThrLeuLeuAlaLeuTyrAsp155160165AlaIleIleGlnHisGlyGluGlyAspAspGlyAspGlyLeuPro170175180AlaMetIleAlaArgThrThrAlaLysValAsnGlyIleProAla185190195GluGlyValAspGluArgArgTrpLeuLysThrPheLeuLysIle200205210ArgLysGlnValLeuArgHisProAlaAsnLeuGluThrGluAsp215220225GluTrpSerGluSerThrGlyArgValAspSerLeuMetLysLeu230235240LeuLysGlnGlyAsnThrAspLeuHisProProIleArgIleSer245250255ThrTrpGlyAspValPheIleLeuProIleArg260265當前第1頁1 2 3