本申請屬于基因工程或酶工程領(lǐng)域，具體地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其編碼核酸，以及包含所述編碼核酸的表達載體和宿主細胞。本申請還涉及上述多肽的制備方法及其用途。

發(fā)明背景

脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，由于微生物不但種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，而且具有比動物更廣泛的pH值、溫度范圍以及底物專利性，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。據(jù)統(tǒng)計，產(chǎn)脂肪酶的微生物有65個屬，主要集中在黑曲霉、假絲酵母、根霉、假單胞菌、鏈霉菌和堿假單胞菌等菌株。

脂肪酶在食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、化學(xué)化工等方面均有重要應(yīng)用：

食品工業(yè)：在油脂加工方面，由于脂肪酶的引入，油脂水解可在常溫常壓下進行，因此不會使高度不飽和脂肪酸和生育酚等生物物質(zhì)變性。在乳品加工方面，應(yīng)用脂肪酶在乳品中進行乳脂水解，可增強干酪、奶粉、奶油的風(fēng)味，促進干酪的成熟，改善乳制品的品質(zhì)。在面食加工方面，添加脂肪酶，使面食彈性提高，改善食感，提高面包的保鮮能力。

醫(yī)療衛(wèi)生：在醫(yī)療方面，脂肪酶作為診斷工具，可預(yù)測疾病，如血清中脂肪酶可用于檢測急性胰腺炎和胰腺損傷。此外，脂肪酶在藥物生產(chǎn)、減輕體重方面等方面也有應(yīng)用。

化學(xué)化工：在生物柴油合成方面，酶法具有提取純化工藝簡單、設(shè)備投資少、耗能低、污染小等優(yōu)點，日益引起人們的普遍關(guān)注，其中織物膜固定化的Novozym 435和Candida sp.99-125是生物柴油生產(chǎn)的常用酶。在洗滌工業(yè)方面，1988年，諾維信公司首先將含脂肪酶且能有效除去油污的洗滌劑推向市場，應(yīng)用遺傳工程開發(fā)出洗滌劑用 脂肪酶更是現(xiàn)代生物技術(shù)大規(guī)模工業(yè)化最成功的應(yīng)用之一。在紙漿和造紙工業(yè)，脂肪酶被用來除去紙漿中的“洽脂”，日本Nippon紙業(yè)研制了一種“洽脂”控制方法，即用Candida rugasa脂肪酶水解甘三酯，水解度達90％。

脂肪酶在乳制品中使用可以產(chǎn)生香味，因此可以應(yīng)用在乳酪制造中。傳統(tǒng)上，使用來自山羊或小牛等反芻動物脂肪酶制劑。這些制劑來自這些動物的前胃組織，并且這些脂肪酶制劑，也被稱作為前胃脂肪酶。市場上存在商業(yè)試劑Piccantase C,L,KG and K(DSM Food Specialties,荷蘭)。這些脂肪酶被用于多種意大利、西班牙、希臘和法國乳酪制備中，這些類型乳酪熟化期間特定香味譜的產(chǎn)生很大程度上歸因于脂肪酶對乳脂肪的作用。脂肪酶催化乳脂肪的水解，產(chǎn)生游離脂肪酸。所述脂肪酸可以具有短鏈(C4-C6脂肪酸，即丁酸、己酸)和中到長鏈(C12-C18)脂肪酸。隨后游離脂肪酸可參與化學(xué)反應(yīng)，例如香味化合物，如乙酸乙酯、β-酮酸、甲基酮、酯和內(nèi)酯的形成。香味組分中的脂肪酸的轉(zhuǎn)化可以由來自乳酪中的微生物種群中的酶催化。

使用的脂肪酶可以影響乳酪中釋放的游離脂肪酸的類型，例如，辛辣的、強烈的香味主要產(chǎn)生于釋放短鏈脂肪酸(C4-C6)的脂肪酶，而中長鏈脂肪酸則會產(chǎn)生肥皂樣的口味。所以許多研究致力于將脂肪酶改造為短鏈偏好，以應(yīng)用于乳酪制造。(CN 102016015A；Moore et al.,1995；Smith et al.,1996；Schmitt et al.,)。

發(fā)明概述

第一方面，本申請?zhí)峁┝司哂兄久富钚缘亩嚯?，其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，其中由(b)獲得的多肽變體仍保持脂肪酶活性。

在任選的實施方案中，上述多肽與異源多肽融合。

在一實施方案中，本申請的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸 序列。在優(yōu)選的實施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成。

第二方面，提供了編碼第一方面的多肽的多核苷酸，其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：

(a)核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一個氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在嚴格條件下與a)中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

在一實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成。

在一實施方案中，本申請的多核苷酸是通過人工合成產(chǎn)生的或是通過重組產(chǎn)生的。

第三方面，提供了表達載體，其包含至少一種上述的多核苷酸。

在某些實施方案中，本申請的表達載體還包含調(diào)節(jié)多核苷酸表達的調(diào)控序列，其中多核苷酸與調(diào)控序列可操作地連接。在優(yōu)選的實施方案中，所述表達載體為pCold-TF。

第四方面，提供了包含本申請的多核苷酸或表達載體的宿主細胞。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

第五方面，提供了制備本申請的多肽的方法，其包括：

1)將上述多核苷酸克隆在表達載體上，

2)將表達載體轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞中，

3)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述宿主細胞，

4)從所述宿主細胞或培養(yǎng)基中分離并純化所述多肽。

在優(yōu)選的實施方案中，提供了制備由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的多肽的方法，其包括：將編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列克隆在質(zhì)粒表達載體中，以及將帶有該多核苷酸序列的質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達，然后從大腸桿菌中分離并純化BM19多肽。

第六方面，提供了按照第五方面的方法制備的脂肪酶。

第七方面，提供了上述多肽、多核苷酸、表達載體或宿主細胞在制 備脂肪酶中的用途。

第八方面，提供了上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表達載體或宿主細胞在制造食品中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實施方案中，將本申請上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表達載體或宿主細胞應(yīng)用于乳制品或面食的制造中。在一具體實施方案中，上述乳制品為乳酪。

第九方面，提供了利用上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表達載體或宿主細胞制造的食品。在優(yōu)選的實施方案中，所述食品為乳制品或面食。

本申請的多肽具有中短鏈脂肪酸專一性。

附圖簡要說明

圖1顯示了BM19多肽的凝膠電泳圖。第1泳道為分子量標志物，第2泳道為BM19多肽。

圖2顯示了分別以4-硝基苯基丁酸酯(pNPB)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPO)、4-硝基苯基月桂酸酯(pNPD)和4-硝基苯基棕櫚酸酯(pNPP)作為底物時，BM19作為脂肪酶的催化水解活性。

圖3顯示了不同溫度下BM19的酶活檢測結(jié)果。

圖4顯示了不同pH下BM19的酶活檢測結(jié)果。

圖5顯示了不同金屬離子對BM19的酶活的影響。

圖6顯示了不同表面活性劑對BM19的酶活的影響。

具體實施方式

多肽

本申請?zhí)峁┝司哂兄久富钚缘亩嚯模浒x自以下的序列或由選自以下的序列組成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，其中由(b)獲得的多肽變體仍保持脂肪酶活性。

在一些實施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的數(shù)目為1-30個，優(yōu)選為1-20個，更優(yōu)選為1-10個，其中獲得的多肽變體基本上能保持脂肪酶活性。在優(yōu)選的實施方案中，上述多肽變體與SEQ ID NO:1所示的 氨基酸序列相差約1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更優(yōu)選的實施方案中，上述多肽變體與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相差約1、2、3、4或5個氨基酸的取代、缺失或添加。

在一些實施方案中，本申請的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成。

由此，本申請?zhí)峁┝艘环N脂肪酶，其包含本文公開的具有脂肪酶活性的多肽或其變體，或者由所述多肽或其變體組成。在本文中，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的多肽被命名為脂肪酶BM19。

在任選的實施方案中，上述多肽與異源多肽融合，形成融合蛋白。

如本文所用的，術(shù)語“氨基酸”表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類似物和模擬物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20種(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羥脯氨酸、羥賴氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正纈氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。氨基酸類似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修飾形式。這種修飾可以包括例如取代氨基酸上的化學(xué)基團和部分，或者氨基酸的衍生化。氨基酸模擬物包括例如表現(xiàn)出功能上類似性質(zhì)的有機結(jié)構(gòu)，所述性質(zhì)例如氨基酸的電荷和電荷空間特性。例如，模擬精氨酸(Arg或R)的有機結(jié)構(gòu)具有位于類似分子空間并且具有與天然存在的Arg氨基酸的側(cè)鏈的e-氨基相同程度的移動性的正電荷部分。模擬物還包括約束結(jié)構(gòu)以維持氨基酸或氨基酸官能團的最佳空間和電荷相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定什么結(jié)構(gòu)構(gòu)成功能上等效的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。

在一些實施方案中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的變體與SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在優(yōu)選的實施方案中，多肽變體與SEQ ID NO:1所示序列具有99％以上的同源性。

本文所述的“同源性”被定義為經(jīng)過序列比對和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列變體中相同的殘基的百分比，如果需要，達到最大百分比 的同源性。用于比對的方法和計算機程序在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。

術(shù)語“多肽”和“蛋白”在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成的和天然存在的類似物。因此，這些術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化學(xué)衍生物，以及其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物)的氨基酸聚合物。此類衍生物包括例如翻譯后修飾和降解產(chǎn)物，包括SEQ ID NO:1所示的多肽片段的磷酸化的、糖基化的、氧化的、異構(gòu)化的和脫氨基化的變體。

在優(yōu)選的實施方案中，BM19多肽變體的序列是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中包含一個或幾個保守性氨基酸取代的序列，其中經(jīng)取代后的序列仍保持脂肪酶催化活性。

被稱為“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能夠在蛋白質(zhì)中頻繁出現(xiàn)，但不改變該蛋白質(zhì)的構(gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué)中已建立的法則。

本發(fā)明中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一個取代這些脂肪族氨基酸的任何另外一個；用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，反之亦然；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用賴氨酸(K)取代精氨酸(R)，反之亦然；用苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)取代這些芳香族氨基酸中的任何另外一個；以及用甲硫氨酸(M)取代半胱氨酸(C)，反之亦然。其他的取代也可以被視為是保守性的，這取決于特定氨基酸環(huán)境和它在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)經(jīng)?？梢曰Q，如同丙氨酸(A)和纈氨酸(V)可以互換。相對疏水的甲硫氨酸(M)可以經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨酸互換，以及有時與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)常在以下位置互換：其中氨基酸殘基的重要特征是其電荷，以及這兩種氨基酸殘基的不同pK并不明顯。在特定的環(huán)境下，仍有其他一些變化可以視為“保守性”的(參見，例如，BIOCHEMISTRY at pp.13-15,2^nd ed.Lubert Stryer ed.(Stanford University)；Henikoff et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(1992)89:10915-10919；Lei et al.,J.Biol.Chem.(1995)270(20):11882-11886)。

以下，將氨基酸殘基按可取代的殘基分類舉例，但可取代的氨基酸 殘基不限于以下記載的殘基：

A組：亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基甘氨酸及環(huán)己基丙氨酸；

B組：天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸；

C組：天冬酰胺及谷氨酰胺；

D組：賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸即2,3-二氨基丙酸；

E組：脯氨酸、3-羥基脯氨酸及4-羥基脯氨酸；

F組：絲氨酸、蘇氨酸及高絲氨酸；

G組：苯丙氨酸及酪氨酸。

例如，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，位于BM19多肽N端前132位氨基酸中的一個或多個發(fā)生保守性取代基本上不影響脂肪酶活性。

在其他具體的實施方案中，BM19多肽的C端或N端區(qū)域還可以被截短約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多個氨基酸，而仍然具有BM19的脂肪酶活性。

在另外的實施方案中，還可以在BM19多肽的C端或N端區(qū)域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多個氨基酸，得到的BM19變體仍具有脂肪酶催化活性。

此外，還可以在BM19多肽的C端或N端以外的區(qū)域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多個氨基酸，只要改變后的多肽基本上保持BM19的脂肪酶活性。

在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽，例如BM19多肽或其變體與異源多肽融合。在一些實施方案中，BM19融合蛋白基本上保持BM19的脂肪酶活性。在某些實施方案中，異源多肽與BM19多肽的N端連接。在某些實施方案中，異源多肽與BM19多肽的C端連接。在這些實施方案中，異源多肽可以選自純化標簽(例如可以包括但不限于：GST、MBP)、表位標簽(例如可以包括但不限于：Myc、FLAG)、靶向序列、信號肽等。

在具體實施方案中，融合蛋白包含BM19多肽和標簽，所述標簽 與BM19多肽的C-末端或N-末端結(jié)合，通常為肽標簽。所述標簽通常是能夠用于分離和純化所述融合蛋白的肽或氨基酸序列。因此，所述標簽?zāi)軌蚺c一個或多個配體結(jié)合，例如，諸如色譜支持體或高親和力磁珠的親和基質(zhì)的一個或多個配體。所述標簽的實例是能夠以高親和力與鎳(Ni²⁺)柱或鈷(Co²⁺)柱結(jié)合的組氨酸標簽(His-標簽或HT)，例如包含6個組氨酸殘基(His6或H6)的標簽。其他用于分離或純化融合蛋白的示例性標簽包括Arg-標簽，F(xiàn)LAG-標簽，Strep-標簽等。

多核苷酸

本申請?zhí)峁┝司幋a上述多肽的多核苷酸，其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：

(a)核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一個氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在嚴格條件下與a)中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

在某些具體的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼BM19多肽及其功能等同變體。在一實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸與編碼BM19及其功能等同變體的多核苷酸具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸由與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列組成。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成。

本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA，包括單鏈和雙鏈形式的DNA。該術(shù)語通常指至少10個堿基長度的核苷酸多聚形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。

在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含與編碼BM19多肽及其功能等同變體的核苷酸序列在嚴格條件下雜交的核苷酸序列，或者由與編碼BM19多肽及其功能等同變體的核苷酸序列特異性雜交且編碼與BM19多肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列組成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇DNA雜交的嚴格條件。通常較長的探針需要較高的溫度，以便進行適當?shù)耐嘶?，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于當互補鏈處于低于其解鏈溫度的環(huán)境時變性DNA的重退火能力。探針與可雜交序列之間同源性程度越高，所能采用的相對溫度越高。于是，較高的相對溫度往往使反應(yīng)條件更嚴格，而在較低的溫度下，則嚴格度較低。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴格條件的詳細描述，可參閱Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

在某些實施方案中，DNA雜交采用的嚴格條件包括：1)洗滌時采用低離子強度和高溫，例如50℃下的0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；2)雜交時采用甲酰胺等變性劑，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸鈉緩沖液以及750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下過夜雜交，雜交溶液含50％甲酰胺，5x SSC(0.75M氯化鈉，0.075M朽1檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5xDenhardt’s溶液、超聲波處理的鮭魚精子DNA(50.mu.g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中于42℃洗滌10分鐘，再以含有EDTA的0.1x SSC于55℃進行高嚴格度洗滌。中等嚴格條件可按Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,NewYork：Cold Spring Harbor Press,1989中的描述加以確定。中等嚴格條件包括采用嚴格度低于以上描述的洗滌溶液和雜交條件(如溫度、離子強度和SDS百分比)。例如，中等嚴格條件包括用至少約16％v/v到至少約30％v/v的甲酰胺和至少約0.5M到至少約0.9M的鹽在42℃雜交，以及用至少約0.1M到至少約0.2M鹽在55℃洗滌。中等嚴格條件還可以包括用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS在65℃雜交，以及用(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 47.2)、5％SDS在60-65℃洗滌。專業(yè)人員將會根據(jù)探針長度等因素調(diào)節(jié)溫度、離子強度等。雜交核酸時的嚴格度取決于核酸分子長度和互補程度，以及其它本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的變量。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性越大，則含有這些序列的核酸雜合體的Tm越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高的Tm)以下列順序遞減：RNA:RNA、DNA:RNA,DNA:DNA。優(yōu)選地，可雜交核酸的最低長度至少約為12個核苷酸，優(yōu)選至少約為16個、更優(yōu)選至少約為24個、最優(yōu)選至少約為36個核苷酸。

本發(fā)明的多核苷酸可以與其他DNA序列組合，所述其他DNA序列例如啟動子、聚腺苷化信號、其他限制性酶切位點、多克隆位點、其他編碼節(jié)段等，使得它們的總長度可以顯著不同。因此考慮可以利用幾乎任意長度的多核苷酸片段；總長度優(yōu)選地受預(yù)期重組DNA方案中制備和使用的便利性的限制。

可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的多種成熟技術(shù)中的任何一種來制備、操控和/或表達多核苷酸及其融合物。例如，編碼本發(fā)明的多肽或其變體的多核苷酸序列可以用于重組DNA分子中以指導(dǎo)多肽在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_。由于遺傳密碼子固有的簡并性，編碼基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可以用于本發(fā)明中，并且這些序列可以用于克隆和表達給定的多肽。

在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸通過人工合成產(chǎn)生，例如直接的化學(xué)合成或酶合成。在可選的實施方案中，上述多核苷酸通過重組技術(shù)產(chǎn)生。

在某些實施方案中，可以通過常規(guī)方法優(yōu)選如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)測定所獲得的多核苷酸的序列。這類多核苷酸序列測定也可用購買的測序試劑盒來完成。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。

表達載體

本申請?zhí)峁┝税景l(fā)明的多核苷酸的表達載體。

本發(fā)明所述的“表達載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允許特定的核酸在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的特異性核酸元件。本發(fā)明的表達載體可以是諸如pCold-TF、pET-24a(+)、pIRES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的質(zhì)粒載體，或者是諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體的病毒載體，或者是本領(lǐng)域熟知的其它載體。

在某些實施方案中，編碼BM19多肽及其變體的多核苷酸序列被克隆到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。

在優(yōu)選的實施方案中，用于克隆多核苷酸的表達載體為質(zhì)粒載體。在更優(yōu)選的實施方案中，所述質(zhì)粒載體為pCold-TF。

在具體的實施方案中，上述表達載體還包含調(diào)節(jié)多核苷酸表達的調(diào)控序列，其中所述多核苷酸與所述調(diào)控序列可操作地連接。

本文所用的術(shù)語“調(diào)控序列”是指實現(xiàn)與其連接的編碼序列表達所需的多核苷酸序列。這類調(diào)控序列的性質(zhì)隨宿主生物而改變。在原核生物中，這類調(diào)控序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和終止子；在真核生物中，這類調(diào)控序列一般包括啟動子、終止子以及在某些情況下的增強子。因此，術(shù)語“調(diào)控序列”包括其存在對目的基因的表達是必需的最低限度的所有序列，也可以包括其存在對目的基因表達是有利的其它序列，例如前導(dǎo)序列。

本文所用的術(shù)語“可操作地連接”是指如下情形：所涉及到的序列處于允許它們以希望的方式起作用的關(guān)系之中。因此，例如“可操作地連接”到一編碼序列的調(diào)控序列使得在與所述調(diào)控序列相容的條件下實現(xiàn)該編碼序列的表達。

在某些實施方案中，利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含編碼BM19多肽及其變體的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。核苷酸序列可操作地連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性實例包括：大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括 CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。實例包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。

此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。

宿主細胞

本申請?zhí)峁┝税景l(fā)明的多核苷酸或表達載體的宿主細胞。

在某些實施方案中，將編碼BM19多肽及其變體的多核苷酸或含有該多核苷酸的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞，獲得含有該多核苷酸或表達載體的基因工程化宿主細胞。

本文所用的宿主細胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一種宿主細胞，包括原核細胞、真核細胞，例如細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞等。示例性的細菌細胞包括埃希氏菌屬、桿菌屬、鏈霉菌屬、沙門氏菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬中的任何種，包括例如大腸桿菌、乳酸球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、熒光假單胞菌。示例性的真菌細胞包括曲霉屬的任何種。示例性的酵母細胞包括畢赤酵母屬、啤酒酵母菌屬、裂殖酵母屬或酵母菌屬中的任何種，包括畢赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的昆蟲細胞包括斜紋夜蛾或果蠅中的任何種，包括果蠅S2和斜紋夜蛾Sf9。示例性的動物細胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人細胞系。選擇合適的宿主在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

可以利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)將表達載體導(dǎo)入宿主細胞中，包括 轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、病毒感染、基因槍或Ti-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。具體的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔等(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。作為示例，當宿主為原核生物如大腸桿菌時，可在指數(shù)生長期后收獲感受態(tài)細胞，用本領(lǐng)域熟知的CaCl₂法進行轉(zhuǎn)化。

在具體的實施方案中，本發(fā)明所用的宿主細胞為大腸桿菌。在優(yōu)選的實施方案中，將攜帶本發(fā)明多核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達。

本申請的多肽或脂肪酶的制備方法

本申請的多肽可以通過本領(lǐng)域人員已知的任何合適的方法制備，例如通過重組技術(shù)產(chǎn)生，或者化學(xué)合成。肽的化學(xué)合成方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如，可以通過使用固相技術(shù)的定向肽合成來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其變體(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))?？梢杂檬謩踊蛲ㄟ^自動化來進行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成儀(Perkin Elmer)實現(xiàn)自動化合成。可選擇地，不同的片度可以分別通過化學(xué)方式合成并利用化學(xué)方法進行組合以制備所需的分子。

在具體的實施方案中，提供了制備本申請的多肽或脂肪酶的方法，其包括：

1)將編碼上述多肽的多核苷酸克隆在表達載體上，

2)將表達載體導(dǎo)入至合適的宿主細胞中，

3)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)宿主細胞，以及

4)從所述宿主細胞或培養(yǎng)基中分離并純化所述多肽。

合適的宿主細胞是指適于表達載體或目的多核苷酸表達的宿主細胞。合適的培養(yǎng)基指適于宿主細胞生長或?qū)ζ溥M行誘導(dǎo)表達的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，根據(jù)所用的宿主細胞，可以選擇各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，工程化的宿主細胞可以在被修飾適于激活啟動子的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以篩選轉(zhuǎn)化子或擴增本申請的多核苷酸。轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞并當宿主細胞生 長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間，以允許其生產(chǎn)目的多肽或其片段。

在某些實施方案中，通過離心收獲宿主細胞，通過物理或化學(xué)方法破碎細胞，并且將得到的粗提物保留用于進一步純化。用于蛋白表達的微生物細胞可以通過任何便利的方法進行破碎，包括凍融循環(huán)、超聲、機械破碎或使用細胞裂解劑。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

在某些實施方案中，宿主細胞生產(chǎn)的重組多肽可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。例如，表達的多肽或其片段可以通過本領(lǐng)域熟知的以下方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化：常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。作為示例性說明，在C-末端或N-末端包含肽標簽(例如His-標簽等)的蛋白的親和色譜法純化是用于獲得高純度多肽制劑的常規(guī)方法。

在優(yōu)選的實施方案中，提供了制備由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的多肽的方法，其包括：將由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸克隆在表達載體pCold-TF中，以及將帶有該多核苷酸序列的pCold-TF轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達，然后從大腸桿菌BL21(DE3)中分離并純化BM19多肽。

具有脂肪酶活性的多肽的應(yīng)用

本申請的多肽是具有脂肪酶活性的多肽，能夠催化油脂的水解，特別是催化乳脂肪的水解。更具體地，本發(fā)明的多肽能夠水解脂肪酸和甘油羥基之間的酯鍵。

本申請?zhí)峁┝松鲜龆嚯?、多核苷酸、表達載體或宿主細胞在制備脂肪酶中的用途。

本申請還提供了上述多肽或脂肪酶、多核苷酸、表達載體或宿主細胞在制造食品中的用途。例如，在乳品加工方面，應(yīng)用脂肪酶在乳品中進行乳脂水解，可增強干酪、奶粉、奶油的風(fēng)味，促進干酪的成熟， 改善乳制品的品質(zhì)。在面食加工方面，添加脂肪酶，使面食彈性提高，改善食感，提高面包等的保鮮能力。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本申請的多肽為具有短鏈專一性的脂肪酶，能夠用于產(chǎn)生和/或強化乳制品的香味，因此可以應(yīng)用在乳酪制造中。

本申請還提供了利用上述多肽或脂肪酶、多核苷酸、表達載體或宿主細胞制造的食品，例如乳制品和面食。

在本申請的上下文中，“乳制品”是指任何種類的基于乳的制品，包括但不限于乳酪、黃油、奶油、乳制品類似物等。“面食”則指主要由面粉制作的食品。

在本發(fā)明的一些實施方案中，本申請的多肽能用于水解中鏈脂肪酸，例如在在油化生產(chǎn)中水解中鏈脂肪酸。

本說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意圖排除其他部分、添加物、組分、或步驟。

應(yīng)該理解，在本申請的特定方面、實施方案或?qū)嵤├忻枋龅奶卣?、特性、組分或步驟，可適用于本文所描述的任何其他的方面、實施方案或?qū)嵤├?，并可以根?jù)需要進行任意地組合和刪減，除非與之矛盾。

上述公開內(nèi)容總體上描述了本申請的實施方案，通過下面的實施例進一步示例本申請的實施方案。描述這些實施例僅為說明本申請的實施方案，而不是限制本申請的實施方案的范圍。盡管本文中使用了特殊的術(shù)語和值，這些術(shù)語和值同樣被理解為示例性的，并不限定本申請公開的范圍。

實施例

實施例1：BM19多肽的表達和純化

SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列(其編碼序列如SEQ ID No.:1所示的多肽)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并被該公司克隆在表達載體pCold-TF上。

將帶有上述核苷酸序列的pCold-TF轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達(具體參見，分子克隆實驗指南第三版，科學(xué)出版社2002[美]J.薩姆布魯克，D.W拉塞爾著,黃培堂等譯)，轉(zhuǎn)化條件如下: 42℃下熱激50秒，冰浴2分鐘，涂LB平板，挑取轉(zhuǎn)化子接種在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化鈉10g/L)中，于37℃進行過夜種子培養(yǎng)，按1％的接種量，將種子培養(yǎng)液接種到表達培養(yǎng)基中，于37℃、220rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8。

冷卻至16℃后，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0.1mM進行誘導(dǎo)，于16℃、190rpm過夜表達。誘導(dǎo)表達結(jié)束后，離心收集菌體。用裂解緩沖液(50mM磷酸二氫鈉、300mM氯化鈉、10mM咪唑，pH8)重懸菌體，其中每克細胞加5毫升裂解緩沖液。

將重懸的菌體進行低溫超聲破碎細胞(50％電壓輸出，2秒超聲破碎，9秒間隔，共超聲20分鐘)，操作時將樣品冰浴冷卻以保護蛋白。細胞破碎后，以14000rpm離心20分鐘并收集上清。

將所得上清中加入樣品緩沖液，100℃水浴10分鐘后，進行凝膠電泳(10％SDS-PAGE,100V,2小時)，結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果顯示，有誘導(dǎo)出的目標條帶，所得溶液為純化的BM19蛋白溶液。

實施例2：脂肪酶BM19的酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶活力的測定方法

采用比色法測定脂肪酶活力。以對硝基苯丁酸酯(pNPB)為底物，以單位體積的酶液在單位時間內(nèi)酶解產(chǎn)生對硝基苯酚(pNP)的生成量進行酶活力的計算。具體方法如下：預(yù)先配置底物和緩沖液，底物：6mg/mL pNPB(異丙醇溶解)，緩沖液：0.05M Tris(pH8.0，0.1％阿拉伯膠)。將底物和緩沖液以1:9(v/v)配成反應(yīng)混合液。取兩個2mL離心管，分別為對照管和樣品管。分別添加400uL反應(yīng)混合液至兩離心管，在合適的反應(yīng)溫度(例如35℃)預(yù)溫浴5min。向樣品管中加入一定量的稀釋酶液，混合均勻后，繼續(xù)溫浴15min。加入1.5mL乙醇至上述兩離心管終止反應(yīng)，并添加同樣量的稀釋酶液至對照管。12000rpm離心2min，取上清，測405nm處的吸光值。

酶活力單位定義為：1個單位即指在標準實驗條件下每分鐘催化釋放1μmol的pNP所需的酶量。根據(jù)標準曲線所得酶活計算公式為：A＝-([A1-A0]×0.7885-0.0118)×V1×n/(V2×t)。A：樣品酶活(U/mL)， A1：樣品酶液的OD405，A0：對照酶液的OD405，V1：總反應(yīng)液的體積(mL)，n：酶液的稀釋倍數(shù)，V2：酶液的體積(mL)，t：反應(yīng)時間(min)。

實施例2-1、底物專一性

配制6mg/mL 4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPO)、4-硝基苯基月桂酸酯(pNPD)和4-硝基苯基棕櫚酸酯(pNPP)，其中，pNPP用異丙醇溶解，PNPB、pNPO、pNPD使用異丙醇溶解，按照上述標準pNPB法(更換為相應(yīng)底物)檢測脂肪酶的活力，以酶活測定最高的底物所測得的酶活力為100％，計算水解其他底物的相對酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，BM19只能水解pNPO，水解酶活為0.0246U/ml。這說明BM19的酯水解活性對中短鏈脂肪酸是特異性的，具有底物專一性。

這表明，本申請具有脂肪酶活性的多肽適合用于乳制品例如乳酪的生產(chǎn)，以及應(yīng)用在油化中水解中鏈脂肪酸。

實施例2-2、最適作用溫度

在不同的溫度(25-65℃)下按照pNPB法(更換底物為pNPO)，測定脂肪酶活力，以測定酶活最高時的酶活力為100％，計算其他溫度下的相對酶活(％)，結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)圖3結(jié)果，BM19的酶學(xué)活力隨著溫度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在40-55℃下具有較好的酶活，其中50℃酶活最高，酶活為0.029818U/ml為其最適作用溫度。

實施例2-3、最適作用pH

將酶液分別在不同pH(3.0-9.0)的緩沖液(其中pH3.0-6.0為50mM MES緩沖液，pH6.5-9.0為50mM TrisHCl緩沖液)中，50℃下按pNPB法(更換底物為pNPO)測定脂肪酶活力，以測定活力最高時的酶活力(0.038857U/ml)為100％，計算其他pH下酶的相對活力(％)，結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)圖4結(jié)果，BM19的酶活力隨著pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中pH8時酶活最高，因此，BM19的最適pH是8。由此推斷，本發(fā)明所述脂肪酶為堿性脂肪酶。

實施例2-4、金屬離子對脂肪酶活力的影響

配制ZnSO₄、MnCl₂、CoCl₂、CaCl₂、MgSO₄、CuSO₄、KCl、(NH₄)₂SO₄、NaCl、NiSO₄、FeCl₃，檸檬酸鈉和EDTA等無機鹽貯存液。按照pNPB(更換底物為pNPO)方法，首先配制反應(yīng)混合液，向每個反應(yīng)管中分裝400uL混合液，并添加無機鹽貯存液至終濃度為5mmol/L，再按照標準方法測定活性。以添加水測定的脂肪酶活力(酶活為0.02565U/ml)為對照(記為100％)，計算其他各組的相對活力，結(jié)果如圖5所述。

根據(jù)圖5結(jié)果，在MnCl₂、CaCl₂、MgSO₄、KCl、(NH₄)₂SO₄、NaCl、NiSO₄儲存液中，脂肪酶酶活保持較好，但在ZnSO₄儲存液中，脂肪酶酶活完全失去。

實施例2-6、表面活性劑對于脂肪酶活力的影響

配置10％的陽離子表面活性CTAB、陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100等貯存液。按照pNPB(更換底物為pNPO)標準方法，同時在反應(yīng)體系中分別添加終濃度為0.5％的上述表面活性劑，測定脂肪酶活力，并以添加水測定的脂肪酶活力(0.02565U/ml)為對照(記為100％)，計算其他各組的相對活力，結(jié)果圖6所示。

根據(jù)圖6結(jié)果，酶在CTAB中完全失活，在其他表面活性劑下有不同程度降低。

可以理解，盡管本申請以某種形式被說明，但本申請并不局限于本說明書中所顯示和描述的內(nèi)容。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本申請的范圍的前提下還可做出各種變化。這些變化都在本申請要求保護的范圍內(nèi)。