本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種基于spexin的胃癌診斷試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：利用分子生物學(xué)技術(shù)，能夠有效地進(jìn)行分子水平檢測(cè)和診斷，進(jìn)而為早期治療這些疾病提供便利。胃癌(gastriccancer或stomachcancer)在世界上的惡性腫瘤中占第二位，在我國居各類惡性腫瘤之首。因?yàn)槲赴┢鸩‰[匿，發(fā)病早期癥狀不明顯，不易被覺察，使得胃癌早期發(fā)現(xiàn)困難，并且早期診斷率較低。盡管診斷技術(shù)在不斷提高，以手術(shù)治療為主的綜合治療手段越來越豐富，但胃癌仍是全球主要癌癥致死疾病之一，總體療效依然較差。由于以胃鏡為基礎(chǔ)的早期胃癌篩查依賴于檢查者的經(jīng)驗(yàn)，且有一定的創(chuàng)傷風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致其無法推廣。目前臨床上常用的生物大分子腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(cea)，糖蛋白類抗原(ca19-8、ca72-4、ca125)能提高體內(nèi)胃腸道惡性腫瘤的檢出率，但這些標(biāo)志物并不能高靈敏度、高特異性地診斷胃癌。近年來，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展以及基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因的診斷和治療已逐步成為一種新的腫瘤診斷和治療手段。近年來，胃癌的基因診斷和基因治療在基礎(chǔ)研究方面已經(jīng)取得了較明顯的進(jìn)展。腫瘤基因標(biāo)志指基因的異常表達(dá)和本身突變，可反映癌癥發(fā)病前或發(fā)病過程中的相關(guān)變化，因此，敏感性和特異性理想的腫瘤基因作為標(biāo)志物可盡早的發(fā)現(xiàn)腫瘤疾病的發(fā)生，亦可以作為監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展指標(biāo)，在提高腫瘤治愈率方面將有重要意義。人spexin蛋白最早是由mirabeau等人通過markovmodelinganalysis方法從人蛋白組序列中發(fā)現(xiàn)的。人spexin基因(ch12,orf39；～17,333bp)位于染色體12p12.1。研究發(fā)現(xiàn)spexin蛋白參與多種生理功能的調(diào)節(jié)。spexin參與金魚生殖和食欲調(diào)節(jié)，參與嚙齒類動(dòng)物的血管/腎功能和痛覺調(diào)節(jié)，循環(huán)系統(tǒng)spexin的水平與肥胖兒童呈負(fù)相關(guān)。迄今為止，spexin基因或蛋白對(duì)胃癌的作用尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決胃癌檢測(cè)靈敏度低、特異性差的技術(shù)問題，公開了一種基于spexin的胃癌診斷試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種基于spexin的胃癌診斷試劑盒，所述試劑盒包括引物ⅰ、引物ⅱ、引物ⅲ、引物ⅳ、探針引物ⅴ、探針引物ⅵ、試劑ⅰ、試劑ⅱ、試劑ⅲ以及溶液組。所述的spexin指spexin基因、spexin蛋白質(zhì)、spexin多肽及spexin蛋白的功能類似物。所述溶液組包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f、溶液g、溶液h、溶液i、溶液j、溶液k、溶液l、溶液m、溶液n、溶液o、溶液p、溶液q；所述spexin蛋白質(zhì)和spexin多肽均含有如seqidno：5所示的氨基酸序列。所述引物ⅰ的序列如seqidno：1所示，引物ⅱ的序列如seqidno：2所示，引物ⅲ的序列如seqidno：3所示，引物ⅳ的序列如seqidno：4所示，探針引物ⅴ的序列如seqidno：6所示，探針引物ⅵ的序列如seqidno：7所示?；趕pexin的胃癌診斷試劑盒的應(yīng)用，操作步驟如下：(1)從胃組織或血液中抽提總rna；(2)檢測(cè)樣本和對(duì)照中spexin的表達(dá)水平；(3)分別對(duì)樣本和對(duì)照中spexin的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。所述步驟(1)中胃組織為胃癌組織或癌旁組織。所述步驟(2)中，檢測(cè)spexin樣本和對(duì)照中的表達(dá)水平的方法為pcr、逆轉(zhuǎn)錄pcr或?qū)崟r(shí)定量pcr，操作為：將步驟(1)制備的總rna反轉(zhuǎn)錄成的cdna作為模板，以引物ⅰ和引物ⅱ為模板時(shí)的檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照、以引物ⅲ和引物ⅳ為模板時(shí)的檢測(cè)結(jié)果作為樣本。所述步驟(2)中，檢測(cè)spexin樣本和對(duì)照中的表達(dá)水平的方法為northern印跡，其中基因探針為探針引物ⅴ和探針引物ⅵ。本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明提供了一種基于spexin可用于檢測(cè)受試者，是否患有胃癌的診斷試劑盒和該試劑盒的相關(guān)檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)胃癌，具體的，以基因spexin表達(dá)量變化作為胃癌早期診斷標(biāo)志；作為胃癌預(yù)后判斷標(biāo)志以及作為胃癌治療檢測(cè)的輔助標(biāo)志，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，有利于胃癌的診治。(2)本發(fā)明首次公開了spexin與胃癌的相關(guān)性，為以spexin為基礎(chǔ)的臨床診斷提供依據(jù)。附圖說明圖1為正常組與胃癌組spxin基因表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式一種基于spexin的胃癌診斷試劑盒，所述試劑盒包括引物ⅰ、引物ⅱ、引物ⅲ、引物ⅳ、探針引物ⅴ、探針引物ⅵ、試劑ⅰ、試劑ⅱ、試劑ⅲ以及溶液組。所述的spexin指spexin基因、spexin蛋白質(zhì)、spexin多肽及spexin蛋白的功能類似物。所述溶液組包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f、溶液g、溶液h、溶液i、溶液j、溶液k、溶液l、溶液m、溶液n、溶液o、溶液p、溶液q。所述spexin蛋白質(zhì)和spexin多肽均含有如seqidno：5所示的氨基酸序列。所述引物ⅰ的序列如seqidno：1所示，引物ⅱ的序列如seqidno：2所示，引物ⅲ的序列如seqidno：3所示，引物ⅳ的序列如seqidno：4所示，探針引物ⅴ的序列如seqidno：6所示，探針引物ⅵ的序列如seqidno：7所示?；趕pexin的胃癌診斷試劑盒的應(yīng)用，操作步驟如下：(1)從胃組織或血液中抽提總rna；(2)檢測(cè)樣本和對(duì)照中spexin的表達(dá)水平；(3)分別對(duì)樣本和對(duì)照中spexin的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。所述步驟(1)中胃組織為胃癌組織或癌旁組織。所述步驟(2)中，檢測(cè)spexin樣本和對(duì)照中的表達(dá)水平的方法為pcr、逆轉(zhuǎn)錄pcr或?qū)崟r(shí)定量pcr，操作為：將步驟(1)制備的總rna反轉(zhuǎn)錄成的cdna作為模板，以引物ⅰ和引物ⅱ為模板時(shí)的檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照、以引物ⅲ和引物ⅳ為模板時(shí)的檢測(cè)結(jié)果作為樣本。所述步驟(2)中，檢測(cè)spexin樣本和對(duì)照中的表達(dá)水平的方法為northern印跡，其中基因探針為探針引物ⅴ和探針引物ⅵ。本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1基于spexin基因的檢測(cè)胃癌患者診斷試劑盒的制備(100次反應(yīng))根據(jù)spexin基因的表達(dá)豐度與胃癌的相關(guān)性，可以通過檢測(cè)spexin基因的表達(dá)水平作為胃癌診斷的輔助指標(biāo)?；诖?，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)spexin基因表達(dá)的胃癌診斷試劑盒，該診斷試劑盒的主要組分包括：擴(kuò)增spexin基因和beta-actin基因的引物對(duì)、sybrgreenpcr反應(yīng)體系。擴(kuò)增spexin基因引物對(duì)：正向引物序列，如seqno：3所示；反向引物序列，如seqno：4所示；擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為306bp。擴(kuò)增beta-actin基因引物對(duì)：正向引物序列，如seqno：1所示；反向引物序列，如seqno：2所示；擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為434bp。探針引物序列，如seqno：7和seqno：8所示。實(shí)時(shí)定量pcr診斷法還包含溶液(a至g)；northern印跡診斷法包含溶液(h至r)和試劑(ⅰ至ⅲ)。本試劑盒所包含的試劑及其含量如表1所示：表1.基于spexin基因的檢測(cè)胃癌患者診斷試劑盒成分實(shí)施例2胃癌組織中spexinmrna的檢測(cè)(實(shí)時(shí)定量pcr)(1)胃癌組織的收集與保存：收集河南大學(xué)淮河醫(yī)院科2013-2015年間胃癌病人標(biāo)本，胃癌組織及癌旁組織數(shù)對(duì)，分別置于1.5ml的rnase/dnase-free離心管中，經(jīng)液氮桶轉(zhuǎn)移至–80℃低溫冰箱保存。(2)胃癌組織rna的提取：常規(guī)方法提取受試者待測(cè)組織mrna。[sambrookj,薩姆布魯克,russelldw,etal.,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.2002:科學(xué)出版社.]，具體地：①取胃癌和癌旁組織(約50mg)，加入溶液a1000μl，組織破碎，室溫放置5min；②每管(1.5mlpe管滅菌)加入100μl的溶液b(trireagent體積的1/10)，渦旋混勻15sec；③室溫放置8min后，4℃下12000g離心15min；④取上清，加入等體積的溶液c，顛倒混勻10余次，室溫靜置10min，4℃下12000g離心10min；⑤吸除上清后，加入1ml溶液d，輕吹懸浮清洗rna，4℃下7500g離心5min，洗兩遍；⑥吸除上清液后，置于超凈工作臺(tái)中干燥5min左右；⑦加入適量溶液e(20～50μl)溶解rna，置于55℃水浴10min，轉(zhuǎn)彈管壁，點(diǎn)離。⑧用nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量rna純度及濃度，確保od260/280比值在1.8-2.0之間，貯存—80℃?zhèn)溆谩?3)逆轉(zhuǎn)錄得到cdna：取2μg總rna作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，采用25μl反應(yīng)體系，在pcr管中加入溶液f和2μg總rna，用溶液e使之補(bǔ)齊至25μl。將上述反轉(zhuǎn)錄體系置于pcr儀中，42℃延伸1.5h，95℃5min滅火反轉(zhuǎn)錄酶，得到cdna在–20℃條件下保存。(4)實(shí)時(shí)定量pcr：采用20μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證結(jié)果的可靠性。所有反應(yīng)體系均在abi7500熒光定量pcr儀上進(jìn)行。外參基因反應(yīng)體系：spexin基因反應(yīng)體系：操作時(shí)，保證所有試劑都在冰上操作，按照上述反應(yīng)體系用移液槍將pcr反應(yīng)液加入到pcr管中，封蓋后，放入abi7500熒光定量pcr儀中進(jìn)行擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序設(shè)定如下：其中，從步驟2至步驟4持續(xù)40個(gè)循環(huán)。(5)數(shù)據(jù)分析：以sbyrgreen作為熒光定量標(biāo)記物，通過溶解曲線和電泳確定目的條帶。測(cè)得樣品spexin基因擴(kuò)增的ct值以外參基因的ct值進(jìn)行校正。計(jì)算方法采用2-δδct法。δδct＝(ct1-ct2)-(ct3-ct4)，ct1指胃癌組織樣品spexin基因擴(kuò)增的ct值；ct2指胃癌組織樣品外參基因beta-actin擴(kuò)增的ct值；ct3指癌旁組織/正常組織樣品spexin基因擴(kuò)增的ct值；ct2指癌旁/正常組織樣品外參基因beta-actin擴(kuò)增的ct值。數(shù)據(jù)利用spss16.0軟件進(jìn)行分析，p<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。表2實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)胃癌組織和正常組織spexinmrna的表達(dá)水平(部分病例)樣品編號(hào)胃癌spexin相對(duì)表達(dá)水平1–0.3722–0.9963–0.8124–0.8525–1.4666–1.5027+0.0768+0.3059+0.99210+0.05611+0.10112+0.114……注：“–”表示正常組織；“+”表示胃癌組織。實(shí)施例3胃癌組織中spexinmrna的檢測(cè)(northern印跡)(1)總rna提取:受試者組織中總rna提取采用trizol方法(詳見實(shí)施例2的操作步驟說明),紫外分光度計(jì)測(cè)定總rna濃度。(2)制備變性膠：取試劑ⅰ0.2g，加入溶液h12.4ml，加熱熔化，加入溶液i4.0ml、溶液j3.6ml，混勻、制膠。膠凝固后，置5倍稀釋的溶液i中預(yù)電泳5min。(3)電泳：取總rna4.5μl(30μg)，加入4.0μl溶液i，3.6μl溶液j，10μl溶液k，65℃溫育15min，冰浴5min。然后加入1μl溶液l，2μl溶液m，上樣，50v電泳，2h。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下，觀察rna的完整性，記錄條帶的位置(離加樣孔的距離)。(4)spexin基因探針制備合成spexin基因探針引物，引物ⅴ序列如seq：7所示；引物ⅵ序列如seq：8所示。應(yīng)用地高辛(dig)進(jìn)行spexin基因探針的標(biāo)記，取1μl胃組織cdna進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)體系20μl，包括17μl溶液n；1μl溶液o；1μl引物ⅴ(10μm)；1μl引物ⅵ(10μm)。pcr反應(yīng)條件：(1)95℃3min；(2)95℃30sec；(3)55℃30sec；(4)72℃1min；(5)72℃5min；其中，從步驟(2)至步驟(4)持續(xù)35個(gè)循環(huán)。所得的產(chǎn)物純化后，取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋5倍后在尼龍膜上點(diǎn)樣，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)探針標(biāo)記效率。(5)northern印跡測(cè)定mrna的表達(dá)①用傳統(tǒng)毛細(xì)管將rna轉(zhuǎn)移至尼龍膜上；②尼龍膜經(jīng)紫外交聯(lián)，80℃固定rna30min；③用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)，加入5ml溶液p預(yù)雜交30min；④將已經(jīng)制備好的spexin基因探針(濃度100ng/ml)加入雜交液(即溶液p)中，68℃雜交過夜，用5ml溶液q洗膜3次，用溶液r封閉；⑤用溶液r按1∶5000的比例稀釋試劑ⅱ，將膜置于稀釋后的抗體溶液中，室溫下孵育30min，加1ml試劑ⅲ；⑥將膜放入暗盒中，用x膠片壓片、顯影，觀察并拍攝，利用圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)spexin的灰度值，以反映spexinmrna水平的變化。結(jié)果表明，胃癌患者組織中spexinmrna相對(duì)表達(dá)量如表2所示。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與正常組相比，胃癌組spxin基因表達(dá)量明顯下調(diào)，表達(dá)水平僅為正常組織的30％；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05，參見圖1。經(jīng)臨床進(jìn)一步驗(yàn)證，該病例確實(shí)患有胃癌，說明，本發(fā)明制備的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)結(jié)果一直。據(jù)此推斷本試劑盒可以區(qū)分病人是否患有胃癌，可為進(jìn)一步臨床治療提供線索和參考指標(biāo)。此可見，spexin基因可作為胃癌診斷的一個(gè)標(biāo)志。以上所述的實(shí)施例和具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做了相近的描述,但這并不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在本發(fā)明的基礎(chǔ)上進(jìn)行的若干改進(jìn)或修改，也在本發(fā)明所要求的權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>河南大學(xué)<120>一種基于spexin基因的胃癌診斷試劑盒及其應(yīng)用<160>7<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1acagagcctcgcctttgc18<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2aggtctcaaacatgatctgggt22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tcctgcaatgaagctccctg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ctctccaacagtctctgcgg20<210>5<211>116<212>prt<213>人（homosapiens）<400>5metlysglyleuargserleualaalathrthrleualaleupheleu151015valphevalpheleuglyasnsersercysalaproglnargleuleu202530gluargargasntrpthrproglnalametleutyrleulysglyala354045glnglyargargpheileseraspglnserargarglysaspleuser505560aspargproleuprogluargargserproasnproglnleuleuthr65707580ileproglualaalathrileleuleualaserleuglnlysserpro859095gluaspgluglulysasnpheaspglnthrargpheleugluaspser100105110leuleuasntrp115<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ccctgtggactcccaaactc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7tctctccaacagtctctgcg20當(dāng)前第1頁12