本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用儀器領(lǐng)域，尤其涉及一種微液滴式pcr芯片，及所述微液滴式pcr芯片的制造方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，簡稱pcr)，作為分子生物學(xué)和基因工程的一項重要技術(shù)，其是一種在引物引導(dǎo)下選擇性擴增dna和rna片段的方法，設(shè)有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點?，F(xiàn)階段生物工程采用的pcr擴增儀可對所需要的目的基因片段進(jìn)行連續(xù)多次擴增，并可以復(fù)制到幾百萬倍數(shù)量級的數(shù)目，廣泛應(yīng)用于以獲得目的基因或基因片段為目的的生命科學(xué)，醫(yī)學(xué)工程，遺傳功臣，疾病診斷等許多領(lǐng)域。

微液滴技術(shù)在生物化學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展?；谖⒁旱渭夹g(shù)可以操控微小體積的液滴，并可以實現(xiàn)微液滴的穩(wěn)定生成、表面處理、破裂、融合及多層液滴制備，因此微液滴可用于容器進(jìn)行微生物培養(yǎng)、反應(yīng)酶分析、微球顆粒的形成等。

微液滴式pcr芯片產(chǎn)出的微液滴粒徑穩(wěn)定、均一，并且可操控性強，能夠較為方便快捷地與反應(yīng)酶、反應(yīng)物與催化劑等物質(zhì)融合。微液滴式pcr芯片將pcr反應(yīng)液與油相試劑混合以生成微液滴并儲存在pcr反應(yīng)區(qū)，后續(xù)微液滴將進(jìn)行pcr反應(yīng)。

但是，常規(guī)的微液滴式pcr芯片無法有效隔離pcr反應(yīng)區(qū)的微液滴，在pcr反應(yīng)過程中，微液滴容易脫離pcr反應(yīng)區(qū)，導(dǎo)致pcr反應(yīng)異常。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種微液滴式pcr芯片，及所述微液滴式pcr芯片的制造方法，能夠在微液滴式pcr芯片中形成封閉閥門，防止微液滴容易脫離pcr反應(yīng)區(qū)。

一種微液滴式pcr芯片，包括相貼合的蓋片和基片；所述蓋片朝向所述基片的表面設(shè)有油相試劑流道、pcr反應(yīng)液流道、混合流道、pcr反應(yīng)腔和排液流道；所述混合流道的相對兩端分別設(shè)有混合入口和液滴出口；所述油相試劑流道和所述pcr反應(yīng)液流道的一端均交匯于所述混合入口，所述油相試劑流道和所述pcr反應(yīng)液流道的另一端分別設(shè)有油相試劑注入口和pcr反應(yīng)液注入口，所述油相試劑流道的流道內(nèi)徑由所述油相試劑注入口到所述混合入口逐漸減小，所述pcr反應(yīng)液流道的流道內(nèi)徑由所述pcr反應(yīng)液注入口到所述混合入口逐漸減?。凰鰌cr反應(yīng)腔的兩側(cè)各設(shè)有一個填充腔，一個所述填充腔連通所述pcr反應(yīng)腔填充腔及所述液滴出口，另一個填充腔連通所述pcr反應(yīng)腔填充腔與所述排液流道；每個所述填充腔中填充有熱膨脹顆粒。

其中，所述油相試劑流道在所述油相試劑注入口處分為第一分流道和第二分流道，所述第一分流道與所述第二分流道匯聚于所述混合入口。

其中，所述油相試劑流道與所述pcr反應(yīng)液流道的內(nèi)壁上均設(shè)有用于過濾雜質(zhì)的凸起。

一種微液滴式pcr芯片的制造方法，用于制造權(quán)利要求1-3中任一項所述的微液滴式pcr芯片，包括：提供基片和襯底，并制備具有第一圖案的第一掩膜板和具有第二圖案的第二掩膜板；使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通過光刻工藝在所述襯底上形成并排拼接的第一陽模和第二陽模，其中，所述第一陽模上與所述第一圖案對應(yīng)的區(qū)域形成有所述油相試劑流道的圖形、所述pcr反應(yīng)液流道的圖形，以及所述混合流道的圖形，所述第二陽模上與所述第二圖案對應(yīng)的區(qū)域形成有兩個所述填充腔的圖形、所述pcr反應(yīng)腔的圖形，以及所述排液流道的圖形；以所述第一陽模和所述第二陽模為模板形成蓋片基體，所述蓋片基體的表面設(shè)有未開設(shè)所述pcr反應(yīng)液注入口的pcr反應(yīng)液流道、未開設(shè)有所述油相試劑注入口的所述油相試劑流道、所述混合流道、所述pcr反應(yīng)腔、所述排液流道，及兩個所述填充腔；在兩個所述填充腔內(nèi)填充熱膨脹顆粒，并在所述蓋片基體的表面加工出所述油相試劑注入口、所述pcr反應(yīng)液注入口及所述排液流道的排液口，形成包含所述油相試劑流道、所述pcr反應(yīng)液流道、所述排液流道、所述混合流道、所述pcr反應(yīng)腔，及兩個所述填充腔的所述蓋片；對所述蓋片與所述基片進(jìn)行清洗，之后將所述蓋片與所述基片對準(zhǔn)貼合，得到所述微液滴式pcr芯片。

其中，所述使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通過光刻工藝在所述襯底上形成并排拼接的第一陽模和第二陽模包括：在所述襯底上涂覆第一光刻膠層并進(jìn)行烘烤；通過曝光將所述第一掩膜板上的所述第一圖案轉(zhuǎn)印到所述第一光刻膠層上，以在所述第一光刻膠層上形成與所述第一圖案對應(yīng)的所述油相試劑流道的圖形、所述pcr反應(yīng)液流道的圖形，以及所述混合流道的圖形，之后除去所述第一掩膜板；在所述襯底上涂覆第二光刻膠層并進(jìn)行烘烤，所述第二光刻膠層與所述第一光刻膠層并排拼接；通過曝光將所述第二掩膜板上的所述第二圖案轉(zhuǎn)印到所述第二光刻膠層上，以在所述第二光刻膠層上形成與所述第二圖案對應(yīng)的所述pcr反應(yīng)腔的圖形、所述排液流道的圖形，以及兩個所述填充腔的圖形，之后除去所述第二掩膜板；去除未固化的光刻膠并做堅膜處理，得到所述第一陽模和所述第二陽模。

其中，所述以所述第一陽模和所述第二陽模為模板形成蓋片基體包括：在所述第一陽模和所述第二陽模上澆注模型膠，經(jīng)脫氣泡、固化后揭膜，得到所述蓋片基體。

其中，在步驟使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通過光刻工藝在所述襯底上形成并排拼接的第一陽模和第一陽模，與步驟以所述第一陽模和所述第二陽模為模板形成蓋片基體之間，還包括：使用脫模劑處理所述第一陽模和所述第二陽模的步驟。

其中，所述熱膨脹顆粒占據(jù)所述填充腔的容積的30％。

其中，所述脫模劑為三氯甲基硅氧烷。

其中，所述模型膠包括聚二甲基硅氧烷。

由此，本發(fā)明的微液滴式pcr芯片，通過在pcr反應(yīng)腔的兩側(cè)分別設(shè)置填充熱膨脹顆粒的填充腔，使用填充熱膨脹顆粒的填充腔作為封閉閥門，將pcr反應(yīng)腔完全隔離，避免了微液滴脫離pcr反應(yīng)腔，保證了pcr反應(yīng)腔內(nèi)的pcr反應(yīng)正常進(jìn)行。本發(fā)明的微液滴式pcr芯片的制造方法，使用光刻工藝能夠方便快捷地成型具有微通道結(jié)構(gòu)的蓋片，且成本低廉；通過使用兩個掩膜板分別進(jìn)行光刻，便于形成不同厚度的光刻膠圖案層、最終成型蓋片的不同厚度區(qū)域；通過形成兩個填充腔，并在兩個填充腔中填充熱膨脹顆粒，能夠使得微液滴式pcr芯片具有封閉閥門。

附圖說明

為更清楚地闡述本發(fā)明的構(gòu)造特征和功效，下面結(jié)合附圖與具體實施例來對其進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖1是本發(fā)明實施例的蓋片的截面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是圖1中i處的局部放大結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例的微液滴式pcr芯片的制造方法的流程框圖；

圖4是圖3中的s220步驟的具體流程框圖；

圖5是本發(fā)明實施例的微液滴式pcr芯片的制造方法的又一個流程框圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實施例提供了一種微液滴式pcr芯片，用于生成pcr微液滴和進(jìn)行pcr反應(yīng)。

如圖1所示，微液滴式pcr芯片包括蓋片10。微液滴式pcr芯片還包括基片(圖未示)，基片與蓋片10相貼合，封裝成完整的芯片?；牟牧习ǖ幌抻诓Ａ?，蓋片10的材料包括但不限于為聚二甲基硅氧烷(pdms)，基片與蓋片10的貼合形式包括但不限于采用真空氧等離子體進(jìn)行鍵合封裝。

如圖1所示，蓋片10朝向基片的表面設(shè)有油相試劑流道11、pcr反應(yīng)液流道12、混合流道13、pcr反應(yīng)腔15和排液流道17。其中，油相試劑流道11是油相試劑的流動通道。pcr反應(yīng)液流道12是pcr反應(yīng)液的流動通道，pcr反應(yīng)液包括但不限于為dna(脫氧核糖核酸)目標(biāo)片段、dna引物、pcr反應(yīng)酶和底物的混合液。油相試劑與pcr反應(yīng)液分別流入混合流道13，在混合流道13內(nèi)進(jìn)行混合并形成微液滴。微液滴又流入pcr反應(yīng)腔15，在pcr反應(yīng)腔15內(nèi)進(jìn)行pcr反應(yīng)。經(jīng)過pcr反應(yīng)之后，多余的油相試劑從排液流道17排出。微液滴形成及pcr反應(yīng)的詳細(xì)過程，下文將繼續(xù)描述。

如圖1所示，混合流道13的相對兩端分別設(shè)有混合入口131和液滴出口132，油相試劑流道11和pcr反應(yīng)液流道12的一端均交匯于混合入口131，油相試劑流道11和pcr反應(yīng)液流道12的另一端分別設(shè)有油相試劑注入口113和pcr反應(yīng)液注入口121。并且，如圖2所示，油相試劑流道11的流道內(nèi)徑由油相試劑注入口113到混合入口131逐漸減小，pcr反應(yīng)液流道12的流道內(nèi)徑由pcr反應(yīng)液注入口121到混合入口131逐漸減小。油相試劑流道11及pcr反應(yīng)液流道12的最狹窄處可以是50um。pcr反應(yīng)腔15的兩側(cè)各設(shè)有一個與pcr反應(yīng)腔15連通的填充腔14和16，填充腔14與液滴出口132連通，填充腔16與排液流道17連通。在圖1所示視角下，填充腔16位于pcr反應(yīng)腔15的底部，便于多余油相試劑快速排出pcr反應(yīng)腔15。排液流道17遠(yuǎn)離填充腔16的一端設(shè)有排液口171。

本實施例的微液滴式pcr芯片中，各個流道及流道口的形狀并不限于為圖1中所示。例如，油相試劑流道11、pcr反應(yīng)液流道12、混合流道13、填充腔14、pcr反應(yīng)腔15、填充腔16和排液流道17的截面不限于為矩形，可以根據(jù)實際需要設(shè)計成其他圖形；油相試劑流道11、混合流道13和排液流道17不限于為呈90°折彎，也可以是直線或光滑彎曲的曲線；油相試劑注入口113、pcr反應(yīng)液注入口121和排液口171的截面不限于為圓形，可以根據(jù)實際需要設(shè)計成其他圖形。

填充腔14和16中均填充有熱膨脹顆粒。熱膨脹顆粒在加熱狀態(tài)下能夠迅速膨脹。例如，使用波長為532nm的強射激光器定點照射填充腔14和16中的熱膨脹顆粒，在照射溫度達(dá)到100℃時，只需1s的持續(xù)照射時間即可使熱膨脹顆粒達(dá)到完全膨脹的狀態(tài)?；蛘?，在其他熱源如熱板、烘箱等加熱容器的加熱下，熱膨脹顆粒同樣可以膨脹。在達(dá)到穩(wěn)定膨脹狀態(tài)后，熱膨脹顆粒堵塞填充腔14和16，將pcr反應(yīng)腔15隔絕，從而將pcr反應(yīng)腔15內(nèi)的微液滴封閉在內(nèi)。即熱膨脹顆粒起到封閉閥門的作用。

優(yōu)選的，未膨脹狀態(tài)下的熱膨脹顆粒，占據(jù)填充腔14和16容積的30％，填充腔14和16中剩余的70％容積，是預(yù)留給熱膨脹顆粒的膨脹空間。在其他實施例中，熱膨脹顆粒的容積占比可以根據(jù)實際需要確定。

以下將結(jié)合本微液滴式pcr芯片的結(jié)構(gòu)，詳細(xì)描述本實施例中微液滴生成和pcr反應(yīng)的過程，以突出本實施例方案的技術(shù)效果。以下所述僅為本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，本發(fā)明實際上并不限于此。

一、微液滴生成過程

按照圖1視角中的豎直方向放置微液滴式pcr芯片，即將微液滴式pcr芯片立起來放置。在微液滴式pcr芯片內(nèi)預(yù)先注入油相試劑。具體的，油相試劑從油相試劑注入口113進(jìn)入油相試劑流道11，依次流經(jīng)混合流道13和填充腔14，最終進(jìn)入pcr反應(yīng)腔15，并沉積在圖1中所示的pcr反應(yīng)腔15的底部。預(yù)先注入的油相試劑，是為后續(xù)的微液滴生成創(chuàng)造一個浸潤的油相環(huán)境。

然后，在微液滴式pcr芯片內(nèi)注入pcr反應(yīng)液。具體的，pcr反應(yīng)液從pcr反應(yīng)液注入口121進(jìn)入pcr反應(yīng)液流道12，流經(jīng)混合入口131，并在混合入口131處與油相試劑相遇。由于從油相試劑注入口113到混合入口131，油相試劑流道11的流道內(nèi)徑逐漸減小，從pcr反應(yīng)液注入口121到混合入口131，pcr反應(yīng)液流道12的流道內(nèi)徑也逐漸減小，在毛細(xì)作用下，混合入口131處的油相試劑液滴將對pcr反應(yīng)液液滴進(jìn)行“剪切”，使得pcr反應(yīng)液液滴包裹上一層油相試劑。油相試劑與pcr反應(yīng)液的混合液經(jīng)過混合通道13后，最終形成微環(huán)境獨立的微液滴。

微液滴從液滴出口132流出，并流入填充腔14及pcr反應(yīng)腔15。微液滴不斷地生成和流入，逐漸集聚在pcr反應(yīng)腔15內(nèi)。由于微液滴式pcr芯片是立起來放置并且預(yù)先浸潤有油相試劑的，油相試劑的比重又大于pcr反應(yīng)液的比重，因此進(jìn)入pcr反應(yīng)腔15的微液滴將會自動漂浮在上層、油相試劑位于下層。下層的多余油相試劑將會流經(jīng)填充腔16，從排液流道17的排液口171流出。

二、pcr反應(yīng)過程

待微液滴生成完畢后，使用高強度激光照射微液滴式pcr芯片的填充腔14和16，使熱膨脹顆粒完全膨脹，將填充腔14和16封閉。熱膨脹顆粒完全膨脹所需的光照時間極短，例如最多需要500ms的光照時間。并且在完全膨脹后，熱膨脹顆粒不需要繼續(xù)吸熱，也可以維持完全膨脹狀態(tài)。在激光照射下，熱膨脹顆粒更易發(fā)生膨脹，便于縮短pcr反應(yīng)時間；并且激光設(shè)備成本低廉，能減小實驗開支。在其他實施例中，也可以將微液滴式pcr芯片放置在熱板或烘箱等加熱容器內(nèi)，激發(fā)熱膨脹顆粒發(fā)生膨脹。

之后，將微液滴式pcr芯片置于pcr儀的加熱板上，并設(shè)定pcr反應(yīng)程序，進(jìn)行pcr反應(yīng)。在pcr反應(yīng)中微液滴式pcr芯片內(nèi)的溫度會上升，導(dǎo)致pcr反應(yīng)腔15內(nèi)的微液滴發(fā)生跑動。但是由于有處于膨脹狀態(tài)的熱膨脹顆粒存在，微液滴無法脫離pcr反應(yīng)腔15，從而能保證pcr反應(yīng)的正常進(jìn)行。在完成pcr反應(yīng)之后，可以使用熒光顯微鏡觀察并記錄pcr結(jié)果。

因此，本實施例的微液滴式pcr芯片，通過在pcr反應(yīng)腔15的兩側(cè)設(shè)置填充熱膨脹顆粒的填充腔14和16，使用填充熱膨脹顆粒的填充腔14和16作為封閉閥門，將pcr反應(yīng)腔15完全隔離，保證了pcr反應(yīng)腔15內(nèi)的pcr反應(yīng)正常進(jìn)行。本熱膨脹顆粒的熱膨脹性能良好，便于操控，由此也提升了本微液滴式pcr芯片的pcr反應(yīng)效率。

進(jìn)一步的，如圖1和圖2所示，油相試劑流道11在油相試劑注入口113處分為第一分流道111和第二分流道112。第一分流道111和第二分流道112匯聚于混合入口131。設(shè)置第一分流道111和第二分流道112，能使油相試劑雙向注入，加速了微液滴的生成，提升了pcr反應(yīng)效率。在其他實施例中，油相試劑流道11也可以不分叉。

進(jìn)一步的，如圖2所示，油相試劑注入口113與pcr反應(yīng)液注入口121處，分別設(shè)有過濾裝置114和過濾裝置122，用于對進(jìn)入油相試劑流道111和pcr反應(yīng)液流道12的試劑進(jìn)行過濾，去除試劑中的雜質(zhì)。過濾裝置114和過濾裝置122可以過濾一定顆粒直徑閾值以上的雜質(zhì)。例如，可以將大于50um的雜質(zhì)過濾掉，以避免雜質(zhì)顆粒堵塞油相試劑流道11及pcr反應(yīng)液流道12的最狹窄區(qū)域。

進(jìn)一步的，過濾裝置114可以包括多個間隔設(shè)在油相試劑流道111與112的內(nèi)壁上的凸起，過濾裝置122可以包括多個間隔設(shè)在pcr反應(yīng)液流道12的內(nèi)壁上的凸起。多個凸起陣列分布，相鄰?fù)蛊鸬拈g隔能阻擋顆粒直徑閾值以上的雜質(zhì)通過，從而起到過濾作用。在其他實施例中，過濾裝置114和/或過濾裝置122的結(jié)構(gòu)形式可以不限于為本實施例所述，只要能起到過濾雜質(zhì)的作用即可。

以上實施例詳細(xì)描述了本發(fā)明的微液滴式pcr芯片的結(jié)構(gòu)，以下實施例將詳細(xì)描述本微液滴式pcr芯片的制造方法。

如圖1所示，本實施例的微液滴式pcr芯片的制造方法200包括：

s210，提供基片和襯底，并制備具有第一圖案的第一掩膜板和具有第二圖案的第二掩膜板；

s220，使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通過光刻工藝在所述襯底上形成并排拼接的第一陽模和第二陽模，其中，所述第一陽模上與所述第一圖案對應(yīng)的區(qū)域形成有所述油相試劑流道的圖形、所述pcr反應(yīng)液流道的圖形，以及所述混合流道的圖形，所述第二陽模上與所述第二圖案對應(yīng)的區(qū)域形成有兩個所述填充腔的圖形、所述pcr反應(yīng)腔的圖形，以及所述排液流道的圖形；

s240，以所述第一陽模和所述第二陽模為模板形成蓋片基體，所述蓋片基體的表面設(shè)有未開設(shè)所述pcr反應(yīng)液注入口的pcr反應(yīng)液流道、未開設(shè)有所述油相試劑注入口的所述油相試劑流道、所述混合流道、所述pcr反應(yīng)腔、所述排液流道，及兩個所述填充腔；

s250，在兩個所述填充腔內(nèi)填充熱膨脹顆粒，并在所述蓋片基體的表面加工出所述油相試劑注入口、所述pcr反應(yīng)液注入口及所述排液流道的排液口，形成包含所述油相試劑流道、所述pcr反應(yīng)液流道、所述排液流道、所述混合流道、所述pcr反應(yīng)腔，及兩個所述填充腔的所述蓋片；

s260，對所述蓋片與所述基片進(jìn)行清洗，之后將所述蓋片與所述基片對準(zhǔn)貼合，得到所述微液滴式pcr芯片。

本微液滴式pcr芯片是先采用光刻工藝制造蓋片10，再將蓋片10與基片貼合而成。蓋片10中的填充腔14和16、pcr反應(yīng)腔15及排液流道17的厚度要大于油相試劑流道11、pcr反應(yīng)液流道12及混合流道13的厚度(所述厚度為圖1或圖2垂直于圖面方向的尺寸)，因此需要采用兩個掩膜板分別成型蓋片10的不同厚度區(qū)域。

具體而言，在s210中，先行制備所述基片、襯底和第一掩膜板、第二掩膜板。其中，第一掩膜板用于成型圖1中的油相試劑流道11、pcr反應(yīng)液流道12和混合流道13，第一掩膜板具有第一圖案，第一圖案包括對應(yīng)油相試劑流道11的圖形、pcr反應(yīng)液流道12的圖形，以及混合流道13的圖形。第二掩膜板則用于成型填充腔14和16、pcr反應(yīng)腔15和排液流道17。第二掩膜板具有第二圖案，第二圖案包括對應(yīng)填充腔14的圖形、pcr反應(yīng)腔15的圖形、填充腔16的圖形，以及排液流道17的圖形。第一圖案和第二圖案中各個圖形的形狀、尺寸與位置分布，與最終成型的蓋片10的各個流道或腔室的形狀、尺寸及位置分布相對應(yīng)。

在s220中，使用第一掩膜板和第二掩膜板，通過光刻工藝在襯底上形成第一陽模和第二陽模。其中，第一陽模上形成有與第一圖案對應(yīng)的圖形。即第一陽模上形成有油相試劑流道11的圖形、pcr反應(yīng)液流道12的圖形，以及混合流道13的圖形。第二陽模上形成有與第二圖案對應(yīng)的圖形。即第二陽模上形成有兩個填充腔14和16的圖形、pcr反應(yīng)腔15的圖形，以及排液流道17的圖形。并且，第一陽模和第二陽模并排拼接，使得第一陽模和第二陽模上的圖形相連而拼接成對應(yīng)蓋片10的各個流道或腔室的完整圖形。例如，第一陽模中混合流道13的圖形的兩端中，靠近封閉腔14的一端與封閉腔14拼接。

進(jìn)一步的，在s220中，所述使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通過光刻工藝在所述襯底上形成并排拼接的第一陽模和第二陽?？梢园ǎ?/p>

s221，在所述襯底上涂覆第一光刻膠層并進(jìn)行烘烤。例如，使用表面干凈的3英寸硅片作為襯底，在襯底上倒上1ml的su8-3050光刻膠并在勻膠機上進(jìn)行旋涂?？梢栽O(shè)置勻膠機以500rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)15秒，再以3000rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30秒的參數(shù)完成涂膠，最終形成50微米左右高度的第一光刻膠層。然后，對第一光刻膠層進(jìn)行烘烤，令光刻膠中的溶劑充分逸出，使第一光刻膠層干燥。例如，可以使用65攝氏度的熱板烘烤1分鐘，再升溫至95攝氏度繼續(xù)烘烤15分鐘。

s222，通過曝光將所述第一掩膜板上的所述第一圖案轉(zhuǎn)印到所述第一光刻膠層上，以在所述第一光刻膠層上形成與所述第一圖案對應(yīng)的油相試劑流道11的圖形、pcr反應(yīng)液流道12的圖形，以及混合流道13的圖形，之后除去所述第一掩膜板。應(yīng)理解，經(jīng)過曝光之后，第一圖案中的全部圖形都已轉(zhuǎn)印到了第一光刻膠層。另外，步驟s222完成之后，并不立刻進(jìn)行顯影，而是使用第二掩膜板進(jìn)行第二圖案的轉(zhuǎn)印。

s223，在所述襯底上涂覆第二光刻膠層并進(jìn)行烘烤，所述第二光刻膠層與所述第一光刻膠層并排拼接。例如，在襯底上倒上1ml的su8-3100光刻膠并在勻膠機上進(jìn)行旋涂?？梢栽O(shè)置勻膠機以500rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)15秒，再以3000rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30秒的參數(shù)完成涂膠，最終形成50微米左右高度的第二光刻膠層，第二光刻膠層與第一光刻膠此是并排拼接的。然后，對第二光刻膠層進(jìn)行烘烤，令光刻膠中的溶劑充分逸出，使第二光刻膠層干燥。例如，可以使用65攝氏度的熱板烘烤1分鐘，再升溫至95攝氏度繼續(xù)烘烤30分鐘。

s224，通過曝光將所述第二掩膜板上的所述第二圖案轉(zhuǎn)印到所述第二光刻膠層上，以在所述第二光刻膠層上形成與所述第二圖案對應(yīng)的pcr反應(yīng)腔15的圖形、排液流道17的圖形，以及兩個填充腔14和16的圖形，之后除去所述第二掩膜板。應(yīng)理解，經(jīng)過曝光之后，第二圖案中的全部圖形都已轉(zhuǎn)印到了第二光刻膠層。而且，第二光刻膠層上的圖形與第一光刻膠層上的圖形相連而拼接成對應(yīng)蓋片10的各個流道或腔室的完整圖形。在s224中除去第二掩膜板后，還可以對光刻膠層進(jìn)行烘烤。例如可以使用65攝氏度的熱板烘烤1分鐘，再升溫至95攝氏度繼續(xù)烘烤5分鐘，以此來使光刻膠中的溶劑充分逸出。

s225，去除未固化的光刻膠并做堅膜處理，得到所述第一陽模和所述第二陽模。例如，可以使用su8顯影液對第一陽模和第二陽模中未固化的光刻膠進(jìn)行顯影去除。最后再使用150攝氏度的熱板進(jìn)行堅膜處理，使殘留的光刻膠中的溶劑全部揮發(fā)，以提高第一陽模和第二陽模中的光刻膠與襯底之間的粘附性，以及光刻膠的抗腐蝕能力。

在s240中，將所述第一陽模和所述第二陽模上的圖形進(jìn)行轉(zhuǎn)印，得到所述蓋片基體，所述蓋片基體實為蓋片10的雛形。所述蓋片基體包括未開設(shè)pcr反應(yīng)液注入口121的pcr反應(yīng)液流道12、未開設(shè)有油相試劑注入口113的油相試劑流道11、混合流道13、pcr反應(yīng)腔15、排液流道17，及兩個填充腔14和16。

進(jìn)一步的，在s240中，所述以所述第一陽模和所述第二陽模為模板形成蓋片基體包括：

s241，在所述第一陽模和所述第二陽模上澆注模型膠，經(jīng)脫氣泡、固化后揭膜，得到所述蓋片基體。所述模型膠例如可以是聚二甲基硅氧烷(pdms)。其中，pdms中a膠與b膠的質(zhì)量比可以為1：10。所述固化處理例如可以是在80攝氏度的烘箱中烘烤30分鐘。經(jīng)過脫氣泡、固化后，第一陽模和第二陽模中的圖形能夠可靠地轉(zhuǎn)印到模型膠。然后揭下的形成有圖形的模型膠層，即為所述蓋片基體。

進(jìn)一步的，在s220與s240之間，本制造方法200還可以包括：

s230，使用脫模劑處理所述第一陽模和所述第二陽模，以使后續(xù)步驟s240中所述的揭膜更為順利。所述脫模劑例如可以是三氯甲基硅氧烷。

在s250中，在所述蓋片基體的填充腔14和16內(nèi)填充熱膨脹顆粒，并在所述蓋片基體上加工出油相試劑注入口113、pcr反應(yīng)液注入口121及排液流道17的排液口171，最終得到蓋片10。應(yīng)理解，蓋片基體的成型過程中已經(jīng)形成了混合入口131和液滴出口132，因而無需額外打孔。

在s260中，例如可以將蓋片10與基片一起放入等離子體清洗機清洗，待清洗完成后取出，將蓋片10與基片對準(zhǔn)鍵合封裝，最終形成完整的微液滴式pcr芯片。

本實施例的制造方法200，使用光刻工藝能夠方便快捷地成型具有微通道結(jié)構(gòu)的蓋片10，且成本低廉；通過使用兩個掩膜板分別進(jìn)行光刻，便于形成不同厚度的光刻膠圖案層、最終成型蓋片10的不同厚度區(qū)域；通過形成兩個填充腔，并在兩個填充腔中填充熱膨脹顆粒，能夠使得微液滴式pcr芯片具有封閉閥門。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易的想到各種等效的修改或替換，這些修改或替換都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。