一種脂肪酶lipase6及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶LIPASE6及其編碼基 因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性化合物雖然原子組成是一樣的，但它們的立體結(jié)構(gòu)卻互為鏡像，在生物學(xué)和 藥學(xué)性質(zhì)上卻相差甚遠(yuǎn)。比如L-薄荷醇具有清涼味，而D-薄荷醇則發(fā)霉味；S-天冬酰胺 是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的"反應(yīng)停"是孕婦用鎮(zhèn)痛藥和止痛藥，而S型的"反應(yīng)停" 對(duì)胎兒則有致畸作用，歷史上曾出現(xiàn)使用反應(yīng)停導(dǎo)致大規(guī)模新生兒畸形的事件?？梢姾铣?手性藥物過程中，前體原料的光學(xué)純度是重要環(huán)節(jié)。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化學(xué)法，即利用對(duì)映體的物理和化學(xué)性質(zhì)的差異 進(jìn)行分離。通常有鹽析法、包結(jié)法、以及組合拆分。其缺點(diǎn)是要求對(duì)映體之間的性質(zhì)差異要 大，適用的化合物不多。（2)合成法，通過設(shè)計(jì)反應(yīng)來進(jìn)行手性化合物的化學(xué)合成。這種方 法缺點(diǎn)在于反應(yīng)過程通常比較劇烈，耗費(fèi)能量，而且反應(yīng)中使用大量有毒的有機(jī)溶劑。（3) 色譜拆分，這種方法是利用填料對(duì)手性對(duì)映體吸附性質(zhì)的差異來實(shí)現(xiàn)，其缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴， 普及性較差。
[0004]脂肪酶（Lipase，EC 3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一類能夠?qū)⑷８视退?解為甘油和脂肪酸的酶，其來源非常廣泛，微生物、植物和動(dòng)物中都有存在。脂肪酶作為生 物催化劑多數(shù)可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立體選擇性高，不需要輔助因子， 是一種重要的手性催化劑。
[0005] 1-苯乙醇是精細(xì)化工利用中重要的骨架和中間體，在化妝品行業(yè)的香料，染料和 醫(yī)藥行業(yè)中都有較大的應(yīng)用范圍。R和S兩種對(duì)映異構(gòu)體各有各自的應(yīng)用，R-1-苯乙醇主要 用于化妝品行業(yè)中，還可應(yīng)用于變色染料、眼科防腐劑、膽固醇腸道吸收抑制劑等；S-1-苯 乙醇主要是藥物合成的前體，如左旋咪唑、（S)-異丙腎上腺素、抗抑郁藥物取舍林等。
[0006] 但是，大多數(shù)在工業(yè)中應(yīng)用的脂肪酶都是源于進(jìn)口，比如Novo Nordisk公司的 月旨肪酉每Novozym 435(來自Candida antarctica)，Amano Pharmaceutical公司的Lipase PS(來自Burkhold eriacepacia)，F(xiàn)luka公司的Lipase A(來自Candida antarctica)等 等。這些脂肪酶價(jià)格昂貴，生產(chǎn)技術(shù)受到制約，因此開發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)的脂肪酶十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中脂肪酶價(jià)格昂貴、生產(chǎn)技術(shù)受到制約的不足，提供一種 新的脂肪酶LIPASE6及其編碼基因和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明從一株海洋放線菌（Marinactinospora thermotolerans)中開發(fā)了一種新 的脂肪酶LIPASE6及其編碼基因lipase6,構(gòu)建了含有l(wèi)ipase6的重組表達(dá)載體和基因工程 菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得脂肪酶LIPASE6,其可應(yīng)用于制備手性1-苯乙醇。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種脂肪酶LIPASE6,其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2的 第45-297位氨基酸序列所示。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因 lipase6〇
[0011] 優(yōu)選，所述的脂肪酶基因lipase6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第133-894位 堿基所示。
[0012] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipase6的重組表達(dá)載體。所述的表達(dá) 載體，優(yōu)選pET28a(+)載體。
[0013] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipase6的基因工程菌。所述的基因工 程菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的脂肪酶LIPASE6在制備手性1-苯乙醇中的應(yīng) 用。
[0015] 優(yōu)選，脂肪酶LIPASE6在拆分（±)-1_苯乙醇制備得到（R)-1-苯乙醇中的應(yīng)用。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選，其步驟為：取脂肪酶LIPASE6于反應(yīng)介質(zhì)中，再加入（±)_1_苯乙醇 和?；w，進(jìn)行反應(yīng)，得到（R)-1-苯乙醇。
[0017] 所述的反應(yīng)介質(zhì)，優(yōu)選為1，4-二氧六環(huán)、四氫呋喃、叔丁醇、異丙醇、二氯甲烷、甲 苯、環(huán)己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。
[0018] 所述的?；w，優(yōu)選為乙酰乙烯酯、乙酸異丙烯酯、丁酸酐、丁酸、戊酸、葵酸和 乙酸乙酯中的一種。
[0019] 優(yōu)選，脂肪酶LIPASE6在水解乙酸蘇合香酯制備得到（S)-1-苯乙醇中的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選，其步驟為：取脂肪酶LIPASE6于pH為6. 0-9. 5的緩沖液中，加入乙酸 蘇合香酯及其助溶劑，進(jìn)行反應(yīng)，得到（s)-i-苯乙醇。
[0021] 所述的助溶劑，優(yōu)選為1，4-二氧六環(huán)、四氫呋喃、叔丁醇、異丙醇、二氯甲烷、甲 苯、環(huán)己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。
[0022] 所述的緩沖液，優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉、磷酸緩沖液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH溶液 中的一種。
[0023] 本發(fā)明的脂肪酶基因lipase6來自深海樣品中篩選得到的一株海洋放線菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn)室。本發(fā)明 用生物信息學(xué)分析的方法，從基因組測(cè)序的放線菌（M. thermotolerans)中得到脂肪酶基 因lipase6,全長(zhǎng)為894bp (從起始密碼子到終止密碼子），編碼297個(gè)氨基酸，該基因是一 個(gè)全新的脂肪酶基因，與其它脂肪酶基因序列的最大相似度為57 %。經(jīng)分析序列中包含44 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，成熟的脂肪酶LIPASE6由253個(gè)氨基酸殘基組成。通過克隆編碼成 熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6并將其連接表達(dá)載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 (DE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組表達(dá)的脂肪酶LIPASE6。脂肪酶LIPASE6可 用于制備手性1-苯乙醇，利用重組表達(dá)的脂肪酶LIPASE6作為催化劑，制備得到了光學(xué)純 度可達(dá)99 %的（R)-1-苯乙醇（得率達(dá)85 % )和光學(xué)純度可達(dá)90 %的（S)-1-苯乙醇（得 率達(dá)65% )。脂肪酶LIPASE6在生物化工和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0024] 圖1是不同側(cè)鏈長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酚酯對(duì)脂肪酶LIPASE6酶活的影響。
[0025] 圖2是脂肪酶LIPASE6的最適pH及pH穩(wěn)定性。其中，a為最適pH曲線圖，b為 pH穩(wěn)定性曲線圖。
[0026] 圖3是脂肪酶LIPASE6的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性。其中，a為最適反應(yīng)溫度 曲線圖，b為溫度穩(wěn)定性曲線圖。
[0027] 圖4是脂肪酶LIPASE6拆分（±)_1_苯乙醇反應(yīng)產(chǎn)物GC圖。其中，a是標(biāo)樣GC 圖，按照保留時(shí)間依次為：1，內(nèi)標(biāo)十二烷；2,（S)-乙酸蘇合香酯；3,（R)-乙酸蘇合香酯；4， (R)-1-苯乙醇；5,（S)-1-苯乙醇；b是脂肪酶LIPASE6拆分（±)-1_苯乙醇反應(yīng)36h后的 GC圖；c是脂肪酶LIPASE6水解消旋乙酸蘇合香酯反應(yīng)24h后的GC圖。
[0028] 圖5是脂肪酶LIPASE6的蛋白表達(dá)純化情況。其中，M為蛋白Marker，1為未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的含有pET-28a(+)-lipase6的大腸桿菌BL21(DE3)，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有 pET-28a(+)-lipase6的大腸桿菌BL21 (DE3)，3為Ni柱純化后得到的脂肪酶LIPASE6。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0030] 下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照所用產(chǎn)品生 產(chǎn)廠商的使用說明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑 得到。
[0031] 本發(fā)明的脂肪酶基因lipase6來自深海樣品中篩選得到的一株海洋放線菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn)室。
[0032] 實(shí)施例1:脂肪酶基因lipase6引物設(shè)計(jì)及開放閱讀框邊界確定
[0033] 提取海洋放線菌（M. thermotolerans)的基因組DNA，經(jīng)16S rRNA驗(yàn)證無誤后，交 至上海美吉生物科技有限公司測(cè)序。利用生物信息學(xué)手段對(duì)基因組進(jìn)行注釋，分析其中的 脂肪酶基因，確定了其中脂肪酶基因lipase6的開放閱讀框，其