本申請為分案申請，原申請的申請日為2010年6月10日，申請?zhí)枮?01080035457.6(pct/au2010/000715)，發(fā)明名稱為“制備雜交細胞/嵌合細胞的方法及其應用”。本發(fā)明涉及雜交細胞和用于生產雜交細胞的方法。具體地，本發(fā)明涉及從至少3個細胞的雜交產生的雜交細胞，其中至少2個細胞源自不同的譜系。本發(fā)明另外涉及雜交細胞用于表達蛋白的應用，所述蛋白可用于多種診斷用途、預防用途、治療用途和/或研究用途。
背景技術：
：在本說明書自始至終對現有技術的任何討論，絕不能視作承認：這樣的現有技術是廣泛已知的，或形成本領域的普通一般常識的一部分。多種不同的細胞類型目前被用于表達蛋白，所述蛋白在商業(yè)上與多種診斷用途、預防用途、治療用途和/或研究用途有關。目前，這樣的蛋白的生產常規(guī)地在細胞中進行，所述細胞例如細菌、酵母、真菌、昆蟲和非人哺乳動物細胞。細胞經常以多種翻譯后修飾來修飾蛋白，所述翻譯后修飾包括、但不限于：糖基化、?；?、磷酸化、甲基化、硫酸化、異戊二烯化和脂質化(lipidation)。這些修飾是物種特異性的，且因而，目前用于生產商業(yè)上有關的蛋白的細胞表現出這樣的翻譯后修飾：所述修飾不同于在從人細胞表達的蛋白或在人體中天然存在的蛋白上觀察到的翻譯后修飾。例如，許多用于生產商業(yè)上有關的蛋白的非哺乳動物細胞類型要么缺少糖基化蛋白的能力，要么表現出這樣的糖基化模式：所述模式不同于在人細胞中表達的蛋白所表現出的糖基化模式。甚至在非人哺乳動物表達系統(tǒng)諸如中國倉鼠卵巢(cho)細胞中，確證了與人細胞相比糖基化模式的顯著差異。例如，用于重組蛋白表達的cho細胞系缺乏功能性的(α2,6)唾液酸轉移酶，該酶用于合成在人細胞中存在的(α2,6)-連接的末端唾液酸。此外，在cho-細胞表達的糖蛋白上存在的唾液酸基序易于被cho細胞內源性的唾液酸酶降解(gramer等人biotechnology13(7):692-&,1995)。作為非人表達系統(tǒng)的不同翻譯后修飾譜(repertoires)的結果，由它們表達的蛋白可能表現出不同于人細胞-衍生的蛋白的生理化學特征和藥理學特征，諸如半衰期、免疫原性、穩(wěn)定性和功能性的功效。這可以在很大程度上影響這些蛋白的臨床效用。還有日益增多的證據表明，除了它的物種-依賴性的性質以外，在相同的物種內，翻譯后修飾也可以是組織特異性的，甚至是細胞類型特異性的。這具體地與表現出終末糖基化的蛋白的組織特異性的表達和細胞類型特異性的表達有關(feizinature314:53-54,1985；rademacher等人annurevbiochem57:785-838,1988)。具體地，已經表明，3種唾液酸轉移酶(它們將末端唾液酸附著至糖蛋白糖鏈上)表現出在大鼠的7種組織中顯著不同的表達(paulson等人j.biol.chem.264:10931-10934,1989)。這為相同蛋白的組織特異性的糖基化提供了支持。此外，使用由來自骨髓的小鼠成纖維細胞和小鼠成骨細胞表達的高度磷酸化的糖蛋白(小鼠骨橋蛋白)的兩種同工型的研究，表現出它們的磷酸化程度的主要差異，這與生物活性的差異有關。這些結果提示，由不同的細胞類型生產的骨橋蛋白的功能是不同的(christensen等人jbiol.chem.282(27):19463-19472)。適用于生產表現出全人特征的生物制品的有效的細胞系統(tǒng)理想地應當滿足許多標準，包括、但不限于：a)源自人組織；b)在培養(yǎng)中高密度生長；c)表現出商業(yè)上可行的蛋白得率；d)允許穩(wěn)定的外來基因導入；e)允許基因擴增方法；f)允許使用親本細胞進行單克隆抗體生產，如在人-人雜交瘤中；g)表現出穩(wěn)定的長期蛋白表達；h)在無血清的和無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的能力；i)缺乏內肽酶活性，從而減少蛋白降解，j)不含有致病劑，包括病毒dna和支原體；k)生產表現出翻譯后修飾的蛋白，所述翻譯后修飾在功能上與在天然存在的人蛋白上發(fā)生的翻譯后修飾類似或相同，優(yōu)選地是組織和細胞特異性的。這些翻譯后修飾可以包括、但不限于：糖蛋白上的碳水化合物部分。盡管存在許多用于表達人蛋白的人宿主細胞或異源雜交瘤(heterohybridomas)，但它們都沒有成功地滿足所有上述標準。最值得注意的是，從現有的人細胞表達系統(tǒng)以臨床上有用的得率表達和分離蛋白的嘗試，已經導致有限的成功。真核細胞中的蛋白表達在多個階段受到控制，所述階段包括：(a)調節(jié)因子對染色質中的基因的影響；(b)轉錄起始的調節(jié)；和(c)翻譯后修飾。認為這些不同的階段是發(fā)育階段特異性的和/或組織特異性的。因而，當將編碼所需蛋白的外源基因摻入細胞中時，所需蛋白的表達可能小于最佳量?？赡墚a生問題，諸如缺乏穩(wěn)定的表達(li等人,procnatlacadsciusa95:3650-3654,1998；miyaji等人,cytotechnology,3:133-140,1990；miyaji等人,cytotechnology4:173-180,1990；miyaji等人,cytotechnology4:39-43,1990；satoh等人,cytotechnology13:79-88,1993)、低表達得率(airoldi等人,cancerresearch61:1285-1290,2001；hosoi等人cytotechnology7:25-32,1991)和非最佳的翻譯后修飾(shinkawa等人,j.biol.chem.278:3466-3473,2003)。所有這些因素都可能影響蛋白的潛在商業(yè)效用。作為一個實例，namalwa細胞(在懸浮培養(yǎng)物中生長并適應沒有血清和清蛋白的培養(yǎng)基的人b類淋巴母細胞)的一個亞系namalwakjm-1，被用于大規(guī)模生產α-干擾素，后者是伯基特氏淋巴瘤細胞的內源蛋白。但是，當將g-csf蛋白(它對于伯基特氏淋巴瘤細胞而言是外來的，但是對于b細胞而言是內源的(airoldi等人,cancerresearch61:1285-1290,2001))用作經由電穿孔的轉染的靶向蛋白時，g-csf表達水平在多個氨甲蝶呤(mtx)抗性的克隆中存在不同，且最高的g-csf生產克隆具有僅2.4μg/ml/天的比生產率(當適應無血清的條件時)。此外，當細胞數目超過7x105細胞/ml時，高密度培養(yǎng)抑制比生產率(hosoi等人cytotechnology7:25-32,1991)。即使報道的最大g-csf濃度顯著提高并達到41μg/ml，但為了實現它，需要廣泛地并費力地操縱細胞培養(yǎng)條件，其中非常嚴緊地控制ph。也表明用于最佳生長的培養(yǎng)基不同于用于最佳生產的培養(yǎng)基，因而產生希望的高密度和高生產率之間的明顯沖突，并導致工業(yè)上不可行的系統(tǒng)。因為真核生物中的基因表達在多個步驟中受到控制，所述步驟包括：(a)染色質中的基因的調節(jié)因子的可用性和可接近性；(b)對特定轉錄起始速率的可及啟動子的調節(jié)；和(c)隨后在不同的步驟處的轉錄后事件，組織特異性的和發(fā)育特異性的轉錄因子的存在對基因的表達具有很大影響。此外，特定細胞類型的基因調節(jié)需要幾種順式作用的dna調節(jié)序列的協(xié)同作用，所述調節(jié)序列是將分子信號傳遞給基因的蛋白的結合位點(blackwood等人,science281:60-63,1998)。這些序列結合調節(jié)蛋白，以形成稱作增強體(enhanceosome)的復合物(marika等人,curropingenetdev11(2):205-208,2001)。因而，當導入人譜系特異性的宿主細胞中時被靶向的基因離它的通常細胞環(huán)境越遠，所需蛋白在高生產水平的穩(wěn)定表達和生產越低。當用外來蛋白的基因轉染namalwakjm-1細胞時，所述外來蛋白進一步遠離譜系特異性的蛋白(對于類淋巴母細胞系而言)，諸如β干擾素(miyaji等人,cytotechnology,3:133-140,1990；miyaji等人,cytotechnology4:173-180,1990)或人淋巴毒素(miyaji等人,cytotechnology4:39-43,1990)或尿激酶原(satoh等人,cytotechnology13:79-88,1993)，發(fā)現轉染率和細胞生產率甚至更低。外來基因在人譜系特異性的細胞系中的有效表達也需要小心的、且有時使人厭煩的合適的增強子/啟動子選擇，所述增強子/啟動子將含有人宿主細胞可利用的核因子的結合位點。發(fā)現這樣的增強子/啟動子仍然可能導致這樣的啟動子的有限的適合性。例如，當研究幾種增強子/啟動子(諸如猿猴病毒40(sv40)早期基因啟動子、人巨細胞病毒(hcmv)主要立即早期基因啟動子、莫洛尼鼠白血病病毒(mo-mulv)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rsv)啟動子和雞β-肌動蛋白啟動子)在namalwakjm-1細胞中對外來基因的更有效表達時，發(fā)現mo-mulv啟動子是傳統(tǒng)的sv40早期啟動子的約10倍強，且高生產克隆達到30-40μg/106細胞/天的生產率(satoh等人,cytotechnology18:162-172,1996)。但是，使用逆轉錄病毒載體諸如mo-mulv的問題是，難以用于具有倒轉序列(invertingsequences)(內含子)的基因的轉染，這是由于核剪接機制對它們的去除(li等人,procntlacadsciusa95:3650-3654,1998)。在由2個基因編碼的蛋白(諸如抗體)的情況下，甚至進一步增加細胞和核環(huán)境之間的不匹配。此外，盡管namalwakjm-1細胞被用于制備人-人雜交瘤，但抗體得率使得該細胞系不適合工業(yè)生產。作為另一個實例，已經證實人胚腎細胞系293可以被外來來源的基因非常容易地轉染，具有高度的穩(wěn)定性。但是，源自293轉染子的蛋白具有有限的用途，且通常僅適用于研究目的，這是因為293細胞包括人腺病毒ad5dna(hek293細胞)。但是，在商業(yè)場合使用293細胞的最大限制是它的貼壁性質。已經進行了許多嘗試來使293細胞適合懸浮液中的有效轉染，其中使用節(jié)省成本的載體諸如聚乙烯亞胺(durocher等人,nucleicacidsres30(2):e9,2002；schlaeger等人,cytotechnology30:71-83,1999)或磷酸鈣(girard等人,cytotechnology38:15-21,2002；jordan等人,cytotechnology26:39-47,1998；meissner等人,biotechnolbioeng75(2):197-203,2001)。但是，這些載體僅導致重組蛋白的瞬時表達，這意味著，對于接種的培養(yǎng)物的每個新批次，必須重復轉染。在ebv的orip存在于載體主鏈上時，為了實現懸浮生長和更高的蛋白表達，必須遺傳地修飾293細胞，以穩(wěn)定地表達eb病毒ebna1蛋白(293e)(durocher等人,nucleicacidsres30(2):e9,2002；parham等人,cytotechnology35:181-187,2001；schlaeger等人,cytotechnology30:71-83,1999)。甚至在用ebna1轉染以后，當在無血清培養(yǎng)基(hek293ebna1)中培養(yǎng)(大規(guī)模生產的先決條件)時，293e細胞表現出非常差的轉染率，這最可能是由于為了防止細胞集合而加入的聚陰離子(肝素,硫酸葡聚糖)的存在。已經嘗試如下減輕該問題：給培養(yǎng)基補加蛋白胨，所述蛋白胨從動物來源(諸如肉、明膠和酪蛋白)的酶促水解得到(pham等人,biotechnolbioeng84(3):332-42,2003)。當將hek293ebna1細胞系用于生產tie-2(血管形成素(angiopoietin)生長因子的受體酪氨酸激酶)和神經氈蛋白-1ed(介導神經元細胞導向的受體)時，蛋白表達受到得到的低細胞密度培養(yǎng)物(與在未轉染的培養(yǎng)物中得到的那些相比)的限制。同樣，得到的蛋白的>95％的純度僅適用于研究級產物。另外，hek293ebna1細胞不適用于生產單克隆抗體(mab)。目前的生產治療用mab的策略包括：使用哺乳動物細胞系統(tǒng)(即cho或ns0轉染瘤)來重組地生產由下述獲得的mabs：免疫接種攜帶人ig基因的轉基因小鼠(xenomice)，人源化嚙齒類動物mabs，或通過篩選人mab文庫(vandijk等人,curr.opin.chem.biol.5:368-374,2001)。盡管在它們的序列方面，治療用mab最近已經發(fā)展成嵌合抗體(嚙齒類動物可變區(qū)和人恒定區(qū))、人源化的抗體(除了嚙齒類動物互補決定區(qū)以外，都是人序列)和全人抗體(人ab)以使變應性應答最小化，但治療用mab的重要方面是它的引起免疫效應子功能(諸如抗體依賴性細胞毒作用)的能力，如果mab是由改變它的天然糖基化模式的非人宿主細胞生產的，則該能力受損(shinkawa等人,j.biol.chem.278:3466-3473,2003)?？紤]到這些事實，理想的方案是，由人細胞生產治療用抗體。在該情況下，全人mab將能夠發(fā)揮人效應子功能，并因為它們的天然的人結構而具有非常有限的免疫原性。已經報道了雜交瘤或eb病毒(ebv)-轉化的源自人b細胞的類淋巴母細胞系的制備(kirman等人,hybrid.hybridomics21:405-414,2002；boerner等人,j.immunol.147:86-95,1991；zafiropoulos等人,j.immunol.methods200:181-190,1997)。但是，關于這些mab和系在它們的長期穩(wěn)定性和生產過程的適合性(尤其是整批生產過程中的生產水平和ig分泌的穩(wěn)定性)方面的表征，存在有限的信息。盡管已經報道了在4天運行期間以1.2g/升的累積效價生產抗人gm-csf的人mab的細胞系，但這些細胞系源自原代人b細胞與異源髓淋巴瘤(heteromyelolymphoma)k6h6/b5細胞(即從人b細胞淋巴瘤和小鼠骨髓瘤細胞的雜交得到的小鼠-人細胞系)的體細胞雜交(融合)(li等人,procnatlacadsciusa103(10):3557-3562,2006)。在ebv-轉化的情況下，困難是，確立完全無限增殖化的人b細胞系，同時維持穩(wěn)定的抗體生產。這是由于無限增殖化的低功效、細胞生長的停滯、和生產igm的細胞的優(yōu)勢無限增殖化。另外，最近的報道已經表明，大多數ebv-轉化的b細胞具有縮短的端粒和有限的壽命，主要是在160群體倍增水平之前(sugimoto等人,jvirol73:9690-9691,1999；toda等人,jchromatogrbanalyt.technol.biomed.lifesci.787:197-206,2003)。為了克服該問題，已經嘗試使ebv-轉化的b細胞與合適的配偶體細胞系(表達系統(tǒng))雜交(或融合)，但是實際上，這些配偶體細胞系代表異源雜合體(heterohybrid)的各種組合，諸如源自小鼠-人異源雜交瘤與人b細胞的三源雜交瘤(trioma)(ainai等人,humantibodies15:139-154,2006；kalantarov等人,humantibodies11:85-96,2002；karpas等人,procnatlacadsciusa98:1799-1804,2001)。當將這樣的三源雜交瘤與生產針對破傷風毒素(tt)的抗體的原代ebv-轉化的b細胞融合時，導致產生具有1/4的小鼠組分的四源雜交瘤(tetroma)。盡管在連續(xù)克隆四源雜交瘤3次以后仍然可能穩(wěn)定地生產針對tt的mab，但這樣的重復的細胞克隆步驟是費力的且費時的。另外，盡管由四源雜交瘤生產的mab的量對于實驗目的而言是足夠的，但該水平對于作為藥物的mab的大規(guī)模生產而言是不足的。仍然有疑問的是，在有多克隆激活劑cpg2006或者cd19或bcr的共同連接(co-ligation)存在下，無限增殖化是否可能產生完整的系統(tǒng)，用于以適當的體積有效地生產用于治療用途的特定mab(hartman等人,jimmunol164:944-953,2000；hur等人,cellprolif38:35-45,2005；traggiai等人,natmed10:871-875,2004)。已經嘗試了許多方法來使用人細胞生產生物學物質，諸如生長因子、抗體和可溶性的蛋白。本發(fā)明的一個目的是，克服或改善現有技術的至少一個缺點，或提供有用的替代方案。技術實現要素：普遍認為，多融合細胞是不穩(wěn)定的，且參與融合的細胞越多，得到的雜交細胞的不穩(wěn)定性越大。令人驚奇地，在本發(fā)明中，由許多細胞(例如3個細胞)的融合產生的雜交細胞表現出功能穩(wěn)定性。具體地，已經發(fā)現，源自不同譜系的細胞可以體細胞地(somatically)融合或雜交，以形成基本上穩(wěn)定的嵌合細胞/雜交細胞。更具體地，本發(fā)明涉及如下制備的跨譜系(cross-lineage)嵌合細胞/雜交細胞：雜交至少3個親本細胞，產生三雜交體(tri-hybrid)，其中至少2個親本細胞源自不同的譜系，且其中在雜交中沒有包括骨髓瘤細胞。還已經令人驚訝地發(fā)現，本發(fā)明的穩(wěn)定的嵌合細胞/雜交細胞具有多種用途，例如，用于生產表現出希望的翻譯后修飾(例如，但不限于，人糖基化模式)的蛋白。還已經令人驚訝地發(fā)現，當從本發(fā)明的嵌合細胞/雜交細胞同時地表達第二種所需蛋白時，可以增強來自本發(fā)明的穩(wěn)定的嵌合細胞/雜交細胞的所需蛋白的表達水平。此外，從本發(fā)明的嵌合細胞/雜交細胞同時地表達第三種所需蛋白，可以增強2種靶蛋白的表達水平。因此，本發(fā)明提供了在雜交細胞的多方適應性和穩(wěn)定性方面明顯勝過以前已知的系統(tǒng)的優(yōu)點。在一個實施方案中，通過融合2個相同的細胞或相同譜系的2個細胞以及不同譜系的1個細胞，生產本發(fā)明的雜交細胞。這樣的雜合體傾向于出現指向在雜交中使用的大多數細胞類型的表型。這些雜交細胞可以特別地用于表達蛋白，其中已知組織-特異性的翻譯后修飾對于蛋白功能而言是重要的。例如，從包括至少2個源自b細胞譜系的細胞的雜交細胞，可以更有效地表達已知在從b細胞表達時具有特定功能性的翻譯后修飾的細胞因子，從而確保功能性的翻譯后修飾。由于蛋白的翻譯后修飾可能是組織特異性的或細胞類型特異性的，所以技術人員顯而易見，本發(fā)明的雜交細胞也可以富含特定細胞類型或表型(如特定cd標記物的存在所證實的)，以允許表達這樣的蛋白：所述蛋白表現出希望的翻譯后修飾或與特定細胞類型或表型有關的希望的功能性。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及雜交細胞，其包括使用至少一個無限增殖化的細胞。但是，本領域技術人員顯而易見，本發(fā)明也涉及非無限增殖化的細胞的融合，所述細胞隨后可以通過體外轉化方法無限增殖化，所述方法例如：導入病毒基因，例如eb病毒(ebv)、猿猴病毒40(sv40)t抗原、腺病毒e1a和e1b和人乳頭瘤病毒(hpv)e6和e7。或者，通過表達端粒末端轉移酶逆轉錄酶蛋白(tert)，可以使非無限增殖化的細胞無限增殖化。無限增殖化的細胞也可以源自其中癌基因表達已經被修飾的細胞。無限增殖化的細胞另外可以源自誘導無限生長的能力的任何動作，包括、但不限于紫外線暴露或自發(fā)轉化(其中無限增殖的機理不明)。顯而易見，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及3個個別細胞的融合。在替代實施方案中，本發(fā)明涉及3個細胞群體的融合，其中每個群體包括多個相同的細胞類型。本領域技術人員將理解，細胞群體的融合可以在大量細胞培養(yǎng)物中進行。然后可以通過本領域眾所周知的方法，例如通過選擇性培養(yǎng)基，諸如次黃嘌呤氨基蝶呤胸苷(hat)培養(yǎng)基，鑒別和分離希望的雜交的細胞?；蛘?，通過鑒別特定的細胞標記物，諸如cd標記物，可以鑒別和分離融合的細胞。顯而易見，通過本領域眾所周知的方法，諸如熒光激活細胞分選術(facs)方法，可以實現基于它們的標記物(諸如cd標記物)的表達以及細胞對特定細胞類型或表型的富集來分離細胞。還顯而易見，可以用編碼所需蛋白的dna穩(wěn)定地或瞬時地轉染本發(fā)明的細胞。通過本領域眾所周知的方法，諸如通過在用于轉染的dna中包含選擇報道基因，可以鑒別出這些穩(wěn)定地或瞬時地轉染的細胞。這樣的報道基因可以包括這樣的基因：所述基因能夠使轉染的細胞在化合物-缺陷型培養(yǎng)基中生長，例如二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。報道基因還可包括賦予轉染的細胞的目視鑒定的基因，例如，螢光素酶基因或綠色熒光蛋白(gfp)基因?；蛘?，報道基因可以賦予對特定化合物(例如g418)的抗性。這樣的報道基因是本領域眾所周知的。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞可以用于表達單克隆抗體。傳統(tǒng)上，已經通過融合骨髓瘤細胞和源自免疫接種的動物(諸如小鼠)的脾的b細胞，進行單克隆抗體生產。但是，骨髓瘤細胞不穩(wěn)定性且尤其是基因組不穩(wěn)定性可能導致所需抗體的差強人意的表達。另外，因為動物細胞被用于生產雜交瘤，所以生產的抗體表現出非人翻譯后修飾。當將抗體用作人治療劑時，具有非人翻譯后修飾的抗體可能產生顯著的問題。這些問題可能包括：抗體的降低的效應子功能以及免疫原性，從而導致令人不滿意的體內半衰期和因此導致的降低的體內功效。也有證據提示，在沒有骨髓瘤細胞存在下，不能成功地生產雜合體。本發(fā)明的雜交細胞令人驚訝地表明，在沒有骨髓瘤細胞存在下，可以生產穩(wěn)定的雜合體。此外，由本發(fā)明的雜交細胞表達的抗體解決了與使用由雜交瘤生產的單克隆抗體有關的問題。這些抗體表現出人源化的翻譯后修飾，并由表現出功能穩(wěn)定性的細胞表達。根據第一個方面，本發(fā)明提供了通過雜交下述細胞而制備的雜交細胞：第一個細胞，其中所述第一個細胞是干細胞或源自未定型的祖細胞的細胞；源自淋巴共同祖細胞的第二個細胞；和源自淋巴共同祖細胞的第三個細胞，且其中所述第一個細胞不是骨髓瘤細胞。在一個實施方案中，所述第二個細胞是源自b淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞是源自b淋巴譜系的細胞。在另一個實施方案中，所述第二個細胞是源自t淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞源自t淋巴譜系。在另一個實施方案中，所述第二個細胞是源自b淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞是源自t淋巴譜系的細胞。優(yōu)選地，所述第一個細胞是源自髓共同祖細胞的細胞。這樣，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細胞的細胞是骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細胞的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd16、cd15或cd14。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個顯示至少一種下述cd抗原的髓共同祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：cd16、cd15或cd14。本發(fā)明也提供了通過雜交1個顯示至少一種下述cd抗原的髓共同祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：cd16、cd15或cd14。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是單核細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個單核細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個單核細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在另一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是原代骨髓單核祖細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個原代骨髓單核祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個原代骨髓單核祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是無限增殖化的細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個選自下述的無限增殖化的細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個選自下述的無限增殖化的細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。在另一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞源自脾、外周血、臍帶血或骨髓。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在另一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞是前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞和2個選自下述的b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個選自下述的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。在一個實施方案中，所述效應b細胞是抗原處理過的(antigen-experienced)b-細胞或漿細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個選自下述的b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：抗原處理過的b-細胞或漿細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個抗原處理過的b-細胞或漿細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd19、cd20、cd72或cd5。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個顯示至少一種下述cd抗原的b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：cd19、cd20、cd72或cd5。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個顯示至少一種下述cd抗原的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：cd19、cd20、cd72或cd5。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞是前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個選自下述的t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個選自下述的t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd3、cd4、cd5或cd8。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個顯示至少一種下述cd抗原的t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞：cd3、cd4、cd5或cd8。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞，所述t淋巴樣細胞選自顯示至少一種下述cd抗原的t細胞：cd3、cd4、cd5或cd8。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞是無限增殖化的細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞，所述b淋巴樣細胞中的至少一個可以是無限增殖的細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個無限增殖的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞是無限增殖化的細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個無限增殖的t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個源自淋巴組織的b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個源自淋巴組織的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞組織和1個源自淋巴組織的t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在本發(fā)明的雜交細胞中所包括的b或t淋巴樣細胞源自淋巴組織的情況下，所述淋巴組織優(yōu)選地選自：外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體、腺樣體(adenoids)和局部淋巴結。在一個實施方案中，在本發(fā)明的雜交細胞的制備中包含的細胞中的至少一個是人細胞。還顯而易見，在一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞可以包含至少一個小鼠細胞。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是k562細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個k562細胞和2個b淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個k562細胞、1個無限增殖的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述第二個細胞或所述第三個細胞是wil2-ns細胞或molt4細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個wil2-ns細胞和1個t淋巴樣細胞而制備的雜交細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個molt4細胞而制備的雜交細胞。在一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是molt4細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是原代b細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人骨髓單核祖細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代人t細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是wil2-ns細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代小鼠單核細胞，所述第二個細胞是sp2細胞，且所述第三個細胞是原代小鼠t細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代小鼠單核細胞，所述第二個細胞是sp2細胞，且所述第三個細胞是sp2細胞。在另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人或小鼠單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是sp2細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞表達所需蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞表達超過一種所需蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞表達2種所需蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞表達3種所需蛋白。在一個實施方案中，所述所需蛋白是內源蛋白，且在表達超過一種所需蛋白的情況下，至少一種所需蛋白是內源蛋白。在另一個實施方案中，所述蛋白是重組蛋白，且在表達超過一種所需蛋白的情況下，至少一種所需蛋白是重組蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白是細胞因子，例如集落刺激因子或白介素。在一個實施方案中，所述蛋白是gm-csf。在另一個實施方案中，所述蛋白是白介素2。在另一個實施方案中，所述蛋白是受體或其片段。在一個實施方案中，所述蛋白是可溶的受體。在另一個實施方案中，所述蛋白是免疫球蛋白。在一個實施方案中，所述蛋白是人il-4受體α鏈。在另一個實施方案中，所述蛋白是igm。在另一個實施方案中，所述蛋白是igg。在另一個實施方案中，所述蛋白是cd54。在一個實施方案中，在本發(fā)明的雜交細胞表達超過一種所需蛋白的情況下，優(yōu)選地所需蛋白選自：細胞因子、集落刺激因子、白介素或受體或其片段。在具體實施方案中，所需蛋白是：免疫球蛋白，諸如igm、且具體是可溶的人igm；細胞因子，例如白介素、且具體是白介素-2(il-2)、且更具體地是人il-2；和/或受體，具體是白介素受體、且更具體地是人白介素受體、且甚至更具體地是人白介素-4受體α(il-4ra)。技術人員將理解，本發(fā)明的雜交細胞不限于表達特定所需蛋白，它們也不限于表達特定數目的蛋白。此外，技術人員顯而易見，從本發(fā)明的雜交細胞同時表達所需蛋白，可以導致所需蛋白表達水平的增強。在一個實施方案中，所述用于制備本發(fā)明的雜交細胞的雜交是通過電方法來實現的。在另一個實施方案中，所述制備本發(fā)明的雜交細胞的雜交是通過化學方法來實現的。在一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞另外與表達目標蛋白的細胞雜交。在具體實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞與顯示cd25抗原的b淋巴細胞雜交。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞顯示cd25抗原，并表達免疫球蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞與顯示cd25抗原的b淋巴細胞雜交，且得到的細胞表達免疫球蛋白。在一個實施方案中，通過雜交3個個別細胞，進行所述用于制備本發(fā)明的雜交細胞的雜交。在另一個實施方案中，使用3個細胞群體，進行所述用于制備本發(fā)明的雜交細胞的雜交，其中每個所述群體包括多個相同的細胞類型或表型。在一個實施方案中，本發(fā)明的所述雜交細胞富含界定特定細胞類型的標記物，以允許表達表現出希望的翻譯后修飾或希望的功能性的蛋白。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種生產蛋白的方法，所述方法包括下述步驟：在根據本發(fā)明的雜交細胞中表達蛋白。在另一個方面，本發(fā)明提供了在根據本發(fā)明的雜交細胞中生產的蛋白。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種生產根據本發(fā)明的雜交細胞的方法，其中所述方法包括下述步驟：雜交：第一個細胞，其中所述第一個細胞是干細胞或源自未定型的祖細胞的細胞；源自淋巴共同祖細胞的第二個細胞；和源自淋巴共同祖細胞的第三個細胞，且其中所述第一個細胞不是骨髓瘤細胞。在本發(fā)明的方法的一個實施方案中，所述第二個細胞是源自b淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞是源自b淋巴譜系的細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第二個細胞是源自t淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞源自t淋巴譜系。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第二個細胞是源自b淋巴譜系的細胞，且所述第三個細胞是源自t淋巴譜系的細胞。優(yōu)選地，所述第一個細胞是源自髓共同祖細胞的細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細胞的細胞是骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細胞的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd16、cd15或cd14。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個顯示至少一種下述cd抗原的髓共同祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：cd16、cd15或cd14。本發(fā)明也提供了通過雜交1個顯示至少一種下述cd抗原的髓共同祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：cd16、cd15或cd14。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是單核細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個單核細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個單核細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在另一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是原代骨髓單核祖細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個原代骨髓單核祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個原代骨髓單核祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是無限增殖化的細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個選自下述的無限增殖化的細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個選自下述的無限增殖化的細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：骨髓單核祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞或嗜堿性粒細胞。在另一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞源自脾、外周血、臍帶血或骨髓。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細胞和2個b淋巴樣細胞或2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細胞、1個b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在另一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞是前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或1個干細胞和2個選自下述的b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個選自下述的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：前b細胞、幼b細胞、幼稚b細胞、活化的b細胞或效應b細胞。在一個實施方案中，所述效應b細胞是抗原處理過的b-細胞或漿細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個選自下述的b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：抗原處理過的b-細胞或漿細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個抗原處理過的b-細胞或漿細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd19、cd20、cd72或cd5。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個顯示至少一種下述cd抗原的b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：cd19、cd20、cd72或cd5。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個顯示至少一種下述cd抗原的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：cd19、cd20、cd72或cd5。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞是前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個選自下述的t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個選自下述的t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：前t細胞、幼t細胞、幼稚t細胞、活化的t細胞或效應t細胞。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞顯示至少一種下述cd抗原：cd3、cd4、cd5或cd8。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個顯示至少一種下述cd抗原的t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法：cd3、cd4、cd5或cd8。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法，所述t淋巴樣細胞選自顯示至少一種下述cd抗原的t細胞：cd3、cd4、cd5或cd8。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞是無限增殖化的細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法，所述b淋巴樣細胞中的至少一個可以是無限增殖的細胞。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個無限增殖的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞是無限增殖化的細胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個無限增殖的t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述源自b淋巴譜系的細胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞和2個源自淋巴組織的b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個源自淋巴組織的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述源自t淋巴譜系的細胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞組織和1個源自淋巴組織的t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在生產本發(fā)明的雜交細胞的方法中所包括的b或t淋巴樣細胞源自淋巴組織的情況下，所述淋巴組織優(yōu)選地選自：外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體、腺樣體和局部淋巴結。在一個實施方案中，在生產本發(fā)明的雜交細胞的方法中包含的細胞中的至少一個是人細胞。還顯而易見，在一個實施方案中，生產本發(fā)明的雜交細胞的方法可以包含至少一個小鼠細胞。在一個實施方案中，所述源自髓共同祖細胞的細胞是k562細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個k562細胞和2個b淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個k562細胞、1個無限增殖的b淋巴樣細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述第二個細胞或所述第三個細胞是wil2-ns細胞或molt4細胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個wil2-ns細胞和1個t淋巴樣細胞來生產雜交細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交1個髓共同祖細胞或干細胞、1個b淋巴樣細胞和1個molt4細胞來生產雜交細胞的方法。在一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是molt4細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是原代b細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人骨髓單核祖細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代人t細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是k562細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是原代t細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是wil2-ns細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代小鼠單核細胞，所述第二個細胞是sp2細胞，且所述第三個細胞是原代小鼠t細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代小鼠單核細胞，所述第二個細胞是sp2細胞，且所述第三個細胞是sp2細胞。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一個細胞是原代人或小鼠單核細胞，所述第二個細胞是wil2-ns細胞，且所述第三個細胞是sp2細胞。定義在本發(fā)明的上下文中，詞語“包含”、“包括”等應當解釋為它們的包括含義(而不是它們的排除含義)，也就是“包括、但不限于”的含義。雜交細胞雜交細胞是包含來自超過一個基因組的組分的細胞(除了合子和它們的衍生物以外)。它是從例如2個或更多個生物細胞(親本細胞)的體細胞雜交(或全細胞雜交)構建出的細胞。所述親本細胞可以從相同的譜系(或物種)或不同的譜系(或物種)得到。從相同的譜系和物種產生的雜交細胞被稱作同源雜合體(auto-hybrid)，從不同的譜系產生的雜交細胞被稱作異源雜合體(hetero-hybrid)。嵌合細胞嵌合細胞是使用源自2個或更多個不同物種的基因組人工生產的雜交細胞。跨譜系雜交細胞跨譜系雜交細胞是使用源自2個或更多個細胞的基因組人工生產的雜交細胞，所述細胞源自不同的細胞譜系。造血細胞被分成2個主要譜系：淋巴樣(t細胞、b細胞和nk細胞)和髓樣(單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹突細胞)。三雜交細胞三雜交細胞是使用源自3個細胞的基因組人工生產的雜交細胞。穩(wěn)定的當提及細胞時，術語“穩(wěn)定的”表示細胞的表現出下述一致性的能力：給定生長或生產率參數的一致性，或細胞系的產物特征隨著世代數的漸增的一致性。當關于穩(wěn)定的轉染子使用時，它表示在相對恒定的水平基本上無限地表達轉基因的細胞系。體細胞雜交在本申請的上下文中，術語“體細胞雜交”表示以下述方式從2個或更多個二倍體(非配子)細胞(親本細胞)產生一個單獨的活細胞的過程：誘導所述細胞的質膜處于良好接觸，同時誘導親本細胞的質膜在接觸點處可逆地分解，并使每個親本細胞的實體或細胞器組合在新形成的單個細胞的包膜內。新形成的單個細胞被稱作雜交的細胞或雜交細胞。干細胞術語“干細胞”表示非特化的細胞，其具有通過有絲分裂進行分裂和發(fā)育成多種不同細胞類型的能力。干細胞可以包括胚胎干細胞、源自臍帶的“成體”干細胞或源自成體的干細胞。干細胞包括具有分化成所有細胞類型的非限制能力的細胞，即全能細胞。干細胞還可以包括它們的分化成特化細胞的能力受限制的細胞，例如多潛能干細胞(pluripotentstemcell)、多能干細胞(multipotentstemcell)、寡能干細胞(oligopotentstemcell)或單能干細胞(unipotentstemcell)。無限增殖化的細胞術語“無限增殖化的細胞”表示具有無限生長的能力的細胞。顯而易見，無限增殖化的細胞可以源自體內惡性腫瘤或胚胎?；蛘?，通過對細胞進行誘導無限生長能力的操作，可以衍生出無限增殖化的細胞。這些操作可以包括，例如，體外轉化過程，例如導入病毒基因諸如eb病毒(ebv)、猿猴病毒40(sv40)t抗原、腺病毒e1a和e1b和人乳頭瘤病毒(hpv)e6和e7。或者，通過表達端粒末端轉移酶逆轉錄酶蛋白(tert)或其它方法，可以從細胞衍生出無限增殖化的細胞。也可以從已經修飾了癌基因表達的細胞衍生出無限增殖化的細胞。無限增殖化的細胞可以源自誘導無限生長能力的任意操作，包括、但不限于：紫外線暴露或自發(fā)轉化(其中無限增殖的機理不明)骨髓瘤細胞術語“骨髓瘤細胞”表示漿細胞的惡性腫瘤。雜交瘤術語“雜交瘤”表示通過雜交骨髓瘤細胞和源自免疫接種的動物的脾的b-細胞而生成的細胞。雜交瘤是具有生產單克隆抗體的能力的無限增殖化的細胞。未定型的祖細胞術語“未定型的祖細胞”表示干細胞的早期后代，其僅可以分化成有限種類的細胞，而不定向于任何特定譜系，但是它不再可以更新自身。髓共同祖細胞髓共同祖細胞是這樣的造血干細胞的后代：所述造血干細胞限于髓譜系，且能夠產生巨核細胞/紅細胞或粒細胞/巨噬細胞祖細胞，但不產生淋巴樣細胞。淋巴共同祖細胞淋巴共同祖細胞是這樣的造血干細胞的后代：所述造血干細胞限于淋巴譜系，且產生b細胞、t細胞和天然殺傷細胞，但不產生髓樣細胞。b淋巴譜系-衍生的細胞b淋巴譜系-衍生的細胞是源自淋巴共同祖細胞(在它的b譜系定型為變成任意類型的b細胞以后)的任何細胞。t淋巴譜系-衍生的細胞t淋巴譜系-衍生的細胞是源自淋巴共同祖細胞(在它的t譜系定型為變成任意類型的t細胞以后)的任何細胞。粒細胞-巨噬細胞祖細胞粒細胞-巨噬細胞祖細胞是這樣的祖細胞：其源自髓共同祖細胞，且定型為粒細胞和單核細胞譜系，但是沒有定型為巨核細胞譜系和紅細胞譜系。巨核細胞-紅細胞祖細胞巨核細胞-紅細胞祖細胞是這樣的祖細胞：其源自髓共同祖細胞，且定型為巨核細胞譜系和紅細胞譜系，但是沒有定型為粒細胞和單核細胞譜系。前b細胞前b細胞是這樣的發(fā)育中的b細胞：其處于膜結合的igm的重鏈與替代輕鏈一起表達時的階段。幼b細胞幼b細胞表示骨髓內的發(fā)育中的b細胞，其中在抗體的重組階段，基因座vj重排在l鏈上，且vdj重排在h鏈上，表現出igm受體表達。幼稚b細胞幼稚b細胞是這樣的成熟的b細胞：其通過它的表面免疫球蛋白的隨機基因重排，已經在骨髓中分化和成熟，但是尚未遇到周圍的關連抗原?；罨腷細胞一類成熟的b細胞，其已經通過抗原識別(經由bcr)遇到在周圍的它的關連抗原，從而導致克隆增殖和以t-依賴性的或非依賴性的方式終末分化成漿細胞的組合。效應b細胞效應b細胞經常與分泌抗體的漿細胞同義，后者是一類短壽b細胞，其分泌對特定抗原特異性的抗體以及過多的細胞因子，以吸引免疫系統(tǒng)的其它細胞。記憶b細胞記憶b細胞是從活化的b細胞形成的長壽b細胞，其對在初次免疫應答過程中遇到的抗原是特異性的，且能夠在第二次暴露于相同抗原以后快速應答。漿細胞漿細胞是免疫系統(tǒng)的終末的有絲分裂后的、短壽細胞，其在cd4+淋巴細胞(th細胞)刺激時從b細胞分化，并分泌大量抗體。前t細胞前t細胞是這樣的發(fā)育中的t細胞：其處于vbdbjb是完整的且tcrβ鏈在雙陰性的(cd4-cd8-)t細胞(cd3+)中表達時的階段。幼t細胞幼t細胞是這樣的發(fā)育中的t細胞：其已經從骨髓遷移至胸腺，但是尚未完成它的tcr的重排，或針對它的tcr對在自身主要組織相容性復合體(mhc)分子背景下呈遞的自身肽的結合能力的選擇，或定型為t殺傷譜系或t輔助譜系，它們與細胞分別對mhci類或ii類分子的tcr特異性精確地關聯(lián)。通過共同受體分子cd8或cd4之一的表達的喪失，在表型上標記譜系定型。幼稚t細胞一種成熟的t細胞，其已經在骨髓中分化，并成功地經歷了胸腺中的中心選擇的正過程和負過程(重排它的tcr，并喪失共同受體分子之一)，但是尚未遇到在周圍的關連抗原?；罨膖細胞活化的t細胞是這樣的t細胞：其通過在抗原呈遞細胞上的主要組織相容性復合體肽(肽:mhc復合物)和b7家族成員分別對細胞表面上的tcr和cd28的銜接，開始變成抗原-特異性的效應t細胞。效應t細胞效應t細胞是一類短壽t淋巴細胞，其在接觸攜帶對于所述細胞而言適當的肽:mhc復合物的細胞時，能夠立即做出應答。附圖說明圖1.鑒別和分選-純化的cd71+k562細胞。圖2.cd15和cd71陽性的k562細胞的facs概況；(a)原始的cd71-富集的k562細胞群體中大約18％是cd15陽性的(r1區(qū)域)，和(b)在培養(yǎng)2個月以后cd15陽性的k562細胞的重新分析。圖3.cd15在cd34+aml單核的細胞上的表達。圖4.cd16的facs概況和通過cd14磁珠(macs)分離的不同cd14+細胞群體的分選門。圖5.用小鼠抗-人cd19和小鼠抗-人cd5抗體染色的臍帶血單核的細胞的facs概況。圖6.用小鼠抗-人cd3和小鼠抗-人cd5抗體染色的單核的臍帶血細胞的facs概況。圖7.用小鼠抗-人cd20和小鼠抗-人cd72抗體染色的骨髓單核的細胞的facs概況。圖8.扁桃體單核的細胞的cd3和cd54的典型facs概況。圖9.igm和igg陽性的培養(yǎng)的淋巴細胞的鑒別；(a)在培養(yǎng)5天以后，18％的cd19+細胞是igm陽性的，且1％在細胞表面上具有可檢測的igg；(b)在培養(yǎng)10天以后，igm陽性的淋巴細胞的百分比降低至2％，且igg陽性的細胞的百分比增加至15％。圖10.在具有髓樣和淋巴樣來源的癌基因的kmw三雜交細胞上的cd表達的facs概況。圖11.cd4和cd19在原代混合的脾淋巴細胞、分選的cd4和cd19群體以及得到的kbt三雜交細胞系上的表達；(a)cd4和cd19在原代脾淋巴細胞上的表達；(b)分選的cd19+細胞的純度概況(98.1％)；(c)分選的cd4+細胞的純度概況(96.8％)；(d)cd19和cd4在三雜交細胞上的共表達。三雜交細胞群體中超過99％共表達b和t細胞的標記物。圖12.cd19、cd3和cd5在kbt三雜交體上的表達，所述kbt三雜交體源自1個無限增殖的髓樣細胞和2個原代抗原處理過的淋巴樣細胞；(a)cd19和cd5在kbt三雜交細胞表面上的表達；(b)cd3和cd5在kbt三雜交體上的表達。圖13.cd4、cd8、cd72和cd20在kbt三雜交細胞表面上的表達，所述kbt三雜交細胞源自1個無限增殖的髓樣細胞和2個原代淋巴樣細胞，所述淋巴樣細胞源自骨髓和胸腺；(a)cd4和cd8的表達，(b)cd4和cd72的表達，(c)cd20和cd8的表達。圖14.在wtm三雜交體系上的cd表達的facs概況，所述wtm三雜交體系具有淋巴樣來源的癌基因和來自原代細胞的cd4和cd14；(a)cd19和cd4在三雜交細胞上的共表達，表現出一群具有高cd4表達水平的cd19細胞(cd19cd4h)和另一群具有低cd4表達水平的cd19細胞(cd19cd4l)；(b)cd4和cd14在相同的cd19陽性的三雜交體群體上的共表達，表現出基于高或低cd14表達的進一步的細胞群體異質性(cd4hcd14l；cd4hcd14h；cd4lcd14h)。圖15.在wtm三雜交細胞上的cd表達的典型facs概況，所述wtm三雜交細胞具有淋巴樣來源wil2-ns的癌基因、源自抗原處理過的t細胞的cd5和源自原代單核細胞的cd14。圖16.在wtm三雜交細胞上的cd表達的facs概況，所述wtm三雜交細胞具有淋巴樣來源wil2-ns的癌基因、源自細胞毒性t細胞的cd8和源自原代單核細胞的cd14。圖17.在wtm三雜交體上的cd4和cd8共表達的facs概況，所述wtm三雜交體源自雙cd陽性的t細胞。圖18.源自骨髓單核祖細胞的wtm三雜交細胞的表面上的cd表達；(a)使用cd19、cd4和cd15的三色染色，和(b)使用源自骨髓單核祖細胞的cd34和cd15和源自效應t細胞的cd4的三色染色。圖19.源自cd4+效應t細胞的kwt三雜交細胞的譜系特異性的標記物的表達。圖20.源自雙陽性的cd4+cd8+t細胞的kwt三雜交細胞的譜系特異性的標記物的表達。圖21.源自cd5+抗原處理過的t細胞的kwt三雜交細胞的譜系特異性的標記物的表達。圖22.wwm三雜交細胞的典型cd表達概況，所述wwm三雜交細胞源自2個各自含有淋巴樣癌基因的細胞和1個原代單核細胞；(a)cd19和cd14在三雜交細胞上的共表達(r1區(qū)域)，顯示了不表達cd14的cd19陽性細胞的獨特群體(r2區(qū)域)；(b)三雜交細胞上的cd14表達，所述三雜交細胞源自r1區(qū)域中的分選的細胞，并在培養(yǎng)中增殖2個月；(c)三雜交細胞上缺乏表面cd14，所述三雜交細胞源自2個月以后的r2區(qū)域中的分選的群體。圖23.從wwm三雜交細胞的不同亞群得到的cd14的代表性的rt-pcr。圖24.k562細胞的單個克隆的核型分析。結果表明，k562細胞系是三倍體，具有69個染色體模式數。檢測到下述染色體異常：缺少1個x染色體；染色體2的長臂的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少染色體3、額外的衍生染色體5，所述衍生染色體5用未知起源的額外染色體材料替代來自q11.2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；額外的染色體7，其具有染色體7的短臂的臂內倒位，其涉及帶p13和p22；缺少1個染色體9；染色體9的短臂從帶p13的末端缺失；由易位產生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個染色體9的區(qū)段；由易位產生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少染色體13；在一個染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少染色體14；未知起源的額外材料，其替代在2個染色體17上來自p13的區(qū)段；由易位產生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體1和18的區(qū)段；缺少1個染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；缺少1個染色體22；5個額外的不同的標記物染色體。圖25.wil2ns細胞系的5個克隆之一的核型分析。在該克隆(克隆1)中，檢測到下述異常：由易位產生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體1和8的區(qū)段；染色體13的額外同源物；由易位產生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；染色體17的來自q22-q23的區(qū)段的重復。圖26.kbt-1(cd19+)&(cd4+)三雜交體系的核型分析，顯示了接近三倍體的單個細胞克隆。由于隨機喪失，染色體計數在65-66之間變化，但是具有66的染色體模式數。檢測到下述的染色體異常：由復雜易位形成的衍生物x，所述復雜易位涉及x染色體的短臂，并可能涉及2個其它的未鑒別的染色體；缺少1個x染色體；染色體2的長臂中的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少染色體3；缺失染色體3p；衍生染色體4，其涉及染色體4和另一個未鑒別的染色體的區(qū)段；額外的衍生染色體5，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q11.2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；額外的衍生染色體7，其涉及染色體7的長臂和標記物3的長臂；缺少1個染色體13；在一個染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少1個染色體14；缺少1個染色體15；未知起源的額外材料替代2個染色體17上來自p13的區(qū)段；由易位產生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體1和18的區(qū)段；缺少1個染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；缺少染色體22；4個額外的不同的標記物染色體。圖27.kbt(k562&cd20+cd72+&cd4+cd8+細胞)跨譜系三雜交體(或kbt-2跨譜系)的核型，顯示了4個接近三倍體的克隆，(a)克隆1具有67的染色體模式數和下述的染色體異常：由復雜易位形成的衍生物x，所述復雜易位涉及x染色體的短臂，并可能涉及2個其它的未鑒別的染色體；缺少1個x染色體；衍生染色體1，其包含來自染色體1的區(qū)段和最可能來自染色體4的區(qū)段；染色體2的長臂中的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少1個染色體3；最可能地，缺失的染色體4可能是小衍生染色體4；額外的衍生染色體5，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q11.2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；額外的衍生染色體7，其涉及染色體7的長臂和標記物3的長臂；缺少1個染色體9；染色體9的短臂從帶p13的末端缺失；由易位產生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個染色體9的區(qū)段；由易位產生的衍生染色體10，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少1個染色體13；在一個染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少1個染色體14；未知起源的額外材料替代2個染色體17上來自p13的區(qū)段；由易位產生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體1和18的區(qū)段；缺少1個染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；缺少1個染色體22；4個額外的不同的標記物染色體，(b)由于隨機喪失，克隆2含有65-67個染色體(染色體模式數是67)，且具有與克隆1類似的染色體特征，例外是，克隆1的缺失的染色體4被確定的衍生染色體4置換，后者涉及染色體4和另一個未鑒別的染色體的區(qū)段，(c)克隆3與克隆1基本上相同，但是缺少衍生染色體1，且存在源自染色體1和4的區(qū)段的不同衍生染色體4。由于隨機喪失，它含有67-68個染色體，模式數為67，(d)克隆4與克隆1基本上相同，但是缺少衍生染色體1，且存在由易位產生的不同衍生染色體1，所述易位涉及染色體1和4的區(qū)段。僅存在2個正常染色體5’s和一個衍生染色體5，后者似乎是隨體化的(satellited)5q。圖28.kwt-1三雜交體系(源自無限增殖的髓樣細胞和b淋巴樣細胞和原代成熟的cd4+t輔助細胞的kwt三雜交體)的核型分析，顯示了接近六倍體的單個克隆，其具有129-140染色體的模式數和下述的染色體異常：缺少2個x染色體；缺少1個染色體1；缺少1個染色體2；染色體2的長臂中的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少2個染色體3；缺少1個染色體4；衍生染色體4，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q35的區(qū)段；一個額外的染色體5同源物；染色體5的2個額外的衍生物，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q11.2的區(qū)段；一個額外的染色體6同源物；額外的染色體6，其具有染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；一個額外的染色體7同源物；2個染色體7，它們具有染色體7的短臂的臂內倒位，其涉及帶p13和p22；由易位產生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體1和8的區(qū)段；缺少2個染色體9；染色體9的短臂從帶p13的末端缺失；2個由易位產生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個染色體9的區(qū)段；由易位產生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少1個染色體12；一個染色體13，其具有在一個染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少2個染色體14；由易位產生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；缺少1個染色體15；缺少1個染色體17；2個染色體17，其用未知起源的額外材料替代來自2個染色體17上的p13的區(qū)段；2個染色體17，其具有來自q22-q23的區(qū)段的重復；缺少2個染色體18；額外的染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；缺少1個染色體22；7個額外的標記物染色體，它們具有標記物染色體2的2個拷貝。圖29.kwt-2(源自無限增殖的髓樣細胞和b淋巴樣細胞和原代記憶cd3+cd5+t細胞的kwt三雜交體系)的核型分析，顯示了接近六倍體的單個克隆，其具有135-142染色體的模式數和下述的染色體異常：缺少2個x染色體；缺少1個染色體1；缺少1個染色體2；染色體2的長臂中的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少2個染色體3；缺少1個染色體4；衍生染色體4，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q35的區(qū)段；一個額外的染色體5的同源物；染色體5的2個額外的衍生物，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q11.2的區(qū)段；一個額外的染色體6的同源物；額外的染色體6，其具有染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；2個染色體7，它們具有染色體7的短臂的臂內倒位，其涉及帶p13和p22；由易位產生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體1和8的區(qū)段；缺少2個染色體9；染色體9的短臂從帶p13的末端缺失；2個由易位產生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個染色體9的區(qū)段；由易位產生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少1個染色體12；一個染色體13，其具有在一個染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少2個染色體14；由易位產生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；缺少1個染色體15；缺少1個染色體17；2個染色體17，它們用未知起源的額外材料替代在2個染色體17上的來自p13的區(qū)段；2個染色體17，其具有來自q22-q23的區(qū)段的重復；缺少2個染色體18；額外的染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；缺少1個染色體22；8個額外的標記物染色體，它們具有標記物染色體2的2個拷貝。圖30.kwt-3三雜交體系(源自無限增殖的髓樣細胞和b淋巴樣細胞和原代雙陽性的cd4+cd8+t細胞的kwt三雜交體)的核型分析，顯示了3個克隆，它們是染色體模式數為124-139的超五倍體(hyperpentaploid)。(a)克隆1具有下述的染色體異常：3個x染色體和單個y染色體；額外的染色體1；2個額外的染色體2；染色體2的長臂中的臂內倒位，其涉及帶q33和q35；缺少1個染色體3；額外的由易位產生的染色體5衍生物，所述易位涉及染色體5和未知起源的染色體；額外的染色體6；染色體6的短臂在帶p21.2和p23之間的區(qū)段的重復；染色體7的短臂的額外的臂內倒位，其涉及帶p13和p22；由易位產生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體1和8的區(qū)段；染色體9的短臂從帶p13的末端缺失；由易位產生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個染色體9的區(qū)段；2個額外的染色體10；2個由易位產生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；2個額外的染色體13；在一個染色體13的短臂上的額外的未知起源的染色體材料；缺少1個染色體14；由易位產生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；額外的未知起源的材料，其替換來自3個染色體17上的p13的區(qū)段；來自q22-q23的區(qū)段中的染色體17的2個染色體重復；額外的染色體18；由易位產生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體1和18的區(qū)段；額外的染色體19；缺少1個染色體20；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體1和21的區(qū)段；5個額外的標記物染色體，它們具有每個標記物染色體4和5的2個拷貝。(b)克隆2具有與克隆1類似的染色體異常，但是它喪失一個染色體9。(c)克隆3含有與克隆2相同的染色體異常，但是染色體2的長臂中的臂內倒位被替換為等臂衍生(isoderivative)染色體2，后者因涉及衍生染色體2的等臂染色體的形成而產生，所述衍生染色體2由長臂中的臂內倒位產生，其涉及帶q33和q35。圖31.wwm三雜交體(a)和它的cd14富集的亞系(b)的核型分析，顯示了單個優(yōu)勢克隆，這將它的存在從在原始的wwm三雜交體中的55％增加至在它的cd14富集的亞系中的95％。每個具有47染色體的模式數和下述的染色體異常:由易位產生的染色體8衍生物，所述易位涉及來自染色體1和8的區(qū)段；額外的染色體13同源物；由易位產生的染色體14衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；染色體17的來自q22-23的區(qū)段的重復；由易位產生的衍生染色體21，所述易位涉及來自染色體3和21的區(qū)段。原始的wwm三雜交體和它的cd14+富集的亞系之間的唯一差別在于，這些異常存在于僅55％的原始wwm細胞中和95％的cd14富集的亞系細胞中。wwm三雜交體中的剩余細胞是從接近三倍體(具有隨機的染色體喪失)至接近四倍體(具有隨機的染色體喪失)。圖32.來自progm培養(yǎng)物的上清液的蛋白印跡。給泳道1和2分別裝載未活化的和活化的4天人t淋巴細胞培養(yǎng)物的上清液。泳道4和5分別含有在沒有或有衣霉素存在下培養(yǎng)的progm培養(yǎng)物的上清液。在泳道3中使用非表達-gm-csf的細胞的上清液。作為參照，在泳道6中使用源自大腸桿菌(e.coli)的重組hgm-csf(10ng)。圖33.由progm雜交體系生產的人gm-csf的凝膠電泳。從在有(泳道3和4)和沒有(泳道1和2)衣霉素存在下培養(yǎng)的樣品得到progm雜交體系的細胞上清液，對其進行使用大鼠抗-人gm-csf抗體(泳道1和3)和大鼠抗-小鼠gm-csf抗體(泳道2和4)的免疫沉淀。通過銀染色，使蛋白顯影。圖34.cd4和cd54在procd54細胞系和它的cd54富集的亞系procd54ex的表面上的表達；(a)100％的procd54細胞保持cd4的表達。細胞群體中的大約72％也是cd54陽性的，表達水平從低至高。門控和分選出42％的具有cd4+cd54+表型特征的細胞群體，所述細胞群體的cd54表達水平從中等至高；(b)cd4和cd54在原始procd54的分選的cd4+cd54+亞系的表面上的表達分析表明，在培養(yǎng)超過6個月以后，98％的細胞仍然是兩種標記物陽性的。圖35.由procd54和procd54ex細胞分泌的可溶的人cd54的蛋白印跡。使用kwt三雜交體配偶體細胞系的細胞作為對照。procd54和procd54ex細胞脫落大約82kda的可溶形式的cd54。圖36.procd54和procd54ex細胞中icam-1基因表達的rt-pcr分析。圖37.在轉染后24、48和72小時，來自用hil4-rα鏈瞬時轉染的kbt三雜交細胞系的細胞提取物的蛋白印跡分析。用100ng/mlhil4刺激的人pbml和未轉染的kbt細胞分別用作hil4-rα鏈的陽性對照和陰性對照。圖38.用于檢測被hil-2轉染的kbt三雜交細胞中的hil-2mrna的pcr輸出。表達水平類似于來自cd8+人t淋巴細胞和jurkat細胞的那些。未轉染的kbt細胞和k562細胞用作陰性對照。圖39.(a)原始的kbt三雜交細胞和(b)kbttr-il2細胞中的細胞內hil-2的facs分析。大約41％的kbt細胞是cd69活化分子陽性的。92％的kbttr-il2細胞是細胞內hil-2(r1+r2)染色陽性的。hil-2陰性的細胞是cd69陽性群體的一部分，而cd69陰性的細胞都是細胞內hil2陽性的。圖40.在hgm-csf親和吸收以后，進行rp-hplc得到的洗脫圖。圖41.在hgm-csf親和免疫吸收以后，進行rp-hplc所收集的級分的sds-page(下圖)和蛋白印跡(上圖)。蛋白印跡揭示級分之間由pro-gm-sf分泌的hgm-csf的分子量概況的變化。在24-28分鐘洗脫的級分對應著rp-hplc洗脫圖上的第一個峰，在29-31分鐘之間收集的級分代表第二個峰，而第三個峰落進在34-36分鐘之間收集的級分。圖42.從pha活化的人淋巴細胞培養(yǎng)物分離cd4+細胞：(a)從剩余的細胞群體門控(r1)和分選用抗人cd4-fitc標記的細胞。進一步分析分選的細胞的純度；(b)分選的群體中100％的細胞是cd4陽性的。圖43.源自pro-gmsf的去糖基化的hgm-csf的凝膠電泳。將純化的hgm-csf暴露于phgasef消化不同的時間段。溫育時間是：泳道1-0min，泳道2-10min，泳道3-20min，泳道4-40min。泳道5–源自大腸桿菌的重組人gm-csf。通過銀染色，使蛋白顯影。指示了分子量標記物。圖44.小鼠骨髓瘤sp2細胞系的tfr+細胞的鑒別和分選。圖45.來自用抗-小鼠cd4和cd8染色的(a)外周血和(b)脾的小鼠單核的細胞的facs概況。門控的區(qū)域r1和r3代表單個陽性的效應輔助(cd4+cd8-)t細胞和細胞毒性(cd8+cd4-)t細胞，而r2含有雙陽性的(cd4+cd8+)t細胞。圖46.通過磁珠負選擇從外周血分離出的小鼠單核細胞的純度概況。100％的分離的細胞是cd11b陽性的，且同時，這些細胞中超過98％是b220、cd90、cd49b和nk1.1陰性的。大約38％的cd11b+細胞在它們的表面上表達低水平的ly5g。圖47.cd138、cd4和cd11b在stmmm三雜交體上的表達的facs概況，所述stmmm三雜交體源自1個sp2的淋巴樣無限增殖細胞、原代小鼠cd4+t細胞和cd11b+單核細胞。通過cd138在100％的三雜交細胞上的表達(a)和(b)，證實b淋巴譜系的表型。細胞群體中至少82％表達所有3個cd標記物，僅5％的細胞是cd138陽性的，而不共表達cd4或cd11b。圖48.cd138、cd8和cd11b在stmmm三雜交體上的表達的典型facs概況，所述stmmm三雜交體源自1個sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細胞、原代小鼠細胞毒性cd8+t細胞和小鼠cd11b+單核細胞。盡管在97-100％的三雜交細胞上證實了小鼠cd138的表達(a)和(b)，分別在三雜交細胞群體中的56％和57％上檢測到t細胞和單核細胞標記物的共表達。整個三雜交體群體中的大約40％共表達所有3個標記物(c)，且僅14％在它們的表面上既不表達cd8也不表達cd11b。圖49.cd138、cd8和cd11b在stmmm三雜交體上的表達的典型facs概況，所述stmmm三雜交體源自1個sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細胞、1個原代小鼠雙陽性的cd4+cd8+t細胞和1個原代小鼠cd11b+單核細胞。三雜交細胞群體中的98-100％是cd138陽性的，群體中的93％也是cd8陽性的(b)。整個細胞群體中的大約57-60％同時是cd138、cd8和cd11b陽性的。圖50.cd4和cd8在stmmm三雜交體表面上的表達的典型概況，所述stmmm三雜交體源自1個sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細胞、1個原代小鼠雙陽性的cd4+cd8+t細胞和1個原代單核細胞。盡管95％的細胞是cd8陽性的，但三雜交體群體中的僅50％共表達cd4和cd8。值得注意的是，實際上整個cd4+群體也是cd8陽性的。圖51.cd138和cd11b在ssmm三雜交體表面上的表達的典型概況，其中三雜交體群體中的93％顯示出cd138陽性染色，70％的細胞共表達cd11b。圖52.人cd71和小鼠tfr在swmm(a)和swmh(b)三雜交體表面上的表達的典型概況。不論單核細胞的小鼠或人來源，100％的三雜交體是人和小鼠運鐵蛋白受體陽性的。圖53.小鼠cd138以及小鼠cd11b或人cd14在swmm(a)和swmh(b)三雜交體上的表達的典型概況。小鼠cd138的表達似乎依賴于單核細胞的小鼠或人來源。盡管84％的swmm三雜交體是小鼠cd138陽性的，但僅29％的swmh在它們的表面上具有小鼠cd138。圖54.人cd19和人cd14在swmh嵌合的三雜交體的表面上的表達的facs概況，顯示了96％的細胞表達人cd19，66％共表達人cd14。圖55.一個單細胞操作/遞送系統(tǒng)。圖56.一個玻璃微量移液管。圖57.一個微電極。圖58.2個平行的微電極。圖59.在組織培養(yǎng)板的孔中的2個微電極。圖60.含有處于2微電極中間的3個細胞的孔的頂視圖。圖61.圖60的孔的側視圖。圖62.在用第二種蛋白hil-2穩(wěn)定轉染之前(a)和之后(b)，cd25和sigm在雜交細胞表面上的表達，所述雜交細胞通過雜交1個kbt細胞和1個shigm+cd25+b細胞而產生。具體實施方式參考附圖，下面的非限制性實施例進一步描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。實施例11.細胞選擇、細胞操作和單細胞克隆下面的實施例描述了細胞制備，包括用于產生跨譜系三雜交體和用于表達所需蛋白的哺乳動物細胞系和原代細胞的選擇和分離(或分選)。特定選擇技術的挑選，無論如何不是限制性的，而是指示性的，所述選擇技術用于得到具有特定特征的細胞的純群體，或使用特定標記物(或多個標記物)來分離具有特定表型的細胞。其它細胞標記物或分選程序可以用于產生類似的結果。1.1.從哺乳動物細胞系選擇細胞作為癌基因來源在標準的(正常的)條件下，在co2培養(yǎng)箱中，在37℃，在濕潤的5％co2氣氛中，使用改良的rpmi1640(roswellparkmemorialinstitute培養(yǎng)基)，懸浮培養(yǎng)所有無限增殖的細胞系(參見下面)，所述培養(yǎng)基含有nahco3(jrhbiosciences)、20mmhepes(sigma)、4mml-谷氨酰胺(sigma)，并補加了10％胎牛血清fcs(jrhbiosciences)。除非另外說明，這里描述的組織培養(yǎng)基(tc培養(yǎng)基)是用于培養(yǎng)本發(fā)明的所有無限增殖細胞系、原代癌細胞、原代細胞培養(yǎng)物和確立的三雜交細胞系的標準培養(yǎng)基。一般而言，在不含抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)使用的所有細胞系、原代癌細胞和原代細胞。但是，當懷疑存在細菌和/或真菌污染的高風險時，在標準培養(yǎng)基中包含2％青霉素(5000單位)/鏈霉素(5mg)溶液(sigma)。人細胞系可以用于本發(fā)明中的人細胞系如下：a)髓共同祖細胞譜系,k562(源自人慢性髓細胞性白血病的細胞系)，b)t淋巴譜系,molt4(人t淋巴母細胞)，和c)b淋巴譜系,wil2ns(人b淋巴母細胞)。非人細胞系可以用于本發(fā)明中的非人細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系-sp2(b淋巴細胞漿細胞)。1.1.1.單細胞遞送系統(tǒng)細胞分離或分選、細胞操作和單細胞克隆是本發(fā)明自始至終的基本過程。在這里，我們描述了為了操作和/或克隆單個目標細胞而確立的單細胞遞送系統(tǒng)。所述細胞遞送系統(tǒng)(圖55)主要由玻璃微量移液管、1ml注射器和一維粗操作器(coarsemanipulator)組成。圖56顯示了用于獲得單個目標細胞的l-形玻璃微量移液管。移液管由血細胞比容毛細管制成，其長度為75毫米(mm)，外徑和內徑分別為1.5mm和1.10mm。通過加熱，拉伸管的一個末端，從而得到這樣的尖端(1)：其具有大約250-300微米(μm)的內徑，尖端壁厚為大約30μm。微量移液管的另一個末端保持未改變(2)。在所述的細胞遞送系統(tǒng)(圖55)中，注射器(4)安裝在粗操作器上，后者又安裝在磁性架(16)上。該系統(tǒng)以這樣的方式工作：注射器的柱塞(6)可以被迫相對于注射器非常緩慢地向前或向后移動。為了操作單個目標細胞，必須使用柔性的醫(yī)學級管(3)，將注射器連接至微量移液管的未改變的末端(2)，如圖所示。必須通過用70％乙醇沖洗幾次，將單細胞遞送系統(tǒng)滅菌，最后沒有氣泡地充入適當的組織培養(yǎng)基或溶液(根據無論什么需要)，然后進行任何細胞操作。1.1.2.單細胞克隆通過單細胞克隆，確立來自每個細胞系的細胞的克隆。下面描述了在本發(fā)明中使用的克隆或操作任意生物學細胞的單個細胞(例如，k562細胞系的細胞)的技術。將5μlk562細胞的細胞懸浮液從它的對數期培養(yǎng)物取出，并放入組織培養(yǎng)96-孔板(tc板,bectonanddickinson或bd)的孔中，所述孔含有150μltc培養(yǎng)基。該孔被命名為“細胞儲存孔”。將板放在倒置顯微鏡(axiovert40c,carlzeiss)的xy顯微鏡載物臺上。在單細胞操作/克隆過程前，給微量移液管(圖56)沒有氣泡地完全充滿tc培養(yǎng)基。將單細胞遞送系統(tǒng)的微量移液管、管和注射器(圖55)安裝在一維粗操作器(narishege)上。以使尖端位于顯微鏡的光學視野中心的方式，排列微量移液管尖端(1)。為了操作和克隆單個k562細胞，將微量移液管插入細胞儲存孔中。通過在抽吸方向非常緩慢地移動注射器的柱塞，將單個k562細胞放置在微量移液管中。從細胞儲存孔收回微量移液管。通過使顯微鏡載物臺從細胞儲存孔側向移動至鄰近的孔(命名為“克隆孔”)，并隨后將微量移液管插入該克隆孔中，然后將微量移液管中的單個細胞輕輕從微量移液管釋放出來。這通過在釋放方向非常緩慢地移動注射器的柱塞來實現。將從細胞儲存孔取出單個細胞并將所述單個細胞放入克隆孔中的過程重復多次，直到每個tc板得到60個單細胞克隆。在運行于37℃、5％co2的濕潤培養(yǎng)箱(thermolinescientific)中溫育克隆板10天的時段。在溫育時間段過程中，定期地用新鮮的tc培養(yǎng)基補充每個克隆孔中的培養(yǎng)基。每24小時，記錄來自每個克隆孔的每個克隆的細胞增殖。在溫育時間段結束時，確立k562細胞的許多克隆。選擇具有最高增殖速率或最高目標標記物(其在細胞表面上表達，例如，在k562細胞上的cd71運鐵蛋白受體)水平的克隆，用于三雜交體生產或其它實驗。1.1.3.cd71+細胞的分選作為一個實例，下面的方法描述了使用熒光激活細胞分選儀(facs)從k562細胞系中進行cd71陽性細胞的細胞選擇和分選。與20μl藻紅蛋白(pe)綴合的抗-cd71(bdpharmingen)或pe綴合的同種型對照抗體igg2a,κ(bdpharmingen)一起，將懸浮于100μl磷酸鹽緩沖溶液(dulbecopbs)中的1x105k562細胞在暗處在室溫溫育30分鐘，所述磷酸鹽緩沖溶液含有2％牛血清清蛋白bsa(sigma)。用1mlpbs稀釋溫育混合物，且通過在300g離心10分鐘，收集染色的細胞。在用1mlpbs洗滌另外一次以后，將染色的細胞懸浮于1mlpbs中，并立即使用facs(bdfacscalibur)進行分析。圖1顯示了k562細胞系的cd71+細胞的概況。門控并分選cd71+陽性的細胞(圖1a)。原始的k562群體中大約65％是cd71陽性的。將分選的細胞在300g離心10分鐘，并懸浮于1mlpbs中，用于進一步的實驗。收集100ml懸浮的cd71+-分選的細胞用于純度分析，如圖1b所示。得到cd71+分選的細胞的99％純度。在細胞分選以后，將k562細胞系的cd71+細胞用于進一步的實驗，或置于在標準培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)物中，并標記為cd71-富集的k562細胞。使用相同的方法，確立cd71-富集的wil2ns和cd71-富集的molt4培養(yǎng)物。1.1.3.1.從k562培養(yǎng)物分選骨髓單核細胞譜系的cd71+細胞為了確保用于細胞雜交實驗的細胞的骨髓單核細胞表型，使用facs分析和隨后的分選，進一步富集cd71+k562細胞中的cd15+細胞。為此目的，用pe抗-人cd71和fitc抗-人cd15(bdpharmingen)標記從在第1.1.3部分中所述的方法得到的cd71-富集的k562細胞。與20μl抗-人cd71-pe和抗-人cd15-fitc抗體或陰性同種型對照抗體或fitc和pe標記的陰性同種型對照抗體一起，將懸浮于100μl含有2％bsa的pbs中的1x105洗過的cd71-富集的k562細胞在暗處在室溫溫育30分鐘。用1mlpbs稀釋溫育混合物，且通過在300g離心10分鐘，收集染色的細胞。在用1mlpbs洗滌另外一次以后，將染色的細胞懸浮于1mlpbs中，且立即使用facscalibur(bd)進行分析。典型的facs概況示于圖2a。在培養(yǎng)5個月以后，99％的cd71-富集的k562細胞保持cd71陽性，其中大約18％表達表面cd15。門控cd71和cd15陽性的細胞(圖2a)，并分選。通過在300g離心10分鐘，收集分選的細胞，并懸浮于1mlpbs中，用于進一步實驗。收集100μl懸浮的cd71+cd15+分選的細胞，用于純度分析。在2個月培養(yǎng)以后，關于cd71和cd15的共表達，重新分析分選的細胞(圖2b)。結果表明，大約98％的純化的細胞保持cd71和cd15。已經發(fā)現，一些在早期在表面上表達cd71和cd15的細胞已經喪失它們的cd15表達(圖2b)，從而提示，k562細胞中向骨髓單核細胞譜系的定型是不穩(wěn)定的和可逆的。1.1.4.從小鼠sp2細胞系選擇運鐵蛋白受體陽性的細胞當在三雜交體的產生中使用小鼠骨髓瘤細胞系sp2時，該群體富集表達小鼠運鐵蛋白受體(tfr)(人cd71的類似物)的細胞。遵循與第1.1.3部分(其描述了人細胞系中cd71+細胞的富集)基本上相同的規(guī)程，但是使用fitc-綴合的大鼠抗-小鼠tfr抗體(abcam)替代pe-綴合的小鼠抗-人cd71。相應地調節(jié)同種型對照。圖44顯示了sp2細胞系的tfr+細胞的概況。門控并分選tfr+陽性的細胞(圖44a)。原始的sp2群體中大約45％是tfr陽性的。將分選的細胞在300g離心10分鐘，并懸浮于1mlpbs中，用于進一步實驗。收集100ml懸浮的tfr+-分選的細胞用于純度分析，如圖44b所示。得到tfr+分選的細胞的99.5％純度。在細胞分選以后，將sp2細胞系的tfr+細胞用于進一步的實驗，或置于在標準培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)物中，并標記為tfr-富集的sp2細胞。1.2.從原代癌細胞選擇細胞作為癌基因來源作為一個實例，下面的方法描述了從急性髓細胞性白血病(aml)患者得到的骨髓樣品的髓性譜系選擇轉化的細胞。相同的方法也適用于從對應的血液惡性腫瘤的骨髓樣品選擇其它譜系的細胞。在知情同意以后，從aml患者得到骨髓抽吸物。從患者提取樣品，所述患者在進行實驗以前已經確診aml。使用與第1.3.1部分所述相同的密度梯度離心程序，分離出aml單核的細胞，并使用facs，從樣品分選或分離cd34+細胞。為了染色或標記上面得到的單核的細胞，將10μl小鼠抗-人cd34-pe抗體(bdpharmingen)或pe同種型對照抗體(bdpharmingen)添加到1x106單核的細胞在染色培養(yǎng)基(pbs+5％bsa)中的100μl給定的等分試樣中。對于給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將10ml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到細胞沉淀中，并在350g和4℃離心7min。抽吸上清液，然后通過輕打管，重新懸浮細胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。將標記的細胞懸浮于染色培養(yǎng)基中，并應用facs。在設定cd34+細胞群體的適當分選門以后，收集細胞級分。對于富集培養(yǎng)物，將40x103細胞的cd34+-富集的細胞鋪平板于用合成的胞外基質預包被的12孔板中。在補加了57mmβ-巰基乙醇(sigma)、1mm氫化可的松和20ng/ml人il-3和人g-csf的完全tc培養(yǎng)基中，增殖細胞。培養(yǎng)48小時以后，使用facs，針對cd15表達來進一步選擇細胞。對于熒光-細胞染色，使用小鼠抗-人cd15-fitc(bdpharmingen)和小鼠抗-人cd34-pe(bdpharmingen)，且也采用在在該部分前面的內容中描述的類似的細胞染色方法。使用facs，分析染色的樣品。在為cd34和cd15陽性的細胞群體(cd34+cd15+)或為cd34陽性和cd15陰性的細胞群體(cd34+cd15-)設定適當的分選門以后，收集級分。培養(yǎng)48小時以后cd15在cd34+aml細胞上的表達的概況顯示于圖3中。大約54％的aml單核的細胞被測試為cd15陽性的，同時維持它們的cd34表達，而細胞群體的剩余部分保持它的cd34表達，沒有定型為骨髓單核細胞譜系。在該實驗中使用cd34+cd15+細胞，用于確立三雜交體。1.3.原代細胞原代細胞可以源自任意淋巴組織，諸如外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體和局部淋巴結。作為第一步，處理所有淋巴組織，以分離單核的細胞。1.3.1.從骨髓、外周血或臍帶血分離人單核的細胞在知情同意以后，從健康個體收集外周血樣品。將每個血液樣品收集在肝素化(heparinised)的管(vacutainer,bd)中，合并，并在rpmi1640中稀釋。從經歷骨髓活組織檢查且具有正常骨髓、沒有任何血液異常的患者，得到人骨髓抽吸物。以1:3的比例，用rpmi1640稀釋樣品。在知情同意以后，從正常的足月產道分娩，得到人臍帶血樣品。在分娩嬰兒和結扎臍帶以后，在娩出胎盤之前，用肝素化的60ml注射器，收集每份臍帶血。在rpmi1640中稀釋每份樣品。通過在ficoll-paque(amershampharmacia)上的密度離心，制備外周血單核細胞(pbmc)、骨髓單核的細胞(bmmc)和臍帶血單核的細胞(ucbmc)。簡而言之，使用附著至20ml注射器的套管，在20ml細胞懸浮液下，分層10mlficoll-paque。在1,700rpm(700g)在4℃離心樣品細胞40分鐘。收集在界面中的細胞，且通過在2,000rpm(1,000g)離心10分鐘，在50mlrpmi1640中洗滌。拋棄上清液，將沉淀的細胞重新懸浮于40mlrpmi1640中，并在1,300rpm(400g)離心10分鐘。如下分別取出紅血細胞和血小板：用0.83％(wt/vol)nh4cl裂解，并在用pbs以1:2比率稀釋的ficoll-paque上進行第二次離心。分離的單核的細胞用于培養(yǎng)或分析，并通過facs或磁珠分離系統(tǒng)，分選成細胞特異性的級分。1.3.2.從實體淋巴組織分離人單核的細胞下面的方法描述了在本發(fā)明中使用的從脾、胸腺、扁桃體或局部淋巴結分離單核的細胞的程序。也給出了用于細胞染色和分選的方法。遵循國家倫理方針，從器官移植供體得到脾樣品。在分離脾細胞之前，將各自大約2x2x3cm的脾塊于4℃保存在rpmi1640中。使用注射器的柱塞，穿過無菌篩目，將每個塊切成小塊。然后通過用在完全培養(yǎng)基中的20u/mlvii型膠原酶(sigma)和20u/mldna酶(sigma)在室溫消化30分鐘，酶促地解離細胞。通過添加edta達到10mm，并在室溫攪拌5分鐘，進一步解離細胞團塊。然后用完全培養(yǎng)基洗滌脾細胞2次，以停止酶促消化，并重新懸浮于rpmi1640中。與非酶促解離程序(mcilroy等人1995)相比，這些條件不影響表面分子表達。通過在第1.3.1部分中描述的密度梯度離心(但是紅血細胞的取出除外)，從這些脾細胞懸浮液分離脾單核的細胞。將脾單核的細胞重新懸浮于rpmi1640中，且將細胞濃度調節(jié)至1x106細胞/ml。通過錐蟲藍排除，測得細胞生存力超過98％。在他們的父母知情同意以后，從經歷心臟外科手術的兒童獲得胸腺。如下從胸腺分離出胸腺細胞：破裂胸腺組織，并使用填充了rpmi1640培養(yǎng)基的注射器，沖洗胸腺細胞脫離組織。通過上述的密度梯度-離心，純化胸腺細胞。在知情同意以后，從因為炎性病癥而經歷扁桃體切除術的患者得到扁桃體。將組織樣品保存在冰上的完全培養(yǎng)基和250μg/ml慶大霉素中，并在3小時內處理。在去除上皮層以后，將扁桃體組織切成塊，并通過截斷轉移移液管，輕輕抽吸組織塊。然后使用與前面在脾單核細胞的分離中所述相同的程序，分離扁桃體細胞。1.3.3.從源自各種組織的單核的細胞分離譜系特異性的原代細胞使用facs分析和細胞分選或磁性細胞分選，通過標準程序，分離b淋巴譜系、t淋巴譜系和髓譜系的人細胞。下面給出了用于從各種組織分離譜系特異性的原代細胞的細胞染色和分選的非限制性實例。1.3.3.1.從人脾和外周血分離b細胞、輔助t細胞和骨髓單核細胞如第1.3.1部分所述，初步處理組織樣品，以提取單核的細胞群體。然后在分離單核的細胞群體的4小時內，進行熒光-細胞染色，繼之以細胞分選。在標準培養(yǎng)條件下(參見第1.1部分)，將細胞懸浮于完全培養(yǎng)基中，直到染色。1.3.3.1.1.源自各種組織的原代成熟b細胞、效應t細胞和骨髓單核細胞的細胞染色和分選下面是來自原代細胞的b和t細胞的染色和分選的實例。通常，b細胞和輔助t細胞的選擇分別基于cd19和cd4的表面表達，而骨髓單核細胞的選擇是基于cd14和/或cd16的表面表達。簡而言之，將各10μl的小鼠抗-人cd19-fitc抗體(bdpharmingen)和小鼠抗-人cd4-pe抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照添加到單核的細胞在染色培養(yǎng)基(pbs+5％bsa)中的100μl等分試樣中，每份等分試樣含有1x105細胞。對于單核的細胞群體的給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將10ml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到染色混合物中，且在350g和4℃離心7分鐘。抽吸上清液，且然后通過輕打管，重新懸浮細胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。對于其它等分試樣，重復該過程。使用facs，分析染色的細胞。對于每個樣品，分析至少20,000個門控的事件。在為cd19陽性的b細胞群體(cd19+cd4-)或為cd4陽性的t細胞群體(cd4+cd19-)設定適當的分選門以后，收集級分。收集1ml每個級分用于純度分析，并將每個級分的剩余部分重新懸浮于完全培養(yǎng)基中，用于進一步實驗。1.3.3.1.2.分選的細胞群體的回收和分析使用適當的銜接頭，將少數細胞(≤5×105細胞)直接地分選進微量離心管中。在分選之前，向回收管中添加小體積(0.1-0.2ml)的補料rpmi1640，以與分選的樣品混合，并提高分選的細胞的生存力。在分選以后，只要回收的細胞的數目允許，用染色培養(yǎng)基以1:10稀釋20μl每個分選的細胞樣品用于重新分析，以驗證它的純度?？山邮艿募兌仁恰?5％。添加另外20-40μlfcs/ml的分選的樣品，且隨后在350g、4℃離心7min。然后將細胞重新懸浮于標準的組織培養(yǎng)基中。如果可得到足夠的細胞，則對它們計數，以測定得率。用抗-人cd19-fitc和抗-人cd4-pe標記的脾樣品的facs概況示于圖11a，而分選的cd19+b細胞和cd4+t細胞的純度分析的概況示于圖11b和11c(參見kbt雜交體表征)。級分中的細胞純度超過98％(對于cd19+細胞而言)和96％(對于cd4+細胞而言)。來自外周血的cd19+和cd4+細胞的分選和純度概況與來自脾樣品的那些基本上類似，僅得到更少數目的每種細胞群體。對于人單核細胞和骨髓單核細胞的分離，首先根據生產商的說明書，使用人cd14磁珠macs(miltenyibiotecgmbh)，排除單核的細胞群體中的cd14陰性的細胞。用小鼠抗-人cd16-pe(bdpharmingen)和小鼠抗-人cd14-percp(bdpharmingen)抗體，進一步染色或標記陽性地選擇的cd14細胞。上面已經描述了細胞染色和分選以及回收分選的細胞的方法(參見第1.3.3.1.1部分和第1.3.3.1.2部分)。使用facs，分析染色的樣品。分析至少20,000個門控的事件。使用macs珠關于cd14陽性選擇的總細胞中的大約86％是cd14陽性的?；赾d16的表達，將cd14+群體進一步分成3個組：代表大部分cd14+細胞的cd14hcd16-；cd14hcd16l和cd14hcd16h細胞的少數群體。級分中的細胞純度超過98％(對于cd14hcd16-而言)、96％(對于cd14hcd16l而言)和92％(對于cd14hcd16h而言)。在設定適當的分選門以后，收集下述細胞群體：cd14hcd16-、cd14hcd16l和cd14hcd16h細胞級分。圖4顯示了用小鼠抗-人cd16-pe和小鼠抗-人cd14-percp標記的cd14富集的樣品的facs概況。來自脾組織的cd14+細胞的細胞分選和純化的方法與來自外周血樣品的那些基本上相同，但是得到更少數目的每個細胞群體。1.3.3.2.從人臍帶血分離cd5陽性的(抗原處理過的)b細胞和cd5陰性的(幼稚)b細胞如在第1.3.1部分中所述，從臍帶血樣品制備單核的細胞。在單核的細胞群體分離的4小時內，進行熒光-細胞染色，繼之以細胞分選。在該具體實施例中，根據前面(第1.3.3.1.1部分)所述的方法，使用小鼠抗-人cd5-fitc抗體(bdpharmingen)、小鼠抗-人cd19-pe抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照，從人臍帶血分選cd5陰性的(幼稚)b細胞和cd5陽性的(抗原處理過的)b細胞。使用facs，分析染色的樣品。對于每個樣品，分析至少20,000門控的事件。在為cd5陰性的b細胞群體(cd19+cd5-)或為cd5陽性的b細胞群體(cd19+cd5+)群體設定適當的分選門以后，收集許多級分。圖5顯示了用小鼠抗-人cd19和小鼠抗-人cd5染色的樣品的典型概況。樣品中b細胞的百分比范圍是4-19.2％，且cd5+b細胞占總循環(huán)的淋巴細胞的0.8-7.2％。1.3.3.3.從人臍帶血分離cd5陽性的(抗原處理過的)t細胞和cd5陰性的(幼稚)t細胞使用與在第1.3.1部分中所述類似的方法，從臍帶血樣品提取單核的細胞。在單核的細胞群體分離的4小時內，進行熒光-細胞染色，繼之以細胞分選。在該具體實施例中，根據前面(第1.3.3.1.1部分)所述的細胞方法，使用小鼠抗-人cd5-fitc抗體(bdpharmingen)、小鼠抗-人cd3-pe抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照，從人臍帶血分選cd5陽性的(抗原處理過的)t細胞和cd5陰性的(幼稚)t細胞。使用facs，分析染色的細胞。分析至少20,000門控的事件。設定分選門，以收集含有cd5陰性的t細胞(cd3+cd5-)或cd5陽性的t細胞(cd3+cd5+)的級分。圖6顯示了用小鼠抗-人cd3和小鼠抗-人cd5抗體染色的樣品的典型概況。回收和分析分選的群體實際上，用于回收和分析分選的群體的相同方法已經描述在第1.3.3.1.2部分中。樣品中t細胞的百分比范圍是1.7-13.5％，且cd5+t細胞占總循環(huán)的淋巴細胞的0.4-1.3％。1.3.3.4.基于cd20和cd72表達從人骨髓單核的群體分離早期b細胞、活化的和靜息b細胞使用前面(第1.3.1部分)所述的方法，從骨髓提取單核的細胞。在單核的細胞群體分離的4小時內，進行熒光-細胞染色，繼之以細胞分選?；罨腷細胞的染色和分選以前描述在第1.3.3.1.1部分。具體地，使用10μl小鼠抗-人cd72-fitc抗體(bdpharmingen)和20μl小鼠抗-人cd20-pe抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照(pe小鼠igg2b,κ抗體)。使用facs，分析染色的細胞。設定分選門，以收集含有下述群體的級分：包含前b細胞、靜息和活化的b細胞、濾泡樹突細胞的cd20陽性群體(cd20+cd72-)，或包含早期b細胞(cd20-cd72+)或活化的b細胞(cd20+cd72+)的cd72陽性的細胞群體。圖7顯示了用小鼠抗-人cd20和小鼠抗-人cd72抗體染色的樣品的典型概況?；厥蘸头治龇诌x的群體實際上，將在第1.3.3.1.2部分中描述的相同方法用于回收和分析分選的群體。通常，骨髓單核的細胞群體中的大約10-15％是cd20和cd72陽性的；9-12％的細胞是cd20陽性的，但是cd72陰性的；且僅大約8％是cd72陽性的。1.3.3.5.通過磁珠分選分離出胸腺細胞亞群使用macscd4multisort試劑盒(miltenyibiotecgmbh)，根據生產商的說明書，分選cd4-cd8-雙陰性的胸腺細胞、cd4+cd8+雙陽性的胸腺細胞和cd4+和cd8+單陽性的胸腺細胞群體。簡而言之，與cd4multisortcd4微珠一起，溫育使用與在第1.3.2部分中所述類似的方法收集的胸腺細胞30分鐘。用在pbs中的5mmedta和0.5％bsa洗滌以后，在磁性柱上分離標記的細胞。陽性選擇的胸腺細胞(其保持在磁性柱上)含有cd4+單陽性的和cd4+cd8+雙陽性的細胞群體，而cd4排除的細胞群體(其通過柱洗脫)含有cd8+單陽性的和cd4-cd8-雙陰性的細胞。為了從cd4陽性地選擇的細胞群體去除微珠，將細胞與macsmultisort釋放試劑溫育。20分鐘以后，停止消化，且用cd8微珠標記細胞30分鐘。通過陽性選擇，得到cd4+cd8+雙陽性的胸腺細胞，而cd4+單陽性的細胞存在于排除的細胞群體中。將cd4排除的細胞群體與cd8微珠溫育30分鐘。在將標記的細胞應用于磁性柱以后，cd8+單陽性的細胞可以與cd4-cd8-雙陰性的胸腺細胞分離開。通過流式細胞術分析，評價4個不同的胸腺細胞亞群的純度。可接受的純度是超過95％。1.3.3.6.從人扁桃體分離cd54+t細胞。使用在第1.3.2部分中所述的方法，從人扁桃體提取單核的細胞。在單核的細胞群體分離的4小時內，進行熒光-細胞染色，繼之以細胞分選。使用小鼠抗-人cd3-pe抗體(bdpharmingen)和小鼠抗-人cd54-fitc抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照，從單核的扁桃體細胞群體提取cd54+t細胞(細胞間粘附分子-1或icam-1)，使用在第1.3.3.1.1部分中所述的細胞染色/分選方法進行選擇。使用facs，分析染色的細胞。設定分選門，以收集含有cd3+t細胞(即cd3+cd54-細胞)或活化的cd54+t細胞(即cd3+cd54+細胞)的級分。圖8顯示了用小鼠抗-人cd3和小鼠抗-人cd54抗體染色的樣品的facs概況。使用cd3+細胞產生跨譜系三雜交體，而cd54+活化的t細胞用于表達實驗。結果表明，盡管t細胞占從扁桃體分離的單核的細胞的大多數(82％)，但僅9％是cd54+t細胞。1.3.4小鼠單核的細胞的分離將8-12周齡的balb/c小鼠維持在無特定病原動物設施中。在組織提取之前，通過co2暴露，對小鼠實施安死術。通過腋動脈或股動脈穿刺，得到外周血，并收集在肝素包被的管中。使用與在第1.3.1部分中關于人外周血單核的細胞的分離所述相同的規(guī)程，分離單核的細胞群體。機械地破裂小鼠脾，并使用在第1.3.2部分中所述的人脾單核的細胞的分離的程序，分離單核的細胞。1.3.5.從小鼠單核的細胞分離譜系特異性的原代細胞使用facs分析和細胞分選或磁性細胞分選，通過標準程序，分離t淋巴譜系和髓譜系的小鼠細胞。下面給出了用于分離譜系特異性的原代小鼠細胞的細胞染色和分選的非限制性實例。1.3.5.1.從小鼠脾和外周血分離效應t細胞不同的效應t細胞的選擇基于cd4和cd8的表面表達。將10μl每種小鼠抗-小鼠cd4-pe抗體(bdpharmingen)和大鼠抗-小鼠cd8-fitc抗體(bdpharmingen)或適當的同種型對照添加到脾或外周血單核細胞在染色培養(yǎng)基(pbs+5％bsa)中的100μl等分試樣中，每份等分試樣含有1x105細胞。對于單核的細胞群體的給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將10ml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到染色混合物中，且在350g和4℃離心7分鐘。抽吸上清液，且然后通過輕打管，重新懸浮細胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。對于其它等分試樣，重復該過程。使用facs，分析染色的細胞。對于每個樣品，分析至少20,000個門控的事件。染色的小鼠外周血和脾單核的細胞的典型facs概況分別顯示于圖45(a)和45(b)中。淋巴組織含有單陽性的cd4或cd8t細胞和雙陽性的t細胞，但是細胞表現存在差異。例如，外周血中的最大群體含有cd8+cd4-細胞毒性t細胞(43％)，而單核的脾細胞主要表現為cd4+cd8-輔助或調節(jié)t細胞(42％)。在為cd4陽性群體(區(qū)域r1)、為cd8陽性群體(區(qū)域r3)或為雙陽性的細胞群體(區(qū)域r2)設定適當的分選門以后，收集級分。收集1ml每個級分用于純度分析，并將每個級分的剩余部分重新懸浮于完全培養(yǎng)基中，用于進一步實驗。每個級分的純度大于98％。1.3.5.2.從小鼠外周血分離單核細胞通過使用磁珠(miltenyibiotec)的負選擇，從外周血單核群體分離小鼠單核細胞。將單核的細胞懸浮于磁性細胞分選緩沖液(pbs,01％wt/volbsa,和0.5mmedta)中，并根據生產商的規(guī)程，與包括針對t細胞(cd90)、b細胞(b220)和nk細胞(cd49b)的抗體的抗體微珠(microbeads)混合物一起溫育。然后將細胞通過ld-負選擇柱運行。收集陰性的(單核細胞)級分。為了測定純度，用pe綴合的針對cd11b的抗體和fitc綴合的針對cd90、b220、cd49b、nk1.1和ly6g的抗體(bdpharmingen)，對細胞染色。將單核細胞鑒別為cd11b+cd90-b220-cd49b-nk1.1-ly6g-/(低)，并通過facs驗證純度概況。小鼠單核細胞群體的純度概況示于圖46。100％的細胞是cd11b陽性的，而它們中超過98％是b220、cd90、cd49b和nk1.1陰性的。大約38％的cd11b陽性的細胞在低水平表達ly6g。實施例22.分泌所需蛋白的原代細胞的產生在下面的部分中，給出了用于產生分泌所需蛋白的原代人細胞的方法。這些細胞被用于細胞雜交實驗，或用作分析實驗的對照，或用作在三雜交體表達系統(tǒng)中表達的蛋白的分析參照。2.1.分泌人gm-csf的淋巴細胞的產生首先，通過如在第1.3.1部分中所述的梯度密度離心，分離臍帶血淋巴細胞，然后在含有植物凝集素(pha)的培養(yǎng)物中活化，繼之以在il-2(1000u/ml)中進行細胞增殖。通過elisa，分析人gm-csf的生產。生產的濃度范圍是15-40ng/ml/106細胞。將共300,000pha-活化的人淋巴細胞與根據生產商的說明書的濃度的與fitc綴合的小鼠抗-人cd4抗體(sigma)在暗處在4℃溫育30min。使用facs(facsvantagese,bd)，分析和選擇活化的人t細胞。圖42(a)顯示了pha-活化的淋巴細胞培養(yǎng)物中cd4+t細胞的典型概況，而圖42(b)顯示了cd4+分選的細胞的100％純度。2.2.分泌igm和igg的人淋巴細胞的產生將純化的b細胞(參見第1.3.3.1部分)以3.75x105細胞/ml接種在用小鼠抗-人cd154抗體(bdpharmingen)包被的96圓底孔板(corning)的孔中。在完全rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，所述完全rpmi1640培養(yǎng)基補加了10％熱滅活的超低iggfbs(gibco/brl)和100u/ml白介素4(il-4)(r&dsystems)，并在培養(yǎng)3天后添加50ng/ml白介素10(il10)。通過每2-3天更換一半培養(yǎng)基，補充培養(yǎng)物。使用血細胞計數器，通過錐蟲藍排除，一式三份地評價細胞生存力和計數。在第5天和第10天，收獲培養(yǎng)的淋巴細胞，在pbs中洗滌2次，并使用小鼠抗-人cd19-pe、小鼠抗-人igm-fitc或小鼠抗-人igg-fitc抗體(都來自bdpharmingen)，通過facs進行分析。使用1μg每種抗體/1x106細胞，在4℃進行所有染色。在所有分析中，超過95％的細胞是雙陰性的(使用根據同種型-匹配的陰性對照染色的標記物集合)。從分析中排除含有死細胞和碎片的區(qū)域。通過門控5000-10000活細胞，進行所有分析。培養(yǎng)的淋巴細胞中igm和igg陽性的細胞的典型概況示于圖9。在培養(yǎng)5天以后，18％的cd19+細胞是igm陽性的，且僅1％在表面上具有可檢測的igg，而在10天以后，igm陽性的淋巴細胞的百分比降低至僅2％，同時igg陽性的細胞的百分比增加至15％。在設定適當的門以后，分選igm陽性的和igg陽性的級分，用于ig表達實驗。通過標準的elisa，使用96elisa孔板和塑料吸附的山羊-親和純化的針對人μ和γ鏈的抗體，測定培養(yǎng)物中的igm和igg濃度。用hrp-綴合的綿羊抗-人ig抗體揭示結合的抗體。所有抗體來自sigma。將abts用作底物，并在405nm測量光密度。表1總結了在5和10天以后在b淋巴細胞培養(yǎng)物中檢測到的igm和igg水平。表1培養(yǎng)時間段igm,ng/106細胞igg,ng/106細胞5天2480±182850±9210天1215±2601914±101在培養(yǎng)5天以后，igm的生產下降，而igg生產增加。實施例33.體細胞雜交幾種體細胞雜交方法是本領域眾所周知的。它們包括、但不限于：例如，使用融合病毒諸如仙臺病毒的生物學方法(kohler和milstein,1975)，使用聚乙二醇(peg)的化學方法(wojciezsyn,等人,1983)，及使用電場的電方法(neil,和zimmermann,1993)。每種方法可以誘導或造成目標細胞的質膜可逆地可透過和雜交。無論采用上述的哪種細胞雜交方法，原則上，為了實現細胞雜交，需要2個基本步驟。首先，必須使要雜交的細胞的質膜發(fā)生良好的細胞膜接觸。其次，必須同時地誘導質膜在接觸點處可逆的破裂。關于電細胞雜交方法，通過使用具有適當電場頻率的交流電電場(ac場)，可以使目標細胞發(fā)生良好的細胞膜接觸，然后當用ac場使它們同時地暴露于短電脈沖時，誘導雜交。為了進一步詳細地說明，電細胞雜交涉及下述的物理現象：介電電泳(dep)和漿細胞膜的電破裂。介電電泳(pohl,1978)是這樣的現象：其描述了介電顆粒(諸如生物細胞)當懸浮于適當的溶液中并施加適當頻率的不均勻的ac電場時的運動。已經確定地記載，細胞的運動可以描述為：(i)介電顆粒的平移或遷移，例如，對于懸浮于100mm山梨糖醇中的sp2細胞，在0.5-2.0兆赫(mhz)之間的電場效率(mahaworasilpa,1992)，和(ii)介電顆粒的旋轉(mahaworasilpa,1992)，例如對于懸浮于100mm山梨糖醇中的sp2細胞，在2-10千赫(khz)之間的電場頻率。通過在一對電極(例如，圓柱狀電線，其可以排列成許多構型)之間施加電場，可以產生不均勻的場。最廣泛使用的構型是平行的電極構型(圖58)。在有不均勻的場存在下，dep可以造成介電顆粒(即生物細胞)彼此吸引，并同時向最強場的區(qū)域遷移。結果，它形成細胞的鏈或串，并又誘導良好的細胞膜接觸。顯而易見，當將細胞懸浮于適當的低導電性溶液中時，強烈地促進細胞的相互吸引。當將懸浮于合適的雜交溶液中的細胞暴露于具有適當脈沖振幅和寬度的電脈沖時，可以誘導細胞膜的電破裂(zimmermann,1982)。廣泛地使用一定范圍的脈沖寬度，例如，1-200微秒(μsec)的矩形脈沖，這取決于要雜交的細胞的類型。3.1.電細胞雜交系統(tǒng)在本發(fā)明的某些實施方案中，電細胞技術可以用于產生雜交的細胞，諸如三雜交體。3.1.1.細胞操作系統(tǒng)為了在細胞雜交之前操作個別目標細胞，在本發(fā)明自始至終使用在前面(第1.1.1部分)描述的單細胞操作/遞送系統(tǒng)。3.1.2.微電極在本發(fā)明中，使用2個l-形微電極。圖57顯示了直徑為128μm的、由未包被的鎳合金制成的微電極(7)。微電極的軸被外徑為1.5mm的血細胞比容毛細管(8)覆蓋。微電極的l-形部分(9和10)構造成允許電極的水平段和垂直段的表面的相容區(qū)域暴露于培養(yǎng)基或適當的溶液中(mahaworasilpa,1992)。在細胞雜交過程之前，將2個微電極安裝在2個精致的顯微操作器上，每個顯微操作器安裝一個微電極。以得到每個電極的平行電極構型的方式，排列這些微電極(圖58)。每個精致的顯微操作器由液壓驅動，并允許在x、y或z方向做出精細至0.5μm的運動。3.1.3.細胞室和構型圖59顯示了在標準的96-孔tc板的孔中的2個平行的電極，在本發(fā)明的某些實施方案中，所述孔用作細胞雜交室。為了進行細胞雜交，將微電極浸沒在適當的培養(yǎng)基(11)中，所述培養(yǎng)基包含在標準的96-孔組織培養(yǎng)板的孔(12)內。圖60和圖61分別顯示了平行的電極構型的頂視圖和側視圖，其中，將例如3個預選擇的要雜交的細胞放在平行的電極之間，其方式使得它們在有適當ac電場存在下可以被誘導列成一行或形成細胞鏈。實施例44.通過電細胞雜交方法生產跨譜系三雜交體的實施例下面的部分提供了產生三雜交細胞系的實施例，所述三雜交細胞系通過雜交來自不同的譜系或細胞類型的細胞、或來自相同的譜系/或細胞類型但是具有不同表型的細胞而得到。對每個穩(wěn)定的三雜交體進行分析，以證實它同時具有親本細胞的表型特征。所述證實基于譜系特異性的細胞表面標記物的分析、譜系特異性的標記物的細胞內表達、譜系特異性的標記物的rna轉錄物的存在、核型分析和/或譜系特異性的蛋白的分泌。下面的實施例例證了跨譜系三雜交體的最典型的表型特征。但是，這些實施例絕不限于選擇的特定標記物。4.1.從源自髓譜系、t淋巴譜系和b淋巴譜系的3個無限增殖細胞生產跨譜系三雜交體——kmw。通過雜交1個髓樣k562細胞、1個t淋巴樣molt4細胞和1個b淋巴樣wil2ns細胞，產生這類跨譜系三雜交體。這樣得到的跨譜系三雜交體被標記為kmw系(繼之以它的系列號)。下面描述了在本發(fā)明中使用的kmw跨譜系三雜交體生產的過程的下述步驟、溶液(雜交培養(yǎng)基、培養(yǎng)培養(yǎng)基和恢復培養(yǎng)基)和參數。4.1.1.用于kmw跨譜系三雜交體生產的細胞制備在我們的標準培養(yǎng)基(參見第1.1部分)中，培養(yǎng)k562、wil2ns和molt4細胞系。作為慣例，每3天傳代每個細胞系。在細胞雜交之前，使用在第1.1.2部分中描述的程序，確立每個細胞類型的穩(wěn)定克隆，其具有最高增殖速率。在有些實驗中，使用如在第1.1.3部分中所述確立的cd71+-富集的細胞群體。同樣，在一些場合，使用cd71+-富集的k562群體的cd15+細胞(第1.1.3.1部分)。4.1.2.用于kmw跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程將tc96-孔板的幾個孔用作細胞雜交孔。給每個孔裝填大約150μl雜交培養(yǎng)基，其由240mm山梨糖醇(sigma)、2.0mmkh2po4(sigma)、0.4mmcacl2(sigma)、0.2mmmg(c2h3o2)2(sigma)和0.2mmca(c2h3o2)2(sigma)組成，并補加了0.2％牛血清清蛋白bsa(sigma)。在電細胞雜交之前，在雜交培養(yǎng)基中洗滌每個細胞類型的預選擇的克隆的細胞一次，進行幾分鐘，并轉移至含有新鮮的雜交培養(yǎng)基的孔中。該孔被命名為預雜交孔。在細胞雜交過程之前，根據第1.1.1部分，操作每個選擇的克隆的單個且洗過的細胞，從而使得僅3個細胞(一個細胞來自一個選擇的克隆)位于一對相同的平行的電極之間，所述電極浸沒至孔底(如圖61所示)。電極的間距設定為400微米(即400μm)。為了實現電細胞雜交，首先，在電極之間施加交流電(ac)場幾秒，所述交流電場具有0.8mhz的頻率和大約50-60千伏/米(例如50-60kv/m)的場強，直到3個細胞被介電電泳dep誘導成彼此吸引，并形成細胞串。該過程造成細胞產生良好的細胞膜接觸。以使k562細胞處于細胞排列的中間的方式，排列細胞(參見圖60或61)。然后，用ac場同時施加2個矩形電脈沖，在脈沖之間時間間隔3秒。使用具有大約170kv/m的強度和75微秒(例如75μsec)的脈沖寬度的每個脈沖。在第二個矩形脈沖結束以后，使ac場保持連續(xù)另外5秒，從而導致細胞雜交成單個跨譜系三雜交的細胞。對于本發(fā)明的某些實施方案，觀察到，3個細胞的雜交可能不同時地發(fā)生，即經常先發(fā)生3個細胞中的2個的雜交，然后與第三個細胞雜交。在有些情況下，需要額外的矩形脈沖來達到完全的3細胞雜交。然后將新產生的跨譜系三雜交細胞從雜交孔轉移至恢復孔，后者位于與雜交孔不同的行中。每個恢復孔含有150μl標準的tc培養(yǎng)基(參見第1.1部分)。在濕潤的培養(yǎng)箱(運行在37℃和5％co2含量)中，溫育每個新確立的跨譜系三雜交細胞7天，每個恢復孔一個跨譜系三雜交細胞。發(fā)現大多數跨譜系三雜交體在細胞雜交事件以后的36小時內分裂。在溫育時間段結束時，用新鮮的標準培養(yǎng)基適當地補充每個恢復孔中的培養(yǎng)基。這刺激每個跨譜系三雜交體克隆的細胞增殖。2或3天以后，從每個恢復孔鑒別出分裂的細胞或存活的細胞，并鋪平板進標準的24-孔tc板的孔中，產生一組跨譜系三雜交體克隆。在24-孔板中培養(yǎng)每個跨譜系三雜交體克隆另外一周，然后轉移進25cm2tc瓶，該瓶含有10毫升(ml)我們的標準的培養(yǎng)基(參見第1.1部分)，并適當地標記，用于進一步分析。為了產生一批穩(wěn)定的跨譜系三雜交細胞，重復電細胞雜交和跨譜系三雜交體恢復過程的整個過程許多次。4.1.3.kmw跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認cd標記物的表達下面給出了確立的kmw跨譜系三雜交細胞系的確認實施例。在已經在正常培養(yǎng)條件下確立kmw跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。使用三色facs分析來驗證下述cd標記物的共表達：源于wil2ns的cd19、源于k562的cd15和源于molt4的cd4。簡而言之，以1x106細胞/ml的濃度，將100μl在含有5％bsa的pbs中的kmw跨譜系三雜交細胞懸浮于100μlpbs中，并在4℃與0.5mg/100ml小鼠抗-人cd15-percp、0.25mg/100ml小鼠抗-人cd4-pe和1.0mg/100ml小鼠抗-人cd19-fitc抗體或適當的同種型對照一起溫育30min。從bdpharmingen得到所有小鼠抗-人抗體。在用pbs充分洗滌以后，使用facscalibur流式細胞儀和cellquestpro軟件，分析標記的細胞。圖10顯示了kmw跨譜系三雜交細胞系的facs概況，其間接表明，kmw跨譜系三雜交細胞(其中譜系特異性的特征來自無限增殖的表型)含有混合表型的異質細胞群體，其中髓樣表型是優(yōu)勢的。但是，62％的kmw細胞具有髓樣表型和t淋巴樣表型，且28％的kmw細胞表達t淋巴樣表型和b淋巴樣表型。4.2.從1個無限增殖的髓樣細胞和2個原代淋巴樣細胞生產跨譜系三雜交體——kbt通過1個髓樣k562細胞、1個原代人b細胞和1個原代人t細胞的體細胞雜交，產生跨譜系三雜交體。所述跨譜系三雜交體被稱作kbt繼之以系列號。4.2.1.用于kbt跨譜系三雜交體生產的細胞制備在前面(第4.1.1部分)已經描述了在產生kbt跨譜系三雜交體之前制備k562細胞。在kbt跨譜系三雜交體的產生中使用的原代細胞包括：(i)源自脾、外周血或臍帶血的成熟的b細胞(cd19+)；源自骨髓的早期b細胞(cd20-cd72+)；源自骨髓的活化的b細胞(cd20+cd72+)；抗原處理過的源自臍帶血的b細胞(cd19+cd5+)，和(ii)源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助t細胞(cd4+)，源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細胞毒性t細胞(cd8+)；抗原處理過的源自臍帶血的t細胞(cd3+cd5+)；源自臍帶血的cd3+t細胞；源自胸腺的雙陰性的t細胞(cd3+cd4-cd8-)，源自胸腺的雙陽性的t細胞(cd3+cd4+cd8+)，將它們用于實驗中。在前面在第1.3部分中已經描述了來自各種淋巴組織的各種原代淋巴樣細胞的分離。4.2.2.用于kbt跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于kbt跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程類似于用于kmw跨譜系三雜交體生產的規(guī)程(第4.1.2部分)，但是培養(yǎng)基和ac電場和脈沖不同。在這些實驗中使用的雜交培養(yǎng)基由230mm山梨糖醇、1.8mmkh2po4、0.5mmcacl2、0.2mmmg(c2h3o2)2和0.3mmca(c2h3o2)2組成，補加了0.3％bsa。同時施加0.5mhz和65-75kv/m的ac場，其具有3秒時間間隔的3個矩形脈沖串，每個矩形脈沖具有100μsec的脈沖寬度和175-185kv/m的強度。在第三個矩形脈沖結束以后，將ac場連續(xù)接通另外5秒，從而導致細胞的雜交，以生產跨譜系三雜交細胞。在第4.1.2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4.2.3.kbt跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認cd標記物在細胞表面上的表達從1個無限增殖的髓樣(k562)細胞、1個原代成熟的b細胞和1個原代效應t輔助細胞確立的kbt跨譜系三雜交細胞系在例如已經在正常培養(yǎng)條件下確立跨譜系三雜交細胞系幾個月以后，分析該細胞系的譜系特異性的cd標記物的表達。使用與雜交之前在細胞制備中所述相同的規(guī)程(第1.3.1.1部分)，用小鼠抗-人cd19和cd4抗體標記kbt細胞系的細胞。圖11(d)顯示了從1個無限增殖的骨髓單核細胞和2個原代細胞確立的kbt跨譜系三雜交細胞系的facs概況(cd19和cd4標記)。一般，這樣的穩(wěn)定的跨譜系三雜交體中超過95％的細胞表達b和t細胞的cd標記物，具有與親本、原代細胞類似的密度。從1個無限增殖的髓樣細胞(k562)和2個原代抗原處理過的淋巴樣細胞(b和t細胞)確立的kbt跨譜系三雜交細胞系在另一個實施方案中，確立了源自1個k562細胞、1個抗原處理過的b細胞和1個抗原處理過的t細胞的細胞雜交的kbt細胞系。使用facs，分析細胞的cd19、cd3和cd5的共表達。簡而言之，使用與細胞雜交之前在細胞制備中相同的規(guī)程(第1.3.1.1部分)，用小鼠抗-人cd5-fitc和小鼠抗-人cd19-pe或小鼠抗-人cd4-pe抗體標記細胞。圖12顯示了這樣的kbt跨譜系三雜交細胞系的細胞的facs概況。結果表明，5-10％的kbt細胞群體通過維持cd5分子的細胞表面表達，同時是cd3和/或cd19陽性的，來保持它的抗原暴露記憶。同樣，cd5陰性的細胞群體中的至少83％共表達b譜系(cd19)和t譜系(cd3)標記物。從1個無限增殖的髓樣細胞(k562)、1個活化的b細胞和1個原代雙陽性的未定型的效應t細胞確立的kbt跨譜系三雜交細胞系在另一個實施方案中，確立了源自1個k562、1個分離自胸腺的t細胞(cd4+和cd8+雙陽性的)和1個分離自骨髓的活化的b細胞(cd20+和cd72+)(在第1.3.34部分中解釋)的細胞雜交的kbt細胞系。關于cd4、cd8、cd20和cd72在細胞表面上的共表達，分析細胞。簡而言之，使用與關于原代淋巴細胞的分離所述的相同規(guī)程(第1.3.3.1.1部分)，用小鼠抗-人cd4-pe和小鼠抗-人cd72-fitc抗體、或小鼠抗-人cd20-pe和小鼠抗-人cd8-fitc抗體、或小鼠抗-人cd4-pe和小鼠抗-人cd8-fitc抗體的抗體組合，標記kbt跨譜系三雜交細胞。圖13顯示了這樣的跨譜系三雜交細胞的facs概況。結果(參見圖13)表明，99％的kbt跨譜系三雜交細胞在它的表面上表達雙陽性的t細胞衍生的cd4或cd8中的任一種，其中66-71％的細胞是cd4陽性的，且88-89％的細胞是cd8陽性的。在這些細胞的60％中，cd4和cd8的表達是并行的。在是源自雙陽性的胸腺細胞的cd4陽性的同時，61％的細胞也是源自骨髓的活化b細胞的cd72陽性的。但是，跨譜系三雜交體群體中的94％在它們的表面上表達cd72。另一方面，31％的cd8陽性的跨譜系三雜交細胞共表達cd20。cd20陽性的細胞的總數是39％。4.3.從1個無限增殖的淋巴樣細胞、1個原代淋巴樣細胞和1個原代骨髓單核細胞生產跨譜系三雜交體——wtm這是從1個無限增殖的人b淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代人t細胞和1個原代人單核細胞產生跨譜系三雜交細胞系的實施例?？缱V系三雜交體系被標記為wtm繼之以系列號。4.3.1.用于wtm跨譜系三雜交體生產的細胞制備在前面在第4.1.1部分中描述了在wtm跨譜系三雜交體的產生中使用的wil2ns細胞的制備。原代細胞包括：源自脾和外周血的cd14+cd16-或cd14+cd16l單核細胞；源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助t細胞(cd4+)；源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細胞毒性t細胞(cd8+)；源自臍帶血的抗原處理過的t細胞(cd3+cd5+)和cd3+t；源自胸腺的雙陰性的t細胞(cd3+cd4-cd8-)和雙陽性的t細胞(cd3+cd4+cd8+)，它們用于這些實驗中。在前面(第1.3.3部分)已經描述了從各種淋巴組織分離各種原代淋巴樣細胞。在某些實施方案中，使用源自骨髓的cd34+cd15+骨髓單核祖細胞替代cd14陽性的單核細胞。4.3.2.用于wtm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于wtm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程類似于用于kmw跨譜系三雜交體生產的規(guī)程(參見第4.1.2部分)，但是培養(yǎng)基不同。在這些實驗中使用的雜交培養(yǎng)基由235mm山梨糖醇、1.8mmkh2po4、0.5mmcacl2、0.3mmmg(c2h3o2)2和0.25mmca(c2h3o2)2(sigma)組成，并補加了0.3％bsa。使用完全如第4.2.2部分所述的電規(guī)程，生產wtm。在第4.1.2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4.3.3.wtm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認cd標記物的表達從1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代t細胞和1個原代單核細胞確立的wtm跨譜系三雜交細胞系確立了源自1個wil2ns細胞、1個原代t細胞和1個單核細胞的細胞雜交的wtm細胞系。在已經在正常條件(參見第1.1部分)下培養(yǎng)跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析該跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。使用三色facs分析，以驗證源于wil2ns的cd19、源于原代單核細胞的cd14和源于原代t細胞的cd4的共表達(當這些原代t細胞被用于雜交時)。簡而言之，以1x106細胞/ml的濃度，將100ml在含有5％bsa的pbs中的wtm跨譜系三雜交細胞懸浮于100μlpbs中，并與標記的單克隆抗體(0.5mg/100mlcd14-percp、0.25mg/100mlcd4-pe和1.0mg/100mlcd19-fitc，都來自bdpharmingen)或適當的同種型對照在4℃溫育30min。在用pbs徹底洗滌以后，使用facscalibur流式細胞儀和cellquestpro軟件，分析標記的細胞。wtm跨譜系三雜交細胞的facs概況示于圖14。盡管源自無限增殖細胞的cd19標記物在跨譜系三雜交細胞群體中的表達水平似乎是一致的，但源于原代細胞的標記物的表達似乎是變化的。在該具體實施例中，基于cd14和cd4表達強度，可以將細胞群體分成3個亞群：(i)cd4hcd14l；(ii)cd4hcd14h；(iii)cd4lcd14h。隨后，通過標準技術諸如facs、macs或單細胞克隆等，可以分離這些群體中的每一個，并增殖成單獨的跨譜系三雜交體培養(yǎng)物，它們形成彼此不同的表型特征，同時維持在培養(yǎng)物中的同質性。從1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代抗原處理過的t細胞和1個原代單核細胞確立的wtm跨譜系三雜交細胞系當使用cd5+抗原處理過的t細胞來產生wtm跨譜系三雜交細胞系時，通過使用三色facs分析，驗證cd5與cd19和cd14并行的表達。該規(guī)程與上面所述的規(guī)程基本上相同，但是采用小鼠抗-人cd19-pe和小鼠抗-人cd5-fitc抗體替代小鼠抗-人cd19-fitc和小鼠抗-人cd4-pe抗體。這些cd在跨譜系三雜交細胞上的表達的facs概況示于圖15。分析表明，盡管源自無限增殖細胞且負責b細胞表型的cd19表達水平在細胞群體的約91-99％中似乎是一致的，但源自抗原處理過的t細胞的cd5和源自原代單核細胞的cd14的表達，在wmt雜交細胞中存在差異。僅63％的cd19陽性細胞也是cd5陽性的，且79％的cd19陽性細胞是cd14陽性的。值得注意的是，在這樣的wmt跨譜系三雜交細胞中，cd14表達水平從低到高變化。另一方面，所述細胞群體明顯地分成cd5+和cd5-跨譜系三雜交細胞。從1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代細胞毒性t細胞和1個原代單核細胞確立的wtm跨譜系三雜交細胞系當使用細胞毒性的cd8陽性的t細胞來產生wtm跨譜系三雜交體系時，使用與在本部分前面所述相同的三色標記規(guī)程，進行facs分析來驗證cd19、cd8和cd14的共表達。圖16顯示了cd19、cd8和cd14在該wtm跨譜系三雜交細胞系的細胞上的表達的facs概況。cd19的表達和它的水平在這些wmt跨譜系三雜交細胞中保持恒定，而這些細胞中僅46％在低水平共表達源自原代細胞毒性t細胞的cd8，且41％共表達源自原代單核細胞的cd14。值得注意的是，這些wmt細胞中的cd14表達水平從低到高變化。從1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代雙陽性的t細胞和1個原代單核細胞確立的wtm跨譜系三雜交細胞系當使用源自胸腺的雙cd陽性的t細胞(cd4+cd8+)來產生wtm跨譜系三雜交細胞系時，除了分析cd19、cd8和cd14表達以外，還分析cd4和cd8共表達。圖17顯示了cd4和cd8在跨譜系三雜交細胞系的細胞上的共表達的facs概況。在該使用雙陽性的t細胞的情況下，96％的wtm跨譜系三雜交細胞是cd4和cd8陽性的。cd19和cd14在源自cd4+cd8+陽性的t細胞的wtm跨譜系三雜交細胞上的表達概況，與源自細胞毒性的cd8陽性的效應t細胞的那些wtm跨譜系三雜交細胞基本上類似。從1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)、1個原代t細胞和1個原代骨髓單核祖細胞確立的wtm跨譜系三雜交細胞系當使用源自骨髓的cd34+cd15+骨髓單核細胞來產生wtm跨譜系三雜交細胞系時，分析了cd19(b譜系)、cd3(t譜系)、cd15(髓譜系)和cd34(祖細胞)的表面標記物。簡而言之，用小鼠抗-人cd19-pe、小鼠抗-人cd4-fitc(bdpharmingen)和小鼠抗-人cd15-percp抗體的組合，或用小鼠抗-人cd34-pe、小鼠抗-人cd4-fitc和小鼠抗-人cd15-percp抗體的組合，標記該wmt跨譜系三雜交細胞系的細胞。根據前面(第1.3.3.1.1部分)所述的規(guī)程，進行細胞染色。源于cd34+cd15+骨髓單核祖細胞的wtm跨譜系三雜交細胞的典型表達概況示于圖18。分析表明，大約81％的wtm跨譜系三雜交細胞共享b譜系和骨髓單核細胞表型(cd19+cd15+)，且61％的cd19+也是cd4t譜系標記物陽性的。34％的cd4+跨譜系三雜交細胞也在它們的表面上保持cd34，且68％的cd34+三雜交細胞表達cd15。令人感興趣地，28％的cd34+跨譜系三雜交細胞不保留cd15的表達，即使cd34和cd15來自相同來源(骨髓單核祖細胞)。4.4.從1個無限增殖的髓樣細胞、1個無限增殖的淋巴樣細胞和1個原代淋巴樣t細胞生產跨譜系三雜合體——kwt通過1個無限增殖的髓樣細胞(k562)、1個無限增殖的b淋巴樣細胞(wil2ns)和1個原代人t細胞的細胞雜交，產生這類跨譜系三雜交體生產。這類跨譜系三雜交體被稱作kwt繼之以系列號。4.4.1.用于kwt跨譜系三雜交體生產的細胞制備在第4.1.1部分中已經描述了用于這些細胞雜交實驗的k562和wil2ns細胞的制備。在細胞雜交之前，使用在第1.1.1部分中所述的規(guī)程序，確立表現出最高增殖速率的每個細胞類型的穩(wěn)定克隆。在某些實施方案中，使用如在第1.1.3部分中描述的cd71+-富集的細胞群體。在其它實施方案中，使用如在第1.1.3.1部分中所述選擇的cd71+-富集的k562群體的cd15+細胞。用于產生kwt跨譜系三雜交體的原代細胞包括：源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助t細胞(cd4+)；源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細胞毒性t細胞(cd8+)；抗原處理過的源自臍帶血的t細胞(cd3+cd5+)和cd3+t細胞；源自胸腺的雙陰性的t細胞(cd3+cd4-cd8-)和雙陽性的t細胞(cd3+cd4+cd8+)，它們用于這些實驗中(參見第1.3部分)。4.4.2.用于kwt跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于kwt跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程類似于kmw跨譜系三雜交體生產的規(guī)程(參見第4.1.2部分)。4.4.3.kwt跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認cd標記物的表達從1個無限增殖的髓樣細胞(k562)、1個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)和1個原代t細胞確立的kwt跨譜系三雜交細胞系確立了源自1個k562細胞、1個wil2ns細胞和1個原代t細胞的細胞雜交的kwt細胞系。在已經在正常培養(yǎng)條件下穩(wěn)定跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。使用三色facs分析，以鑒別源于k562的cd15、源于wil2ns的cd19和源于原代效應t輔助細胞的cd4的共表達。用于kwt跨譜系三雜交細胞的細胞染色的規(guī)程與關于kmw跨譜系三雜交體所述的規(guī)程(部分4.1.3)基本上相同。源自cd4+效應t細胞的kwt跨譜系三雜交細胞的facs概況示于圖19。大部分kwt跨譜系三雜交細胞表現出骨髓單核譜系、b淋巴譜系和t淋巴譜系的混合表型特征。100％的kwt跨譜系三雜交細胞在細胞表面上表達cd4(即t淋巴譜系的標記物)，其源自原代效應t細胞，而這些細胞中的54％同時是b譜系標記物cd19(其源自無限增殖的細胞wil2ns系)陽性的，且這些cd4+cd19+細胞中的24％是cd15(其源自無限增殖的骨髓單核祖細胞系k562)陽性的。從1個無限增殖的髓樣細胞(k562)、無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)和1個雙陽性的t細胞確立的kwt跨譜系三雜交細胞系當使用雙陽性的t細胞(cd4+cd8+細胞)來產生kwt跨譜系三雜交體系時，也分析了源自原代胸腺細胞的cd4和cd8的表達概況。用于cd概況分析的規(guī)程與上面關于源自cd4+t細胞的kwt跨譜系三雜交體所述的規(guī)程基本上相同，但是使用小鼠抗-人cd8-fitc抗體替代小鼠抗-人cd19-fitc抗體。源自雙陽性的(cd4+cd8+)t細胞的跨譜系三雜交細胞的典型cd表達概況示于圖20。結果表明，99％的kwt跨譜系三雜交細胞是cd4+陽性的，且69％是cd8陽性的，26％的cd4+細胞是cd15骨髓單核細胞標記物陽性的，且23％的cd8+細胞是cd15陽性的，這意味著，cd4+cd8+cd15+細胞占總細胞群體的大約23％(因為幾乎100％的細胞是cd4+，雙陽性的cd8+cd15+群體也是cd4陽性的)。象在源自cd4+效應t細胞的kwt三雜交體中一樣，cd19+細胞占總細胞群體的52％，它們中的22％共表達cd15。因而，整個cd15+細胞群體共表達cd4、cd8和cd19，意味著22-23％。從1個無限增殖的髓樣細胞(k562)、無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)和cd5陽性的抗原處理過的t細胞確立的kwt跨譜系三雜交細胞系當使用cd5陽性的抗原處理過的t細胞來產生kwt跨譜系三雜交體系時，分析了cd5的表達。除了在小鼠抗-人cd19和小鼠抗-人cd5抗體之間的熒光綴合物的顛倒(reversion)以外，使用與分析wtm跨譜系三雜交體所用相同的規(guī)程(部分4.6)，用小鼠抗-人cd19-fitc和小鼠抗-人cd5-pe抗體標記kwt雜交細胞。在圖21中所示的結果表明，90％的kwt跨譜系三雜交細胞是cd5(源自抗原處理過的t細胞)陽性的，且49％的cd5細胞也是cd19(源于wil2ns細胞(b細胞))陽性的。cd19+細胞在跨譜系三雜交細胞中的總百分比是約56％。4.5.從2個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)和1個原代單核細胞生產跨譜系三雜交體——wwm通過2個無限增殖的淋巴樣細胞(wil2ns)和1個原代人單核細胞的體細胞雜交，產生這類跨譜系三雜交體生產?？缱V系三雜交體被標記為wwm繼之以系列號。4.5.1.用于wwm跨譜系三雜交體生產的細胞制備以與在第4.1.1部分中所述相同的程序，培養(yǎng)wil2ns細胞系。在某些實施方案中，使用如在第1.1.3部分中所述確立的cd71+-富集的細胞群體。從源自脾、外周血或臍帶血的混合淋巴細胞，分離出人單核細胞。單核細胞的分離基于cd14標記物的表達，和在有些情況下，基于cd16的低表達水平(facs或磁珠)，如前面在第1.3.3.1.1部分中所述。當使用來自不同淋巴組織的單核細胞時，雜交參數或得到的跨譜系三雜交體似乎沒有差異。4.5.2.用于wwm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于wwm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程與用于kbt跨譜系三雜交體生產的規(guī)程(參見第4.2.2部分)類似。4.5.3.wwm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認cd標記物的表達在已經在正常培養(yǎng)條件(參見第1.1部分)下穩(wěn)定wwt跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。施加小鼠抗-人cd19-fitc和小鼠抗-人cd14-pe抗體的雙重染色或標記，以描繪得到的跨譜系三雜交體的跨譜系標記物表達。圖22a顯示了這樣的跨譜系三雜交細胞的典型cd概況。癌基因-關聯(lián)的標記物cd19的表達似乎在跨譜系三雜交細胞中是恒定的。盡管一些部分的細胞(23.5％)在它們的表面上確實表達cd14，但剩余的72.7％是cd14表面表達陰性的。4.6.使用非人哺乳動物細胞的跨譜系三雜交體生產下面的實施例表明，使用除了人細胞以外的哺乳動物細胞(具體地，小鼠細胞)，可以產生跨譜系三雜交體。應當理解，相同的原理可以用于從其它哺乳動物細胞產生跨譜系三雜交體。4.6.1.從1個無限增殖的小鼠淋巴樣細胞、1個原代小鼠淋巴樣細胞和1個原代小鼠單核細胞生產跨譜系三雜交體本部分描述了從1個無限增殖的小鼠b淋巴樣細胞(sp2)、1個原代小鼠t細胞和1個原代小鼠單核細胞產生跨譜系三雜交細胞系。該跨譜系三雜交體系被標記為stmmm繼之以系列號。4.6.1.1.用于stmmm跨譜系三雜交體生產的細胞制備在前面在第1.1.4部分中描述了用于產生stmmm跨譜系三雜交體的sp2細胞的制備。在這些實驗中使用原代小鼠細胞，包括：源自外周血的cd11b+cd90-b220-cd49b-nk1.1-ly6g-/低單核細胞；源自脾或外周血的小鼠輔助t細胞(cd4+)；源自脾或外周血的小鼠細胞毒性t細胞(cd8+)；和源自脾或外周血的雙陽性的t細胞(cd4+cd8+)。在前面(第1.3.5部分)已經描述了從脾和外周血分離各種原代小鼠淋巴樣細胞。4.6.1.2.用于stmmm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于stmmm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程類似于用于wtm跨譜系三雜交體生產的規(guī)程(參見部分4.3.2)，但是培養(yǎng)基和ac電場和脈沖不同。也就是說，在這些實驗中使用的雜交培養(yǎng)基由265mm山梨糖醇、1.5mmkh2po4、0.4mmcacl2和0.3mmmg(c2h3o2)2(sigma)組成，補加了0.2％bsa。同時施加0.5mhz和65-75kv/m的ac場，其具有3秒間隔的3個矩形脈沖串，每個矩形脈沖具有70μsec的脈沖寬度和250-280kv/m的強度。在第4.1.2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4.6.1.3.stmmm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認確立了源自1個sp2細胞、1個原代小鼠t細胞和1個小鼠單核細胞的細胞雜交的stmmm細胞系。在已經在正常條件(參見第1.1部分)下培養(yǎng)跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。使用三色facs分析，以驗證源于sp2細胞的cd138、源于原代小鼠單核細胞的cd11b和源于原代小鼠t細胞的cd4的共表達(當這些原代t細胞用于雜交時)。簡而言之，以1x106細胞/ml的濃度，將100μl在含有5％bsa的pbs中的stmmm跨譜系三雜交細胞懸浮于100μlpbs中，并與標記的針對小鼠cd138-pe、cd11b-fitc和cd4-percp的大鼠單克隆抗體(bdpharmingen)或適當同種型對照一起在4℃溫育30min。在用pbs徹底洗滌以后，使用facscalibur流式細胞儀和cellquestpro軟件，分析標記的細胞。stmmm跨譜系三雜交細胞的facs概況示于圖47。盡管cd138(即源自b譜系無限增殖細胞的標記物)的表達水平在跨譜系三雜交細胞群體中似乎是一致的，源于原代細胞的標記物的表達似乎是不同的。在該具體實施例中，存在相對較小百分比的不共表達cd4或cd11b之一與cd138的細胞(參見圖47a和b)。當分析stmmm細胞的cd4和cd11b的共表達時(參見圖47c)，大約82％的細胞共表達。實際上，細胞群體中的82％表達所有3個cd標記物，僅5％的細胞是cd138陽性的，不共表達cd4或cd11b之一。隨后通過標準技術諸如facs、macs或單細胞克隆等，可以分離這些不同群體中的每一個，并增殖成單獨的跨譜系三雜交體培養(yǎng)物，它們形成彼此不同的表型特征，同時維持在培養(yǎng)物中的同質性。當使用細胞毒性的cd8陽性的淋巴細胞來產生stmmm三雜交體時，使用大鼠抗-小鼠cd8-percp抗體替代抗-cd4-percp，用于在得到的三雜交細胞上共表達cd。如從圖48可見，97-100％的三雜交細胞是cd138陽性的(圖48a和b)，同時這些細胞中的56％或57％共表達cd8(圖48b)或cd11b(圖48a)。三雜交體群體中的至少40％表達所有3種標記物cd138、cd8和cd11b(圖48c)。在雙陽性的cd4+cd8+t細胞的情況下，以與細胞毒性t細胞相同的方式進行第一次分析。圖49顯示了得到的三雜交體上的cd138、cd11b和cd8表達的facs概況。98-100％的三雜交細胞是cd138陽性的，整個群體中的57-60％是所有3個譜系標記物陽性的(圖49c)。在93％的細胞上，檢測到cd138和cd8的共表達(圖49b)。在第二步中，檢查三雜交細胞的cd8和cd4的共表達。用大鼠抗-小鼠cd8-pe和大鼠抗-小鼠cd4-fitc抗體(bdpharmingen)標記細胞。圖50顯示了cd8和cd4表達的facs概況。盡管95％的三雜交細胞在表面上表達cd8，但僅50％的細胞同時共表達cd4。值得注意的是，實際上整個cd4陽性群體也是cd8陽性的。4.6.2.從2個無限增殖的小鼠淋巴樣細胞和1個原代小鼠單核細胞生產跨譜系三雜交體本實施例詳述了從2個無限增殖的小鼠b淋巴樣細胞(sp2)和1個原代小鼠單核細胞產生跨譜系三雜交細胞系。跨譜系三雜交體系被標記為ssmm繼之以系列號。4.6.2.1.用于ssmm跨譜系三雜交體生產的細胞制備在前面在第1.1.4部分中描述了用于產生ssmm跨譜系三雜交體的sp2細胞的制備。在這些實驗中使用源自外周血的原代小鼠cd11b+cd90-b220-cd49b-nk1.1-ly6g-/低單核細胞。在前面(第1.3.5部分)已經描述了從外周血分離原代小鼠單核細胞。4.6.2.2.用于ssmm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于ssmm跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程與用于stmmm跨譜系三雜交體生產的規(guī)程相同(參見第4.6.1.2部分)。4.6.2.3.ssmm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認在已經在正常培養(yǎng)條件(參見第1.1部分)下穩(wěn)定ssmm跨譜系三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。施加大鼠抗-小鼠cd138-pe和大鼠抗-小鼠cd11b-fitc抗體(bdpharmingen)的雙重染色或標記，以描繪得到的跨譜系三雜交體的跨譜系標記物表達。圖51顯示了這樣的跨譜系三雜交細胞的典型cd概況。癌基因-關聯(lián)的標記物cd138的表達似乎在跨譜系三雜交細胞中是恒定的，僅7％的細胞是cd138陰性的。大部分細胞(70％)確實也在它們的表面上表達cd11b，盡管剩余的23％的cd138陽性的細胞是cd11b表面表達陰性的。4.7.使用人和非人哺乳動物細胞生產跨譜系嵌合三雜交體本實施例詳述了使用人和非人哺乳動物細胞(具體地，小鼠)產生跨譜系嵌合三雜交體。應當理解，相同的原理可以用于從其它哺乳動物細胞產生跨譜系三雜交體。4.7.1.從1個無限增殖的小鼠淋巴樣細胞、1個無限增殖的人淋巴樣細胞和1個原代小鼠或人單核細胞生產跨譜系嵌合三雜交體從1個無限增殖的小鼠b淋巴樣細胞(sp2)、1個無限增殖的人b淋巴樣細胞(wil2ns)和1個原代小鼠或人單核細胞產生跨譜系嵌合的三雜交細胞系?？缱V系三雜合體系被標記為swmm(在使用小鼠單核細胞的情況下)和swmh(在使用人單核細胞的情況下)。在每個情況下，三雜交體的縮寫名稱后面跟著系列號。4.7.1.1.用于swmm和swmh跨譜系嵌合三雜交體生產的細胞制備在前面在第1.1.4部分和第1.1.3部分中，分別描述了用于產生swmm和swmh跨譜系嵌合三雜交體的sp2和wil2ns細胞的制備。在這些實驗中，使用源自外周血的原代小鼠cd11b+cd90-b220-cd49b-nk1.1-ly6g-/低單核細胞。在前面(第1.3.5部分)已經描述了從外周血分離原代小鼠單核細胞。從源自脾、外周血或臍帶血的混合淋巴細胞，分離出人單核細胞。單核細胞的分離基于cd14標記物的表達，和在有些情況下，基于cd16的低表達水平(facs或磁珠)，如前面在第1.3.3.1.1部分中所述。當使用來自不同淋巴組織的單核細胞時，雜交參數或得到的跨譜系三雜交體似乎沒有差異。4.7.1.2.用于swmm和swmh跨譜系嵌合三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程用于swmm和swmh跨譜系三雜交體生產的細胞雜交規(guī)程與用于stmmm跨譜系三雜交體生產的規(guī)程相同(參見第4.6.1.2部分)。4.7.1.3.swmm和swmh跨譜系嵌合三雜交體狀態(tài)的確認在已經在正常培養(yǎng)條件(參見第1.1部分)下穩(wěn)定swmm和swmh跨譜系嵌合的三雜交細胞系6個月以后，分析跨譜系嵌合的三雜交細胞群體的譜系特異性的cd標記物的表達。針對人cd71和小鼠tfr的表達進行雙染色，以確立得到的三雜交體的嵌合狀態(tài)。圖52顯示了這樣的分析的典型facs概況，100％的細胞是人和小鼠運鐵蛋白受體陽性的。這指示三雜交體對小鼠和人細胞分裂控制的依賴性。依賴于原代單核細胞的小鼠或人來源，施加大鼠抗-小鼠cd138-pe和大鼠抗-小鼠cd11b-fitc抗體(bdpharmingen)或大鼠抗-小鼠cd138-pe和小鼠抗-人cd14-fitc抗體(bdpharmingen)的雙重染色或標記，以描繪得到的跨譜系嵌合三雜交體的跨譜系標記物表達。圖53顯示了這樣的跨譜系嵌合三雜交細胞的典型cd概況。癌基因-關聯(lián)的標記物cd138(源自小鼠sp2細胞系)的表達似乎依賴于單核細胞的小鼠或人來源。小鼠cd138陽性的細胞的百分比從在swmm三雜交體中的84％下降至在swmh三雜交體中的29％。但是，96％的swmh嵌合的三雜交細胞是人cd19(源自wil2ns)陽性的(參見圖54)，而在swmm嵌合的三雜交體中的細胞都不表達人cd19。實施例55.基于cd標記物的分布來富集具有特定跨譜系表型的細胞的跨譜系三雜交體下面的部分提供了基于不同的表型特征來確立跨譜系三雜交細胞系的亞系的實施例。所述方法基于譜系特異性的細胞表面標記物的分析、譜系特異性的標記物的細胞內表達、譜系特異性的標記物的rna轉錄物的存在、核型分析和/或譜系特異性的蛋白的分泌。通過facs，從一般群體分離出具有希望的特征的跨譜系三雜交細胞。下面的實施例基于wwm跨譜系三雜交體，其具有2個基于cd14表達(陽性的和陰性的)的三雜交體群體。但是，該實施例絕不限于選擇的特定跨譜系三雜交體或標記物。將wwm跨譜系三雜交細胞分選成cd14陽性的和cd14陰性的級分，增殖每個級分，并單獨地維持培養(yǎng)3個月。圖22b表明，超過95％的跨譜系三雜交細胞保持cd14表達，而圖22c中的細胞群體繼續(xù)是cd14陰性的。這表明，可能分離和確立源自相同跨譜系三雜交體系的不同的同質細胞群體。通過rt-pcr確認跨譜系三雜交體為了驗證產生的亞系的跨譜系三雜交體性質，對原始的跨譜系三雜交細胞，cd19+cd14+富集的傳代培養(yǎng)物和cd14陰性的傳代培養(yǎng)物進行關于cd14的rt-pcr測定。使用人cd14+單核細胞作為陽性對照。使用在前面(第1.3.3部分)描述的facs，從外周血分離對照細胞。簡而言之，使用rneasy試劑盒(rneasyminikit,qiagen)，從培養(yǎng)的細胞制備總rna。根據生產商的規(guī)程，使用cdna-kit(amershampharmacia)，進行cdna合成，且基本上如sewing等人所述，進行pcr。通過瓊脂糖凝膠(2％)電泳，分析pcr反應混合物，并通過溴化乙錠染色來顯影。寡核苷酸引物對具有序列5’-引物5’-cacactcgcctgccttttcc-3’(seqidno:1)和3’-引物5’gattcccgtccagtgtcagg-3’(seqidno:2)用于擴增450bp的pcr產物。如圖23所示，rt-pcr揭示cd14mrna轉錄物在含有細胞的原始wwm培養(yǎng)物中和在原始wwm培養(yǎng)物的cd14+富集的傳代培養(yǎng)物中的存在。在缺少表面cd14的wwm傳代培養(yǎng)物中也檢測到cd14mrna，其水平與人cd14+單核細胞的水平相當。實施例66.核型分析進行跨譜系三雜交體的核型分析，以確立跨譜系三雜交體的細胞發(fā)生特征，并證實它們的雜交體起源。6.1.原始細胞系的核型分析作為一個實例，對k562和wil2ns細胞系的細胞的早期傳代和晚期傳代進行核型分析，以記錄原始細胞系的任何染色體不穩(wěn)定性。經發(fā)現，對于給定的細胞系，例如k562系，新鮮解凍的系的核型與在正常培養(yǎng)條件下維持幾個月的細胞系的核型相同。圖24和25分別描繪了k562和wil2ns細胞的典型核型。在兩種情況下，在400bphs檢查到共20個具有g帶的中期細胞。核型分析結果表明，k562細胞系含有具有三倍體特征的單個克隆，即具有69染色體的模式數，具有各種染色體異常。相比而言，wil2ns細胞系含有5個二倍體克隆，具有47-48的染色體數目，與k562細胞相比具有明顯不同的染色體異常。wil2ns細胞系中的克隆的表現如下：克隆1占10％克隆2占55％克隆3占10％克隆4占20％克隆5占5％表2(下面)總結了k562和wil2ns細胞系的復雜核型。2個細胞系之間沒有共享的異常。用藍色突出顯示在wil2ns細胞系的所有克隆中存在的染色體異常。6.2.用于蛋白表達的跨譜系三雜交體的核型分析對跨譜系三雜交體進行了核型分析，所述跨譜系三雜交體源自3個不同譜系的無限增殖細胞和原代細胞的各種組合，并進一步用于表達所需蛋白。還將這些核型與用于產生跨譜系三雜交體的原始無限增殖細胞系的核型進行了對比。6.2.1.kbt跨譜系三雜交體系的核型分析對源自k562無限增殖的髓樣細胞系和原代b和t淋巴細胞的2個kbt跨譜系三雜交體系進行了核型分析。為了對比，還對kbt跨譜系三雜交體進行了核型分析，所述kbt跨譜系三雜交體源自活化的b細胞(cd20+cd72+)和雙陽性的t細胞(cd4+cd8+)，具有各種類型細胞(基于它們的cd表達特征)(第4.2.3部分)。圖26顯示了源自k562+b(cd19+)+t(cd4+)雜交的kbt跨譜系三雜交體系(稱作kbt-1系)的典型核型。其表明，kbt-1的單個細胞克隆是近三倍體，具有66染色體的模式數。當對源自k562細胞、b(cd20+cd72+)細胞和t(cd4+cd8+)細胞的細胞雜交的kbt跨譜系三雜交體系(稱作kbt-2系)進行核型分析時，發(fā)現，kbt-2系(該系已經在以前的部分中表現出cd表達的變化)的核型分析由4個克隆組成，所述克隆是近三倍體?？寺?、克隆2、克隆3和克隆4分別占細胞群體的45％、30％、15％和10％?？寺?具有66的染色體模式數，而其它克隆各自具有67的染色體模式數。圖27顯示了kbt-2系的克隆之一的核型分析。kbt-1和kbt-2系的核型分析總結在表3中。該表的第一列指示染色體數目。一些染色體變化諸如del(3)(p14)、der(4)t(4；？)(q25；？)、+der(7)t(7；mar3)(q10；q10)和der(x)t(x；？；？)(q13；？；？)被所有跨譜系三雜交體共享(無論原代淋巴樣細胞的亞型如何)，但是不被k562細胞共享。表3.源自不同原代淋巴樣細胞亞型和作為癌基因來源的k562髓樣細胞系的kbt-1和kbt-2的對比分析的總結。用藍色突出顯示了被kbt-1和kbt-2跨譜系三雜交體系共享的k562系的染色體異常。用紅色突出顯示了在kbt跨譜系三雜交體系的克隆中共享、但是不被原始的k562細胞系共享的染色體異常。用綠色突出顯示了在有些kbt跨譜系三雜交體中存在并源自k562系的染色體異常。6.2.2.kwt跨譜系三雜交體系的核型分析對3個kwt跨譜系三雜交體系進行了核型分析，所述kwt跨譜系三雜交體系源自k562無限增殖的髓樣細胞系、wil2ns無限增殖的b淋巴樣細胞系和原代t淋巴細胞。為了對比，也對kwt跨譜系三雜交體進行了核型分析，所述kwt跨譜系三雜合體源自雙陽性的t細胞(cd4+cd8+)(稱作kwt-3)，具有各種類型細胞(基于它們的cd表達特征)(第4.2.3部分)。圖28、29和30分別顯示了kwt-1、kwt-2和kwt-3跨譜系三雜交體系的典型核型。在每個情況下，在400bphs分析了共20個具有g帶的中期細胞。kwt-1含有單個克隆，它是近六倍體(6n＝138染色體)。染色體模式數的范圍是129-140個具有核型異質性的染色體，即所有分析的細胞共享一些染色體異常。kwt-2含有單個克隆，它也是近六倍體。染色體模式數的范圍是135-145個具有核型異質性的染色體。kwt-3含有3個克隆，它們是超五倍體(n>115)?？寺?、克隆2和3分別占細胞群體的55％、20％和25％。kwt跨譜系三雜交體的核型證實，在所有kwt跨譜系三雜交體中保持了k562和wil2-ns細胞系的遺傳特征，無論在它們的產生中使用哪種原代t細胞類型。表4總結了這些kwt跨譜系三雜交體(即kwt-1、kwt-2和kwt-3系)的核型的對比分析。表4.源自不同類型的原代t細胞的kwt跨譜系三雜交體的對比分析。用紅色突出顯示了kwt跨譜系三雜交體與k562細胞系共享的染色體變化。用藍色突出顯示了在kwt跨譜系三雜交體和wil2ns細胞系之間共享的染色體變化。用綠色突出顯示了在跨譜系三雜交體的不同亞型之間共享、但是不被k562細胞系也不被wil2ns細胞系共享的變化。6.2.3.wwm跨譜系三雜交體系的核型分析對源自2個無限增殖的b淋巴樣細胞(2wil2ns系)和原代單核細胞(cd14+)的wwm跨譜系三雜交體系進行了核型分析。對該跨譜系三雜交體的富含cd14+細胞的亞系也進行了核型分析。圖31a和31b分別顯示了原始的wwm跨譜系三雜交體和它的cd14+-富集的亞系的核型。在每個情況下，在400bphs分析了來自共20個細胞的具有g帶的中期染色體。原始的wwm跨譜系三雜合體含有單個優(yōu)勢克隆，它具有47染色體模式數，存在于11個細胞中(55％)。但是，分析的剩余的9個細胞是從近三倍體(具有隨機的染色體喪失)至近四倍體(具有隨機的染色體喪失)。在這些細胞的任意一個中沒有一致性。另一方面，cd14+-富集的wwm跨譜系三雜交體的核型指示在19個細胞中檢測到的單個克隆異常。僅1個四倍體細胞被檢測到。表5總結了wwm跨譜系三雜交體系的核型分析的對比分析。用藍色突出顯示了與wil2-ns細胞共享的染色體特征。實施例77.通過pcr檢測ebv基因組對于pcr測定和對于給定的跨譜系三雜交細胞系，從跨譜系三雜交體的5x106細胞提取基因組dna。根據生產商的說明書，使用qiaampdnamicro試劑盒(qiagen)，使用molt-4細胞作為陰性對照，而使用co88bv59-1作為陽性對照。在定性pcr測定中，用特異性引物，擴增ebv基因組的bamhiw區(qū)域。上游和下游引物序列分別是：5’-caagaacccagacgagtccgtagaa-3’(seqidno:3)和5’-aagaagcatgtatactaagcctccc-3’,(seqidno:4)(kimura,等人,1999)。將10ng提取的dna添加到反應混合物中，所述反應混合物含有10mmtris-hcl(ph8.3)、1.5mmmgcl2、50mmkcl、200μmdntp、0.6μm每種引物和0.5u的taq聚合酶(lomblifescience)。在95℃初始變性2min以后，使用geneamppcr系統(tǒng)9600(perkinelmer)，進行28個95℃15秒和60℃1min的循環(huán)。在2％瓊脂糖凝膠上分離擴增的樣品。來自上述測定的結果表明，在本發(fā)明中確立的所有跨譜系三雜交體都被發(fā)現是ebv基因組陰性的。實施例88.支原體測試根據生產商的說明書，使用支原體pcr檢測試劑盒(lombscientific)，對使用的任意細胞系和在本發(fā)明中產生的跨譜系三雜交體系進行支原體測試。測試結果表明，所有細胞系和跨譜系三雜交體都被發(fā)現不含支原體。實施例99.蛋白在跨譜系三雜交體表達系統(tǒng)中的表達和它們的表征在本發(fā)明中體現的三雜交體跨譜系細胞系統(tǒng)可以用于制備多種生物制品，包括、但不限于生物學分子諸如蛋白、肽、碳水化合物、脂質和它們的嵌合分子。具體地，所述生物學分子可以包括細胞因子、生長因子、激素、受體或它們的嵌合分子或片段。技術人員將理解，所需的生物學分子諸如由三雜交體跨譜系細胞表達的蛋白可以是分泌型、膜結合型或二者。技術人員將另外理解，各種蛋白亞基可以在跨譜系三雜交細胞中共表達，例如免疫球蛋白表達和更具體地單克隆抗體生產。技術人員將另外理解，三雜交體跨譜系細胞也可以用于表達多種功能蛋白或肽片段，例如在免疫球蛋白的情況下，用于表達諸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段(包括單鏈fv片段)的片段。通過三雜交細胞與表達所需蛋白的配偶體細胞的體細胞雜交(第9.1部分)，可以在三雜交細胞系統(tǒng)中實現所需蛋白的表達?；蛘撸梢詫θs交細胞進行常規(guī)的基因轉染規(guī)程，以促進所需蛋白的表達(第9.2.1部分和第9.2.2部分)。在另一個實施方案中，通過使用體細胞雜交或常規(guī)基因轉染或二者，可以使三雜交細胞并行地表達多種靶蛋白(第9.3部分)。下面的實施例例證了許多不同種類的蛋白在跨譜系三雜交細胞中的表達。所述實施例也證實，可以在相同的跨譜系三雜交細胞中表達對特定分化的細胞類型特異性的蛋白(例如免疫球蛋白和cd54)。9.1.三雜交體跨譜系細胞與表達所需蛋白的細胞的雜交9.1.1.人gm-csf的表達在該具體實施例中，使用富含cd14陽性細胞的wwm跨譜系三雜交體系(在第5部分中描述)作為配偶體細胞系。使用在第1.3.3.1.1部分中所述分離的活化的人cd4陽性的淋巴細胞作為人gm-csf的來源。電細胞雜交程序與在第4.3.2部分中所述用于產生wwm跨譜系三雜交體的程序基本上相同。在得到的wwm和cd4+培養(yǎng)的t細胞的雜交體變得穩(wěn)定以后，將它維持為細胞系，并標記為progm。人gm-csf表達的結果通過夾心型elisa，測試progm上清液中的人gm-csf。以10μg/ml，用50μl純化的兔多克隆抗-gm-csf抗體在4℃包被96孔elisa板(corning)過夜。去除抗體溶液以后，用100μl含有5％bsa的pbs(5％bsa-pbs)，封閉在板上的殘余蛋白結合位點。然后，將50μl來自progm雜交細胞系的培養(yǎng)物上清液添加到孔中，并在37℃溫育2小時。用含有0.05％吐溫20的pbs(吐溫-pbs)洗滌3次以后，將它們與50μl兔抗-gm-csf抗體(10μg/ml)在室溫溫育1小時。用吐溫-pbs洗滌3次以后，將它們與200倍稀釋的過氧化物酶-綴合的抗-兔免疫球蛋白在室溫溫育2小時。用吐溫-pbs漂洗3次以后，通過與abts和0.01％過氧化氫溫育，使最終的反應物顯影。測量在415nm的吸光度。使用重組人gm-csf作為標準。對于給定的樣品，一式兩份地進行所有分析。結果表明，在非最優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，progm生產在0.7-1.1μg/ml/106細胞范圍內的人gm-csf。通過蛋白印跡和免疫沉淀對源自progm雜交體的hgm-csf的表征證實，progm雜交體生產的全人gm-csf表現出與由人淋巴細胞天然地分泌的糖形相同的糖蛋白形式。在分析之前，將從progm雜交體收集的上清液稀釋100倍。用于蛋白印跡分析的免疫印跡nc膜(millipore)和濃度為0.1μg/ml的生物素化的大鼠抗-人gm-csf抗體(r&dsystems)，被用于蛋白印跡檢測。在圖32中，由progm雜交體分泌的hgm-csf的蛋白印跡(泳道4)表現出與由pha活化的人淋巴細胞培養(yǎng)物分泌的gm-csf的形式(泳道2)相同的異質性。在progm和淋巴細胞培養(yǎng)物中表達的gm-csf的分子量分布范圍是18kda-35kda。在有衣霉素(其抑制碳水化合物鏈向天冬酰胺殘基上的添加)存在下，沒有檢測到更高分子量的分子(即35kda)，從而表明觀察到的異質性是由于不同程度的糖基化(泳道5)。由pha活化的淋巴細胞或在progm雜交體表達系統(tǒng)中生產的gm-csf形式的分子量高于源自大腸桿菌的gm-csf(泳道6)。收集補加或不補加10μg/ml衣霉素所培養(yǎng)的progm雜交體的上清液，并與分別針對大腸桿菌-衍生的人或小鼠gm-csf產生的大鼠抗-人gm-csf抗體或兔抗-小鼠gm-csf抗體一起在40℃溫育過夜。添加a蛋白-瓊脂糖凝膠(invitrogen)，并在室溫另外溫育3小時。用0.15mnacl、0.5％np-40、10mmtris-hcl、ph8.0，徹底洗滌回收的樹脂。用laemmli樣品緩沖液溶解結合的蛋白，并進行sds-page。如圖33所示，由progm雜交體分泌的gm-csf的分子量范圍是18kda-35kda，這類似于天然存在的形式。該異質性是由于在2個n-糖基化和幾個o-糖基化位點處的不同糖基化。在有衣霉素存在下，沒有檢測到更高分子量的帶，然而積累了更低分子量18-22kda的蛋白。該數據證實，源自progm雜交體的hgm-csf被作為人糖蛋白分泌。9.1.2.人免疫球蛋白的表達將通過facs測得具有表型標記物(關于更多的細節(jié)，參見第4.4.3部分)并如在第6.2.2部分中所述進行了核型分析的源自抗原處理過的t細胞(cd3+cd5+)的kwt跨譜系三雜交體系(稱作kwt-2)，用于經由電細胞雜交來表達人免疫球蛋白。具體地，在該具體實施例中，使用kwt-2跨譜系三雜交體作為配偶體細胞系。將如在第1.3.3部分中所述分離的原代cd40活化的igm陽性的或igg陽性的b細胞，用作人ig的來源。電細胞雜交程序與在第4.4.2部分中所述用于產生kwt跨譜系三雜交體系的程序基本上相同。在得到的雜交體變得穩(wěn)定以后，維持它們，并標記為proim或proig細胞系(參見第1.1部分)。人免疫球蛋白表達的結果通過前面所述的elisa(參見第1.3.3部分)，分析來自proim和proig的上清液中igm或igg的存在。以1x105細胞/孔，將細胞接種進圓底96孔板中，并在標準條件下培養(yǎng)24小時。使用血細胞計數器和錐蟲藍排除，進行細胞計數和生存力測定。結果總結在表6a和6b中。給出的每個值是3個獨立測量的平均值±sd。表6a.proim細胞的細胞生長和igm生產表6b.proig細胞的細胞生長和igg生產使用生物素化的小鼠抗-人igg1(克隆hp6069)、igg2(克隆hp6002)、igg3(克隆hp6047)、igg4(克隆hp6025)(icnbiomedicals)和生物素化的山羊抗-人κ和λ鏈(biosource)，檢測igg亞類和輕鏈亞型。使用alp-綴合的鏈霉抗生物素蛋白，檢測結合的生物素化的抗體。結果表明，分別由proim和proig細胞生產的igm和igg具有κ輕鏈，且igg屬于igg2類。9.1.3.人cd54的表達人cd54表達的方法將通過facs測得具有表型標記物(關于更多的細節(jié)，參見第4.4.3部分)并如在第6.2.2部分中所述進行了核型分析的源自成熟的t輔助細胞(cd4+)的kwt跨譜系三雜交體(稱作kwt-1)，進一步用于經由電細胞雜交來表達人cd54。具體地，在該具體實施例中，使用kwt跨譜系三雜交體作為配偶體細胞系。將如在第1.3.3部分中所述分離的原代人cd54陽性的t細胞用作人cd54分子的來源。雜交程序與用于產生kwt跨譜系三雜交體系的程序(參見第4.4.2部分)基本上相同。在得到的雜交體變得穩(wěn)定以后，在標準的培養(yǎng)條件下將它維持為細胞系(參見第1.1部分)，并標記為procd54。hcd54表達的結果使用facs分析，驗證cd54在procd54細胞表面上的表達。由于100％的原始的kwt跨譜系三雜交細胞在它們的表面上表達cd4(參見圖19)，所以使用在procd54細胞表面上的cd4表達作為得到的細胞系的穩(wěn)定性的參照。簡而言之，按照如在第1.3.3.1部分(cd54+t細胞的分離)中所述的相同規(guī)程，用小鼠抗-人cd54-fitc和小鼠抗-人cd4-pe抗體，標記1x105細胞/100μl等分試樣。procd54細胞表面上的cd4和cd54表達的典型概況顯示于圖34a中。大約72％的原始的procd54細胞是cd54陽性的，同時100％的細胞保持它的cd4表達，即使cd4表達水平似乎稍微低于kwt跨譜系三雜交細胞的水平。在設定適當的門以后，門控并分選具有中等至高水平的cd54表達的cd4+cd54+細胞群體(總細胞群體的大約42％)(圖34a)。將分選的細胞重新懸浮于標準培養(yǎng)基中，并維持培養(yǎng)幾個月。得到的亞系被標記為procd54ex。然后采用與本部分前面所述相同的規(guī)程，分析該亞系的cd4和cd54表達。procd54ex表面上的cd4和cd54表達的典型概況顯示于圖34b中。從該圖可以看出，在標準條件下培養(yǎng)6個月以后，至少98％的細胞維持cd4和cd54的表達。更進一步，cd54的表達在中間水平變得同質。還根據生產商的說明書，使用人cd54(icam-1)elisa(r&dsystems)，分析了procd54和procd54ex的可溶的cd54在組織培養(yǎng)物上清液中的存在。在培養(yǎng)第7天時，收集上清液至少3次。使用kwt跨譜系三雜交體配偶體細胞系的上清液作為陰性對照。一式兩份地對相同的樣品進行所有測量。簡而言之，用針對人可溶的icam-1的鼠單克隆抗體包被微量滴定板。在與對照、樣品或適當稀釋的標準一起溫育以后，添加辣根過氧化物酶(hrp)綴合的針對人可溶的icam-1的多克隆抗體。添加底物和終止液以后，使用設置在450nm的微量培養(yǎng)板讀數器，在30分鐘內測定每個孔的光密度。結果總結在表7中。表7.在kwt跨譜系三雜交體配偶體細胞系、procd54和procd54ex細胞系中的可溶的cd54(icam-1)的濃度范圍細胞系最低濃度,ng/ml最高濃度,ng/mlkwt00procd544201320procd54ex9102870通過凝膠電泳和蛋白印跡分析，測定從procd54和procd54ex脫落的可溶cd54的分子量。簡而言之，通過蛋白測定(r&dsystems)，測量上清液中的蛋白濃度，并調節(jié)至1.8mg/ml。通過sds-page，進行電泳。將共30ml樣品裝載上在非還原樣品緩沖液中的凝膠。電泳以后，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜(bio-rad)。用在tbs-吐溫緩沖液(tbst)中的脫脂奶粉(5％)封閉印跡的膜，并與小鼠抗-人icam-1抗體(在tbst中1:100稀釋)一起攪拌2小時。在用tbst洗滌樣品以后，添加第二種試劑，即與hrp連接的山羊抗-小鼠igg(1:10,000稀度)。用tbst重復洗滌以后，用水漂洗膜。在室溫進行所有溫育。圖35表明，在procd54和procd54ex的上清液中存在的scd54是大約82kda的單一種類，這與在人血清中檢測到的可溶cd54的分子量相對應。通過rt-pcr，驗證procd54和procd54ex細胞中人cd54的mrna的表達。使用商業(yè)試劑盒，提取總rna，并如前面在第5部分中所述，進行基因表達的rt-pcr檢測。使用人icam-1引物組[有義,5’-ccggaaggtgtatgaactg-3’；(seqidno:5)反義,5’-tccatggtgatctctcctc-3’(seqidno:6)]，探測從實驗和對照rna樣品反轉錄的cdna。在每個測定中包括親環(huán)蛋白的引物對作為內部對照[有義,5’-tgttcttcgacattgccgtcgac-3’；(seqidno:7)反義5’-gcatttgccatggacaagatgccagga-3’(seqidno:8)]。在含有溴化乙錠的tris-乙酸鹽緩沖液中，在3％瓊脂糖凝膠中電泳pcr反應產物，對紫外線誘導的熒光帶照相，并數字化。圖36顯示了procd54和procd54ex中人icam-1的mrna的rt-pcr分析。kwt跨譜系三雜交細胞(其在細胞表面上不表達cd54)也顯示出非常低的icam-1基因轉錄。9.2.用編碼所需蛋白的基因轉染三雜交體跨譜系細胞系通過許多常規(guī)技術，包括載體-介導的基因轉移，可以將特定基因導入培養(yǎng)的細胞中。在本發(fā)明的一個實施方案中，用編碼所需蛋白的基因瞬時轉染三雜交體跨譜系細胞。這允許在dna攝入的數小時內得到基因產物(rna或蛋白)。在本發(fā)明的替代實施方案中，用編碼所需蛋白的基因穩(wěn)定地轉染三雜交體跨譜系細胞。這包括質粒載體dna整合進宿主細胞染色質中。9.2.1.瞬時轉染將通過facs測得100％的跨譜系三雜交細胞共享b和t細胞表型標記物(參見第4.2.3部分)并如在第6.2.1部分中所述進行了核型分析的源自成熟的b細胞(cd19+)和成熟的t輔助細胞(cd4+)的kbt跨譜系三雜交體，用于基因轉染實驗。作為用所需蛋白瞬時轉染跨譜系三雜交體系的細胞的一個實例，用人il-4受體α鏈(hil4-rα)轉染kbt跨譜系三雜交體的細胞。方法在第1.3.1部分中已經描述了從骨髓樣品制備pbml細胞。從在標準培養(yǎng)條件下與100ng/ml重組人il-4(r&dsystems)溫育24小時的共1x106pbml細胞，克隆出hil4-rαcdna。提取總rna(rneasyminikit,qiagen)，并使用第一鏈cdna純化試劑盒(amershampharmacia)合成cdna。使用pcr來擴增hil4-rαcdna。使用有義引物5'-aggggcgcgcagataattaaa-3'(seqidno:9)和反義引物5'-agtggggccaatcaccttcata-3'(seqidno:10)，進行擴增。使用嵌套式pcr來添加2個bamhi限制位點給hil4-rα片段[有義引物5'-ggatccgcgcagataattaaaga-3',(seqidno:11)反義引物5'-ggatccaaatcaccttcataccat-3'(seqidno:12]。稀釋擴增的cdna，并進行在94℃1min的初始變性，繼之以31個在94℃20秒、在59℃45秒、在72℃3分鐘的循環(huán)。將il4rcdna片段連接進克隆載體pgem-t(promega)中，并轉染進jm109感受態(tài)細胞(promega)中。使用plasmidminikit(qiagen)，制備質粒dna。對于電穿孔，將懸浮于350μl完全tc培養(yǎng)基中的7x106kbt細胞(參見第1.1部分)與30μgcdna質粒相混合。通過來自eurogenteceasyjectpulser的單個脈沖(25kv/m,1050μf,34-37msec脈沖寬度)，進行轉染。隨后，在6孔組織培養(yǎng)板中在補加了100ng/ml重組hil4的完全tc培養(yǎng)基中溫育細胞。在轉染后24、48和72小時，通過冷凍-融化程序，制備細胞提取物。使用未轉染的kbt和pbml細胞分別作為陰性對照和陽性對照。使用bio-rad蛋白測定(bio-radlaboratories)，測定細胞提取物的總蛋白含量。使用20mg固定化在sapharose4bfastflow(sigma)上的a蛋白，用3μg抗-hil4-rα鏈(bdpharmingen551894)免疫沉淀等量的細胞提取物(大約2mg)。在稀釋緩沖液中洗滌免疫沉淀物2次(在tsa溶液中的0.1％tritonx-100和牛血紅蛋白，1次在tsa溶液中，另一次在0.05mtris-cl(ph6.8)溶液中，用laemmli緩沖液溶解，煮沸，并用tris-甘氨酸4％-12％sds-page分離。所述tsa溶液含有0.01mtris-cl(ph8.0)、0.14mnacl和0.025％疊氮化鈉)。在有些實驗中，沒有先前的免疫沉淀，通過sds-page，直接地分離細胞提取物的75μg蛋白內容物。如下進行蛋白印跡分析：將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移到處于25v的hybond-ecl硝酸纖維素膜(amersham)上2小時，處于含有25mmtris、192mm甘氨酸、0.1％sds、100μm釩酸鈉和20％甲醇的tris-甘氨酸緩沖液中。用封閉緩沖液(2.5％脫脂奶粉、10mmtris-cl[ph7.5]、100mmnacl和0.1％吐溫20)處理印跡1小時，然后與在封閉緩沖液中的2μg/ml小鼠抗-hil4-rα抗體溫育另外1小時。如下檢測抗體結合：同與辣根過氧化物酶綴合的綿羊抗-小鼠免疫球蛋白一起溫育印跡1小時，隨后與碘化的底物溫育1分鐘，然后進行增強的化學發(fā)光檢測。結果圖37顯示了在轉染以后24、48和72小時，來自用hil4-rα鏈瞬時轉染的kbt跨譜系三雜交細胞系的細胞提取物的蛋白印跡分析。在轉染后24小時，在用hil4-rα鏈轉染的kbt細胞中檢測到hil4-rα鏈，且在轉染后48和72小時，hil4-rα鏈的表達水平逐漸增加。未轉染的kbt細胞用作hil4-rα鏈的陰性對照。來自人pbml細胞(其用于制備hil4-rαcdna)的細胞提取物用作hil4-rα鏈的陽性對照。9.2.2.穩(wěn)定轉染作為用所需蛋白穩(wěn)定轉染跨譜系三雜交細胞系的細胞的一個實施例，用人白介素2(hil-2)基因轉染了kbt細胞系的細胞。方法將含有大鼠前胰島素原ii基因(其在rsv長末端重復序列控制下)的hil-2表達載體pbc12/rsv/il2(is)用于轉染。已經摻入了整個胰島素前導區(qū)和編碼翻譯起始密碼子的胰島素序列。該嵌合的hil-2mrna生產比含有天然的hil-2前導序列和起始密碼子的hil-2mrna(cullen,1988)明顯更多的hil2蛋白。經由與sv40/dhfr基因片段的連接(subramani等人,mol.cell.biol.1:854,1981)，將二氫葉酸還原酶基因序列(dhfr)插入pbc12/rsv/il2載體中，從而產生pbc12/rsv/il-2/dhfr質粒，其含有在sv40病毒早期區(qū)啟動子控制下的整個鼠dhfr基因，且其中hil-2和dhfr基因位于相同的朝向。在轉染之前，使用0.1mm多環(huán)芳族烴外消旋的3a,4b-二羥基-la,2a-環(huán)氧-1,2,3,4-四氫苯并[c]菲(b[c]phde)，對培養(yǎng)的kbt細胞誘變90分鐘(carothers等人,proc.natl.acad.sci87:5464-68,1990)。dhfr-克隆的選擇基于對次黃嘌呤和胸苷的依賴性，并遵循6-天表達時間段(urlaub等人,proc.natl.acad.sci.77(7):4216-20,1980)。在補加了10-4m次黃嘌呤和10-5m胸苷的標準培養(yǎng)基中，維持得到的dhfr缺陷的ktb細胞(kbtdhfr-)。在轉染中，用pbs洗滌培養(yǎng)的kbtdhfr-細胞3次，并重新懸浮于0.8mlpbs中。將60μgpbc12/rsv/il2/dhfr載體添加到細胞懸浮液中，將懸浮液轉移進塑料電穿孔杯中，并在冰上溫育10min。使用標準的電穿孔規(guī)程，使用基因-脈沖發(fā)生器(pulser)電穿孔單位(bio-rad)，在75kv/m和25μf，進行電穿孔。在脈沖處理以后，在冰上溫育杯10min。然后將細胞轉移進瓶中，并在沒有次黃嘌呤和胸苷的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用單細胞克隆技術(參見第1.1.2部分)，克隆存活的細胞，并評價確立的系的hil-2分泌。結果使用hil-2特異性的引物，通過pcr，驗證轉染的kbt(kbttr-il2)細胞中hil-2mrna的表達。經由磁珠分選(如在第1.3.3.5部分中所述)，從pbml得到的人cd8+t細胞，以及jurkat細胞系，克隆e6-1用作陽性對照。使用k562細胞和未轉染的kbt雜交細胞作為陰性對照。按照生產商的說明書，在rneasymini試劑盒(qiagen)中的各種處理以后，從轉染的kbt細胞提取總rna。下面的引物是基于公開的序列(wang等人,1989)使用的hil-2引物：5’引物＝5’-gaatggaattaataattacaagaatccc-3’(seqidno:13)3’引物＝5’-tgtttcagatccctttagttccag-3’(seqidno:14)擴增進行35個循環(huán)。pcr循環(huán)由下述組成：在94℃40秒，hil2的退火溫度是55℃，繼之以在72℃延伸40秒。在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠中使pcr產物顯影。結果給出在圖38中。表達水平與從cd8+人t淋巴細胞和jurkat細胞得到的那些類似。使用未轉染的kbt細胞和k562細胞作為陰性對照。根據生產商的說明書，使用bdfastimmunetmcd4細胞內il-2檢測試劑盒(bdpharmingen)，檢測細胞內il-2。使用bdfacscalibur，進行facs分析。最初，基于前向散射和熒光閾值以及前向散射和側向散射，門控cd4+細胞。隨后基于cd69(活化的cd4+t細胞)和細胞內il-2表達，分析門控的群體。kbttr-il2細胞中il-2表達的facs概況示于圖39。使用未轉染的kbt細胞作為對照。大約41％的kbt細胞是cd69活化分子陽性的。92％的kbttr-il2細胞是細胞內hil-2染色陽性的(r1+r2)。hil-2陰性的細胞是cd69陽性群體的一部分，而cd69陰性的細胞都是細胞內hil2陽性的。通過elisa，驗證在轉染后30天和90天時hil-2的分泌。簡而言之，在24-孔組織培養(yǎng)板中在37℃溫育1x106hil-2轉染的kbt細胞24小時。收集上清液，且通過hil-2elisa試劑盒(r&dsystems)，測量hil-2活性。稀釋上清液，以擬合hil-2elisa試劑盒的檢測范圍。重組的hil-2(r&dsystems)用作陽性對照。elisa分析表明，hil-2分泌率范圍是660ng/106細胞/24小時至3300ng/106細胞/24小時。得到的kbt細胞系(其被hil2穩(wěn)定轉染，且分泌hil2)被標記為prol2。9.3.組合雜交和轉染的靶蛋白并行表達作為使用三雜交體系統(tǒng)的并行蛋白表達的一個實施例，使三雜交細胞與人sigm+cd25+b淋巴細胞雜交，以表達higm，隨后用hil-2穩(wěn)定轉染。對穩(wěn)定地表達higm和hil-2的雜交細胞系統(tǒng)進一步進行hil-4rα的瞬時轉染。在該實施例中，higm代表第一種蛋白，hil-2代表第二種并行地表達的蛋白，且hil-4rα代表第三種并行地表達的蛋白?；蛘撸胔il-2穩(wěn)定地轉染三雜交細胞，隨后與人shigm+cd25+b細胞進行體細胞雜交。在確認hil-2和higm都從雜交細胞系統(tǒng)表達以后，對雜交細胞系統(tǒng)進一步進行hil-4rα的瞬時轉染。在該實施例中，hil-2代表第一種蛋白，higm代表第二種并行地表達的蛋白，且hil-4rα代表第三種并行地表達的蛋白。9.3.1細胞制備在這些實驗中使用源自成熟的b細胞(cd19+)和成熟的t輔助細胞(cd4+)的kbt跨譜系三雜交體，通過facs測得100％的跨譜系三雜交細胞共享b和t細胞表型標記物(參見第4.2.3部分)，并如在第6.2.1部分中所述進行了核型分析。在有些情況下，在實驗中使用dhfr缺陷的kbt細胞(kbtdhfr-)，它們源自在第9.2.2部分中所述的誘變過程，并維持在補加了10-4m次黃嘌呤和10-5m胸苷的標準培養(yǎng)基中。同樣，在有些情況下，還使用hil-2轉染的細胞系kbttr-il2(參見第9.2.2部分)。將原代cd40活化的sigm陽性的b細胞(其如在第1.3.3部分中所述從pbmc分離，并經由在第2.2部分中所述的cd40途徑活化)用作用于雜交的人sigmb細胞的來源。對于這些具體的實驗，sigm+b細胞的分離也基于cd25(人il-2受體)的并行表面表達，其中在培養(yǎng)5天后使用facs。如在第1.3.3.5部分中所述，使用macscd4multisort試劑盒，從胸腺分離出cd8+t細胞。9.3.2用于生產第一種蛋白或共生產第二種蛋白的體細胞雜交kbt細胞或kbtdhfr-細胞或系kbttr-il2細胞和shigm+cd25+b細胞(記憶b細胞的亞群)之間的電細胞雜交程序與在第4.4.2部分中所述的用于產生kbt跨譜系三雜交體系的程序基本上相同。在在得到的雜交體變得穩(wěn)定以后，如在第1.1部分中所述，維持它們。通過facs分析，驗證得到的雜交體對shigm和cd25的共表達(參見圖62)，并通過elisa，分析higm的生產。在將kbttr-il2細胞用于與shigm+cd25+b細胞雜交的情況下，還分析與higm并行的hil-2生產。9.3.3用第二種蛋白的穩(wěn)定轉染當在系統(tǒng)用hil-2穩(wěn)定轉染之前進行體細胞雜交時，使用在第9.2.2部分中所述的方法學，對higm生產系統(tǒng)進行hil-2轉染。通過elisa，驗證higm和hil-2的并行生產。9.3.4用第三種蛋白的瞬時轉染使用與在第9.2.1部分中所述相同的方法，經由用hil-4ra基因的電穿孔，進一步瞬時轉染分泌higm和hil-2的穩(wěn)定的雜交體系統(tǒng)。通過elisa，證實higm、hil-2和hil-4rα的共生產。結果在表7a和表7b中，總結了由相同雜交細胞系統(tǒng)的細胞并行地表達和共表達的3種蛋白的生產水平。為了分析，在24孔板中培養(yǎng)細胞至下述密度：0.5x105細胞/ml(對于表達1種蛋白)、1.2x105細胞/ml(對于表達2種蛋白)和3.2x105細胞/ml(對于表達3種蛋白)。該系統(tǒng)不僅能夠并行地生產3種蛋白，而且在第二種蛋白共表達以后，第一種蛋白的生產水平增加，且第三種蛋白的表達使它進一步增加。以相同的方式，第三種蛋白的表達增加第二種蛋白的生產。表7a.當體細胞雜交是第一種表達方法時由相同的雜交細胞系統(tǒng)并行地表達的蛋白的典型生產水平表7b.當穩(wěn)定轉染是第一種表達方法時由相同的雜交細胞系統(tǒng)并行地表達的蛋白的典型生產水平實施例1010.對用于progm雜交體生產的無血清培養(yǎng)條件的適應為了證實progm雜交細胞用于商業(yè)生產的穩(wěn)健性，將培養(yǎng)體積按比例放大至工作容積為1.2l的旋轉瓶，并培養(yǎng)適應無血清環(huán)境。方法通過使fcs含量逐漸降低至7.5％、5.0％、2.5％、1.0％、0.5％和0％，使progm雜交體的最高hgm-csf生產克隆適應在無血清環(huán)境中生長。僅將表現出最穩(wěn)健的細胞生長和上述hgm-csf的生產的傳代培養(yǎng)物轉移至連續(xù)更低的血清環(huán)境。將每個選擇的傳代培養(yǎng)物在我們的含有5％dmso的標準培養(yǎng)基中冷凍保藏。2種無血清培養(yǎng)基用于適應目的。可商業(yè)得到的確定成分的無血清和蛋白的培養(yǎng)基hybri-max(sigma)或excel(jhr)經過一些改進后使用。在第7天，通過錐蟲藍排除，評估細胞生存力。在同一天，通過elisa，測定hgm-csf的濃度。結果對無血清培養(yǎng)條件的適應結果給出在表8中。表8.progm在無血清條件中對hgm-csf的生產在progm雜交體的所有傳代培養(yǎng)物中，hgm-csf的生產隨著血清和蛋白含量的降低而增加。盡管在無血清培養(yǎng)物中的細胞密度低，但在無血清培養(yǎng)基中的hgm-csf的量是在標準培養(yǎng)條件下得到的量的大約4倍。當標準化成細胞濃度時，hgm-csf的生產率增加了15倍。實施例1111.1.在旋轉瓶中的生產方法在50r.p.m攪動具有1.2l工作容積的旋轉瓶。以1x105細胞/ml的濃度，接種適應了在無血清環(huán)境中生長的progm雜交細胞(progmsf)。在含有5％co2的濕潤氣氛中，在37℃溫育培養(yǎng)物。實現的最大細胞密度是5x105細胞/ml。使用錐蟲藍排除方法，測定活細胞。每天更換培養(yǎng)基，持續(xù)最多9天。在1000r.p.m.離心細胞懸浮液(600ml)10min，取出培養(yǎng)基，更換為新鮮的培養(yǎng)基，并使細胞返回旋轉瓶。通過elisa，測定分泌的hgm-csf的濃度。用1:500稀釋的100μl大鼠抗-人gm-csf(r&d)包被每個孔。在用含有0.05％v/v吐溫20的pbs(pbs-t)洗滌以后，一式兩份地向孔中添加100μl在pbs-5％v/vbsa中的在0.195-200ng/ml范圍內的標準rhgm-csf(invitrogen)或100μl各自稀釋100倍的樣品。在37℃進行所有溫育1h。然后，用pbs-t洗滌板，并添加100μl在pbs-bsa-t中1:1,000稀釋的兔抗人gm-csf(r&d)抗體，且在溫育和洗滌以后，添加100μl在相同緩沖液中1:1,000稀釋的山羊抗-兔免疫球蛋白-hrp綴合物。再次溫育和洗滌板，且添加100μl底物。在450nm測量光密度。結果相對較低的細胞密度(5x105細胞/ml)指示progmsf的細胞生長的亞最適培養(yǎng)條件。為了達到更高的密度(在106細胞/ml的數量級)，可能需要進一步最優(yōu)化培養(yǎng)條件，包括葡萄糖含量和其它補充物。也需要密切監(jiān)控乳酸鹽和銨含量。盡管亞最適生長，但培養(yǎng)物上清液中的hgm-csf濃度在2.8-4.2μg/ml范圍內。當標準化成細胞密度和時間時，progmsf表現出0.6-0.9μghgm-csf/ml/106細胞/24小時的生產率。為了對比，認為cho細胞中0.3μg蛋白/ml/106細胞/24小時的生產是高的。11.2.由progm雜交細胞系生產的人gm-csf的純化方法使用pm-10膜(amicon)，將來自progmsf培養(yǎng)物的上清液在40℃濃縮大約10倍。根據生產商的規(guī)程，將樣品濃縮物裝載上免疫親和柱，該柱通過將針對大腸桿菌-衍生的人gm-csf的大鼠抗-人gm-csf偶聯(lián)到affi-gel10(bio-rad)上而制備，用pbs(137mmnacl、3mmkcl、8mmna2hpo4、1.5mmkh2po4)平衡該柱，并用0.1mm檸檬酸鈉ph2.8洗脫結合的蛋白。然后將從親和柱洗脫的蛋白裝載上rp300hplc柱，并用乙腈(acetonitrite)梯度0-60％在60分鐘內洗脫，流速為0.1ml/min。得到的洗脫圖示于圖40。收集從rp-hplc回收的等分試樣，用于elisa、銀染色和蛋白印跡分析。結果表9顯示了hgm-csf從典型的兩步純化的回收。從親和柱的初步回收僅是59％，且在rphplc以后喪失了僅2％的hgm-csf。在親和純化以后的低回收有許多可能的原因。親和柱的結合容量可能低于progmsf的上清液中的hgm-csf的量，因為13％的hgm-csf在流通和洗滌步驟中喪失。低回收也可能是由于針對大腸桿菌-衍生的hgm-csf產生的大鼠抗體比由progmsf雜交體生產的hgm-csf的糖基化形式更低的親和力。最終得率的其它潛在提高則是更好的最優(yōu)化的洗脫條件的開發(fā)。在圖41(參見第12部分)中，在rp-hplc以后收集的級分的蛋白印跡表明，hgm-csf洗脫在級分24-36中(在第24-36分鐘洗脫)。高分子量形式(28-32kda)洗脫在級分24-27中，而更低分子量的分子(18-22kda)洗脫在級分34-36中。這些層析條件沒有完全分離hgm-csf的不同分子量形式，尤其是在高和中分子量級分中。用銀染色得到的概況和蛋白印跡概況是基本上相同的，從而表明僅hgm-csf有關的蛋白結合在親和柱上。觀察到天然hgm-csf的幾種分子量種類。表9.源自progmsf的hgm-csf的兩步純化rp-hplc免疫測定陽性的級分實施例1212.糖苷酶消化方法在1％sds、1mp-巰基乙醇、100mm磷酸鈉、ph7.0中，在100℃熱變性純化的源自progmsf雜交體的人gm-csf3min，添加0.8u的測序級pngasef(sigma)，并在37℃溫育遞增的時間段。結果從圖43可見，在n-消化以后，源自progmsf雜交體的hgm-csf形式以時間依賴性的方式遷移至靠近源自大腸桿菌的hgm-csf的位置。但是，在消化以后的帶都不對應由大腸桿菌生產的未糖基化形式。這些結果提示，源自progmsf雜交體的hgm-csf在n-和o-糖基化位點處被糖基化，且分子量分布由異質糖基化造成。從未保護的o-糖基化位點的免疫原性的觀點看，o-糖基化在所有hgm-csf分子中的這種發(fā)現是重要的；已經報道，缺乏o-糖基化的重組人gm-csf在臨床試驗中產生抗體。數據提示，progmsf雜交細胞分泌3類hgm-csf(根據n-糖基化位點)：在2個位點處被糖基化的分子(25-35kda,2n-型)；在任一個位點處被糖基化的分子(20-25kda,1n-型)；和在任一個位點處都沒有被糖基化的分子(18-20kda,0n-型)。盡管已經參考具體實施例描述了本發(fā)明，但本領域技術人員將認識到，本發(fā)明可以以許多其它形式來體現，與本文所述的本發(fā)明的廣闊的原理和精神一致。參考文獻ainaietal.，humantibodies15：139-154，2006airoldietal，cancerresearch61：1285-1290，2001blackwoodetal，science281：60-63，1998boerneretal，j.immunol.147：86-95，1991；carothersetal，proc.natl.acad.sci87：5464-68，1990christensenetaljbiol.chem.282(27)：19463-19472cullen，b.r.，1988.dna，7：645-650durocheretal，nucleicacidsres30(2)：e9，2002；durocheretal，nucleicacidsres30(2)：e9，2002；feizinature314：53-54，1985；girardetal，cytotechnology38：15-21，2002；grameretal：biotechnology13(7)：692，1995hartmanetal，jimmunol164：944-953.2000；hosoietal，cytotechnology7：25-32，1991hosoietal，cytotechnology7：25-32，1991hosoietal，cytotechnology7：25-32，1991huretal，cellprolif38：35-45，2005；jordanetal，cytotechnology26：39-47，1998；jordanetal，cytotechnology26：39-47，1998；kalantarovetal，humantibodies11：85-96，2002；karpasetal，procnatlacadsciusa98：1799-1804，2001kimurah.etal，1999.jclinmicrobiol37：132-136kirmanetal，hybrid.hybridomics21：405-414，2002；kohler，gandmilstein，c.nature，256，495-4971975lietal，procnatlacadsciusa103(10)：3557-3562，2006lietal，procntlacadsciusa95：3650-3654，1998；mahaworasilpa，t.l.(1992).cellelectro-dynamics：themechanicsoflivingcellsinintensealternatingelectricfields.phdthesis，universityofnewsouthwales，sydney，australiamarikaetal，curropingenetdev11(2)：205-208，2001mcilroyd，autranb，cheynierr，etal.jvirol.；69：4737-47451995meissneretal，biotechnolbioeng75(2)：197-203，2001miyajietal.，cytotechnology4：173-180，1990；miyajietal.，cytotechnology4：39-43，1990；miyajietal，cytotechnology，3：133-140，1990；neil，g.a.andzimmermann，uelectro，meth.enzymol220，1741993parhametal，cytotechnology，35：181-187，2001paulsonetal，j.biol.chem.264：10931-10934，1989phametal，biotechnolbioeng84(3)：332-42，2003pohl，h，dielectrophoresis，cambridgeuniversitypress，london1978rademacheretal，annurevbiochem57：785-838，1988satohetal，cytotechnology18：162-172，1996satohetal，cytotechnology13：79-88，1993satohetal，cytotechnology13：79-88，1993schlaegeretal，cytotechnology30：71-83，1999shinkawaetal，j.biol.chem.278：3466-3473，2003sugimotoetal，jvirol73：9690-9691，1999；todaetal，jchromatogrbanalyt.technol.biomed.lifesci.787：197-206，2003.traggiaietal，natmed10：871-875，2004urlaubetal，proc.natl.acad.sci.77(7)：4216-20，1980vandijketal，curr.opin.chem.biol.5：368-374，2001wang，a.m.，doyle.m.v.，andmark.d.f.proc.nati.acad.sci.usa，86：9717-9721，1989wojciezsyn，j.w.etal，j.cell.biol.，96，151-159，1983zafiropoulosetal，j.immunol.methods200：181-190，1997zimmermann，u.(1982).biochim.biophys.acta.694，227-277序列表<110>stephensanigresearchinstitute<120>制備雜交細胞/嵌合細胞的方法及其應用<130>50356wop00<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>1cacactcgcctgccttttcc20<210>2<211>20<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>2gattcccgtccagtgtcagg20<210>3<211>25<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>3caagaacccagacgagtccgtagaa25<210>4<211>25<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>4aagaagcatgtatactaagcctccc25<210>5<211>19<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>5ccggaaggtgtatgaactg19<210>6<211>19<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>6tccatggtgatctctcctc19<210>7<211>23<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>7tgttcttcgacattgccgtcgac23<210>8<211>27<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>8gcatttgccatggacaagatgccagga27<210>9<211>21<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>9aggggcgcgcagataattaaa21<210>10<211>22<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>10agtggggccaatcaccttcata22<210>11<211>23<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>11ggatccgcgcagataattaaaga23<210>12<211>24<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>12ggatccaaatcaccttcataccat24<210>13<211>28<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>13gaatggaattaataattacaagaatccc28<210>14<211>24<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>14tgtttcagatccctttagttccag24當前第1頁12