一種檢測脂肪酶酶活的熒光法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，具體涉及一種使用天然物質(zhì)姜黃素作為熒光信號元件，吐溫既作為脂肪酶的底物又作為包裹信號分子姜黃素的載體的檢測脂肪酶酶活的化學熒光法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(三?；视王ニ饷福珽C3.1.1.3)是作用于羧酸酯鍵的一類水解酶，它能夠在非水介質(zhì)中催化酯化，酯交換和酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。這種多功能的化學發(fā)應(yīng)特點，它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品，洗滌劑，制藥，皮革，紡織，化妝品和造紙等諸多工業(yè)領(lǐng)域。隨著脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，因而建立一種成本低、操作簡單、方便快捷的檢測脂肪酶酶活的方法顯得尤為重要。
[0003]目前，采用熒光法來檢測脂肪酶酶活的有很多，其中最為常用的方法是利用三?；视皖愃莆镄揎椛弦粋€熒光分子芘和猝滅劑和4-甲基傘形酮庚酯作為脂肪酶的熒光底物進行檢測。前者的缺點在于三酰基甘油類似物修飾上一個熒光分子芘會引起某些脂肪酶差的水解性，這樣就會導致檢測出的酶活不準確；后者的缺點在于該底物需要乳化，乳化劑的加入會影響酶活的測定，且都受到pH范圍的限制。因此，這兩種方法都不能廣泛地作為檢測脂肪酶標準的試驗方法。
[0004]姜黃素是一種具有熒光的天然物質(zhì)，一般都應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，很少利用到它的熒光特性來檢測目標物，更別說來檢測脂肪酶酶活。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)未公開基于吐溫包裹姜黃素的熒光法來檢測脂肪酶酶活的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基于吐溫包裹姜黃素的熒光法來檢測脂肪酶的簡單、廉價和有效的分析法。此方法利用天然物質(zhì)姜黃素具有熒光的特點，將姜黃素作為熒光信號元件，同時吐溫既作為脂肪酶的底物又作為包裹信號分子姜黃素的載體。
[0007]本發(fā)明在解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:
[0008]一種檢測脂肪酶酶活的熒光法，具體包括如下步驟:
[0009](I)分別向2mL A、B離心管中加入吐溫溶液；
[0010](2)向步驟(I)中得到的A、B離心管溶液中加入由甲醇溶液配制的姜黃素溶液進行包裹；
[0011](3)向步驟(2)中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調(diào)節(jié)；后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，B離心管中的吐溫溶液的膠束結(jié)構(gòu)被脂肪酶水解，姜黃素暴露在緩沖溶液當中發(fā)生降解，檢測A、B離心管溶液的熒光光譜，得到不同時間對應(yīng)的熒光光譜，然后以熒光強度的差值A(chǔ)F5tl5作為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線。
[0012]本發(fā)明所述的方法，所述步驟(I)中加入吐溫溶液的最終濃度為0.05-0.35mmol/L，吐溫溶液的最終濃度為0.3mmol/L。
[0013]其中，所述步驟(2)中由甲醇溶液配制的姜黃素溶液的最終濃度為5-40ymol/L，優(yōu)選 25ymol/L。
[0014]其中，所述步驟(3)中的緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖溶液，該緩沖溶液的濃度及具體用量為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解和掌握，具體以最終形成吐溫包裹姜黃素溶液PH值調(diào)至7-9為準，優(yōu)選7.4。
[0015]其中，所述步驟(3)中待測脂肪酶溶液反應(yīng)溫度為30_50°C，優(yōu)選37°C ;待測脂肪酶酶溶液的加入量為0.25-5mg/mL，優(yōu)選2mg/mL。
[0016]更具體地，本發(fā)明所述的一種檢測脂肪酶酶活的熒光法，包括如下步驟:
[0017](I)分別向2mLA、B離心管中加入吐溫溶液的最終濃度為0.05-0.35mmol/L ；
[0018](2)向步驟(I)中得到的A、B離心管溶液中加入由甲醇溶液配制的姜黃素溶液的最終濃度為5-40 μ mo I/L進行包裹；
[0019](3)向步驟⑵中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調(diào)節(jié)，將pH值調(diào)至7-9 ;后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度至30-50°C，B離心管中的吐溫溶液的膠束結(jié)構(gòu)被脂肪酶水解，姜黃素暴露在緩沖溶液當中發(fā)生降解，檢測A、B離心管溶液的熒光光譜，得到不同時間對應(yīng)的熒光光譜，然后以熒光強度的差值A(chǔ)F5tl5作為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線。
[0020]本發(fā)明利用天然物質(zhì)姜黃素具有熒光的特點，將姜黃素作為熒光信號元件，同時吐溫既作為脂肪酶的底物又作為包裹信號分子姜黃素的載體。在不存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液仍然保持它的原始膠束結(jié)構(gòu)，所以姜黃素溶液依然存在于吐溫溶液膠束結(jié)構(gòu)內(nèi)，保持著它原有的熒光強度；在存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液的膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞，膠束相內(nèi)的姜黃素被釋放出來，暴露在緩沖溶液當中，從而發(fā)生降解，熒光強度減弱，然后進行熒光檢測，兩者熒光強度的差值A(chǔ)F5tl5的變化與脂肪酶酶活有關(guān)，因此能夠用于檢測脂肪酶酶活。
[0021]本發(fā)明所述的技術(shù)方案所運用的吐溫，由于它的溶解性能好，作為脂肪酶的底物就無需加入乳化劑進行乳化，同時又作為信號分子姜黃素包裹的載體。相比之前的熒光法，該發(fā)明的熒光法簡單、快速、有效，可用于實際體系中脂肪酶的檢測，適宜推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022]圖1為(a)吐溫(0.3mmol/L)包裹姜黃素(25 μ mol/L)溶液(無脂肪酶)；(b)吐溫(0.3mmol/L)包裹姜黃素(25 μ mol/L)溶液(有2mg/mL失活脂肪酶)；(c)吐溫(0.3mmol/L)包裹姜黃素(25 μ mol/L)溶液(有2mg/mL脂肪酶)的熒光光譜。
[0023]圖2 為分別為加入脂肪酶(a) Omin ； (b) 2min ； (c) 4min ； (d) 6min ； (e) 8min ；(f) 1min ； (g) 15min ； (h) 20min ； (i) 25min ； (j) 30min ； (k) 35min 后，吐溫(0.3mmol/L)包裹姜黃素(25 μ mol/L)溶液的熒光光譜。
[0024]圖3為脂肪酶酶活的動力學曲線。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026](I)分別向2mL A、B離心管中加入吐溫溶液的最終濃度為0.30mmol/L ；
[0027](2)向步驟(I)中得到的A、B離心管溶液中加入由甲醇溶液配制的姜黃素溶液的最終濃度為25 μ mol/L進行包裹；
[0028](3)向步驟⑵中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調(diào)節(jié)，將pH值調(diào)至7.4 ;后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度至37°C，B離心管中的吐溫溶液的膠束結(jié)構(gòu)被脂肪酶水解，姜黃素暴露在緩沖溶液當中發(fā)生降解，檢測A、B離心管溶液的熒光光譜，得到不同時間對應(yīng)的熒光光譜(見圖2)，然后以熒光強度的差值A(chǔ)F5tl5作為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂