本發(fā)明涉及一種從鐮形棘豆中分離制備5種具有抗炎活性化合物的方法。
背景技術(shù)：
：藏藥鐮形棘豆(OxytropisfalcateBunge)(藏藥名為莪達(dá)夏)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(OxytropisD.C.)多年生草本植物。生長(zhǎng)在2700～4300m的河灘、沙地、山坡、草甸，主要產(chǎn)于青藏高原。據(jù)《晶珠本草》記載，鐮形棘豆具有愈合瘡口、利便、防止骨刺產(chǎn)生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治療炭疽病、麻風(fēng)病及流感、扁桃體炎。臨床研究證明，鐮形棘豆對(duì)于預(yù)防、治療流行性感冒及慢性氣管炎有獨(dú)特療效。眾所周知，由于植物中化合物種類眾多且含量不一，從植物中直接大量獲得有實(shí)用價(jià)值的高純度化合物是極為困難的，尤其當(dāng)需要從中同時(shí)提取出多個(gè)目標(biāo)化合物時(shí)，則更為艱難。因此目前，盡管已知鐮形棘豆中包含多種化合物，卻并沒(méi)有以其為原料，同時(shí)得到多種高純度活性化合物的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種從鐮形棘豆中分離制備5種具有抗炎活性化合物的方法，所述5種具有抗炎活性的化合物為喬松素、4-羥基-2甲氧基查耳酮、7-羥基二氫黃酮、2,4-二羥基-二氫查爾酮和2,4-二羥基-查爾酮，包括以下步驟：(1)取鐮形棘豆總黃酮提取物，依次用石油醚和乙酸乙酯提取，取乙酸乙酯部位；(2)取乙酸乙酯部位干燥粉末，樹(shù)脂純化，甲醇洗脫，取洗脫物，干燥，得純化物；(3)將純化物用制備色譜分離，得到高純度的喬松素、4-羥基-2甲氧基查耳酮、7-羥基二氫黃酮、2,4-二羥基-二氫查爾酮和2,4-二羥基-查爾酮；色譜條件如下：檢測(cè)波長(zhǎng)：210～380nm；色譜柱：C18或C8色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫條件為：0～10min，50％A→60％A；10～40min，60％A→90％A。進(jìn)一步地，所述色譜柱為C18色譜柱。進(jìn)一步地，所述色譜條件的柱溫為20～30℃。進(jìn)一步地，所述樹(shù)脂為微孔樹(shù)脂或是大孔樹(shù)脂進(jìn)一步地，所述色譜條件的流速為10～100mL/min。進(jìn)一步地，所述檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。進(jìn)一步地，所述鐮形棘豆總黃酮提取物是通過(guò)下述方法制備得到的：(1)取鐮形棘豆，加入濃度為70％-80％醇類溶劑，微波提取得提取液，所述醇類溶劑與藥材的體積質(zhì)量比為10～35:1mL/g；(2)濃縮提取液，陶瓷膜濾過(guò)，有機(jī)膜純化，取濾液，干燥即得。進(jìn)一步地，所述醇類溶劑為濃度75％的乙醇，微波提取的功率為731W，提取時(shí)間為26分鐘，乙醇與藥材的體積質(zhì)量比為26:1。進(jìn)一步地，所述甲醇洗脫為用2～10倍柱體積的80％甲醇溶液洗脫。本發(fā)明還提供了喬松素、4-羥基-2甲氧基查耳酮、7-羥基二氫黃酮、2,4-二羥基-二氫查爾酮或2,4-二羥基-查爾酮在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以鐮形棘豆為原料，分離制備得到了喬松素、4-羥基-2甲氧基查耳酮、7-羥基二氫黃酮、2,4-二羥基-二氫查爾酮和2,4-二羥基-查爾酮，產(chǎn)品純度均大于98％。該方法制備量大，產(chǎn)品純度高，適合于工業(yè)應(yīng)用。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明圖1為分離制備色譜圖，得到化合物為喬松素(A)、4-羥基-2甲氧基查耳酮(B)、7-羥基二氫黃酮(C)、2,4-二羥基-二氫查爾酮(D)、2,4-二羥基-查爾酮(E)。具體實(shí)施方式鐮形棘豆于2015年8月采自青海省海北州，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所孫菁副研究員鑒定；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品檢定所(批號(hào)：100080-200707，含量為90.5％，)，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。自制超純水。微波提取儀(RWBC，南京蘇恩瑞公司)METTLERTOLEDOPL203和XS204電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。色譜甲醇(山東禹王公司)；制備色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)，陶瓷膜分離設(shè)備(合肥世杰膜有限公司)；有機(jī)膜分離設(shè)備(合肥世杰膜有限公司)，石油醚、乙酸乙酯為天津百世公司。料液比的單位為ml/g。實(shí)施例11.鐮形棘豆提取物的制備制備方法：1)微波提?。何⒉ㄌ崛」β蕿?31w，提取時(shí)間為26min，液料比為26，75％乙醇提取。2)提取液濃縮。3)陶瓷膜過(guò)濾除雜：0.1um陶瓷膜，壓力3MPa，流速50ml每分鐘，除去細(xì)渣子、泥土等雜質(zhì)，回收透過(guò)測(cè)溶液。4)有機(jī)膜分離純化：采用分子量為2000的分子量有機(jī)膜進(jìn)行純化，壓力為1MPa，流速50ml每分鐘，收集透過(guò)測(cè)溶液。5)干燥微波干燥、冷凍干燥、噴霧干燥。2.萃取：將所述棘豆提取物浸膏用其質(zhì)量10倍的去離子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位；將所述乙酸乙酯部位干燥至恒重后，得到乙酸乙酯部位干燥粉末。3.除雜將所述乙酸乙酯部位干燥粉末用其質(zhì)量的30倍的去離子水溶解后，過(guò)濾得到濾液A,該濾液注入微孔樹(shù)脂分離，并用10倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)為80％的甲醇溶液洗脫，收集洗脫物。該洗脫物經(jīng)冷凍干燥后，即得棘豆中抗炎活性成分。5.精制所述冷凍干燥樣品用質(zhì)量10倍甲醇溶解，經(jīng)0.45um微孔膜過(guò)濾后注入到具有制備色譜裝置中，0-10min，50-60％甲醇，10-40min60％-90％甲醇洗脫、在線紫外檢測(cè)，即得符合化學(xué)對(duì)照品要求且純度＞98％的化合物，產(chǎn)量約為70％。結(jié)果如圖1所示?；衔餅閱趟伤?A)、4-羥基-2甲氧基查耳酮(B)、7-羥基二氫黃酮(C)、2,4-二羥基-二氫查爾酮(D)、2,4-二羥基-查爾酮(E)(標(biāo)志性成分)。實(shí)施例2化合物的抗炎活性對(duì)化合物喬松素、4-羥基-2甲氧基查耳酮4’-hydroxy-2’-methoxychalcone、7-羥基二氫黃酮、2,4-二羥基-二氫查爾酮、2,4-二羥基-查爾酮進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)，5種化合物具有較好的抗炎活性。1細(xì)胞毒性研究RAW264.7細(xì)胞的毒性測(cè)定，MTT法。結(jié)果表1～5所示。表1表2表3表4表52培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7，分別檢測(cè)TNF-α，NO，PEG2的指標(biāo)，結(jié)果如表6-8所示，檢測(cè)方法見(jiàn)下述文獻(xiàn)：1張磬方，王強(qiáng)松，崔元璐，痹祺膠囊提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞模型的抗炎作用，中成藥，2014，36(1)：26-30.2汪娟，蔣維，王毅，降香中黃酮類化合物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞抗炎作用研究，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013,29(7)：681-684.3石孟瓊，覃惠林，張永峰，劉英，鄧為，楊文雁，等，木瓜三萜對(duì)脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞炎癥模型細(xì)胞因子的影響，中藥藥理與臨床，2016,32(3)：76-80.4羅福玲，趙恒光，李洪忠，萬(wàn)敬員，周岐新，粉防己堿對(duì)脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞炎癥模型細(xì)胞因子的作用，中草藥，2011,42(3):542-545.表6LPS誘導(dǎo)細(xì)胞PEG2含量變化濃度(uM)PEG2(pg/ml)空白1633.38LPS3345.28喬松素602639.25喬松素302760.13喬松素152962.624-羥基-2甲氧基查耳酮2.52829.314-羥基-2甲氧基查耳酮1.252828.114-羥基-2甲氧基查耳酮0.6252972.927-羥基二氫黃酮602561.097-羥基二氫黃酮302842.097-羥基二氫黃酮153146.892,4-二羥基-查爾酮12356.532,4-二羥基-查爾酮0.52970.72,4-二羥基-查爾酮0.253167.522,4-二羥基-二氫查爾酮202712.242,4-二羥基-二氫查爾酮102829.562,4-二羥基-二氫查爾酮53107.04表7NO含量濃度(uM)PEG2(umol/L)空白1.93LPS6.03喬松素603.3喬松素304.05喬松素154.54-羥基-2甲氧基查耳酮2.53.564-羥基-2甲氧基查耳酮1.254.294-羥基-2甲氧基查耳酮0.6255.047-羥基二氫黃酮603.587-羥基二氫黃酮304.647-羥基二氫黃酮155.652,4-二羥基-查爾酮12.82,4-二羥基-查爾酮0.54.812,4-二羥基-查爾酮0.255.392,4-二羥基-二氫查爾酮203.792,4-二羥基-二氫查爾酮104.522,4-二羥基-二氫查爾酮55.32表8TNF-α含量變化濃度(uM)TNF-α(pg/ml)空白52.37LPS207.45喬松素60122.11喬松素30129.06喬松素15151.164-羥基-2甲氧基查耳酮2.5138.994-羥基-2甲氧基查耳酮1.2510.484-羥基-2甲氧基查耳酮0.625161.427-羥基二氫黃酮60113.787-羥基二氫黃酮30148.077-羥基二氫黃酮15162.272,4-二羥基-查爾酮195.092,4-二羥基-查爾酮0.5160.242,4-二羥基-查爾酮0.25183.952,4-二羥基-二氫查爾酮20134.612,4-二羥基-二氫查爾酮10138.242,4-二羥基-二氫查爾酮5169.66鐮形棘豆具有抗炎作用，至目前為止，少有文獻(xiàn)報(bào)道鐮形棘豆中活性化合物分離制備，本發(fā)明方法采用制備色譜儀對(duì)鐮形棘豆中抗炎活性化合物進(jìn)行分離制備，并得到純度較高的化合物，并進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，分離得到的化合物主要通過(guò)抑制炎癥因子NO、TNF-α等釋放，直接發(fā)揮抑制作用，從而表現(xiàn)出抗炎作用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便實(shí)用，為鐮形棘豆的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，同時(shí)為藥品生產(chǎn)也提供了數(shù)據(jù)支持。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3