本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種化合物F083-0063的抗腫瘤應(yīng)用。

背景技術(shù)：

保羅樣激酶1(PLK1)作為細胞周期必要的調(diào)節(jié)因子，是公認的抗腫瘤藥物靶點。PLKs最初作為有絲分裂必需的基因之一發(fā)現(xiàn)于果蠅中，是一類從酵母到人類都高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1-3]。人類的PLKs共包括五個成員[4]。這類激酶在N端有一個保守的酶活性區(qū)域(KD)外,在C端有一個高度保守的(叫做polo-box-PBD)的非催化活性區(qū)，主要調(diào)節(jié)蛋白和底物或調(diào)節(jié)因子之間的相互作用[5,6]。PLK1在調(diào)節(jié)細胞分裂的過程中(包括中心體功能、有絲分裂中染色體動態(tài)平衡、紡錘體功能和胞質(zhì)分裂)發(fā)揮著多種必需和非必需的功能[3,6,7]。

大量的研究將PLKs與腫瘤從不同的方面聯(lián)系在一起。PLK1在多種腫瘤細胞系中高表達，且和不良預(yù)后密切相關(guān)[8-10]。與健康組織相比，多種不同組織來源的腫瘤對低表達的PLK1更敏感，這在理論上打開了一個治療契機。更有研究發(fā)現(xiàn)Ras轉(zhuǎn)化和p53缺陷的細胞與PLK1的高活性密切相關(guān)[11-14]?；谏鲜鲈?，PLK1被公認為是一個很好的抗腫瘤藥物靶點。而PLK2和3則在細胞周期檢驗點發(fā)揮作用并具有抗細胞增殖的功能，被認為屬于腫瘤抑制因子[15-18]。

近些年來發(fā)現(xiàn)了很多PLK1的激酶活性抑制劑，有一些已經(jīng)進入了臨床研究階段[19,20]。由于激酶結(jié)構(gòu)域在激酶中高度保守，使得PLK1抑制劑的特異性不強，尤其對PLK家族其他成員[21]。BI2536及其衍生物Volasertib(BI6727)是目前最有前景的PLK1抑制劑[22,23]。Volasertib處于臨床前第三階段，已取得了不錯的療效，特別是對急需新藥的急性髓細胞樣白血病(AML)的治療上[24]。2013年，F(xiàn)DA給與Volasertib“突破性治療”的高度評價。這些發(fā)展都在此證明了PLK1作為抗腫瘤藥物靶點的可行性。然而，毒性仍然是一個函待解決的難題[24]。同時BI2536和Volasertib對于PLK2、3還有其他激酶也具有抑制活性，IC₅₀值相當[22,23,25]。由于PLK2和3具有類似腫瘤抑制的功能，理想的藥物還是只針對PLK1。

利用抑制PBD來干預(yù)PLK1的功能成為近年來的替代策略。PLK1有功能的PBD是細胞分裂必不可少的[26-28]。PLK1在中心體、著絲粒、胞質(zhì)分裂中的中心紡錘體等發(fā)揮作用均需要通過PB才能與底物結(jié)合并[3，29,30]。不同于KD，PBD是PLK家族所特有的且不同成員之間的PBD在序列和結(jié)構(gòu)上相較KD相似度更低。并且不同PLK成員傾向結(jié)合的磷酸肽基序不同[6，31,32]。因此，PBD是比KD更適合于篩選針對PLK1的抑制劑的靶點。除此之外，PLK1的功能有些更依賴于KD，有些更依賴于PBD。因此，抑制PBD和抑制KD導(dǎo)致對PLK1功能影響是不同的，這使得PBD抑制劑更有優(yōu)勢[33]。PBD抑制劑還能協(xié)同性的和KD抑制劑一起發(fā)揮作用。

基于此，采用PBD作用篩選PLK1抑制劑的靶點已越來越引起關(guān)注。Poloxin和其同系物thymoquinone(TQ)的發(fā)現(xiàn)第一次證明了這個策略的可行性，這兩個化合物是利用體外的熒光偏振模型篩選得到的[34,35]。它們均能在體外低納摩爾水平抑制PBD活性。但是，這兩個化合物需要更高的濃度才能誘導(dǎo)凋亡和擾亂有絲分裂。PBD和TQ共結(jié)晶顯示TQ是通過非共價結(jié)合于PBD的磷酸肽結(jié)合區(qū)域[36]。通過熒光標記的PBD與固定化的磷酸肽結(jié)合的體外檢測篩選得到了另一個PBD抑制劑PPG[37]。此化合物也同樣存在需要高濃度才能影響有絲分裂的問題。最具潛力的PBD化學抑制劑是磷酸肽或類肽分子。但是，此類抑制劑的細胞通透性成為其一大瓶頸[38,39]。

尋找新型的以Plk1PBD為靶點的抗腫瘤小分子抑制劑將對Plk1高表達的腫瘤治療帶來新的希望。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先涉及一種具備抗腫瘤活性的小分子化合物F083-0063，其結(jié)構(gòu)如式1所示，化學名為3-甲酰胺-N-(呋喃-2-基甲基)-1-硫酮-5-氧代-8氯-4,5-雙氫-1H–噻唑并[3,4-a]喹唑啉，

本發(fā)明還涉及以所述的小分子化合物F083-0063為主要活性成分的制劑或藥物。

本發(fā)明還涉及一種抗腫瘤藥物，所述的藥物包括，

(1)治療有效量的小分子化合物F083-0063；

(2)必要的藥用輔料。

本發(fā)明還涉及所述的小分子化合物F083-0063在制備如下制劑中的應(yīng)用；

(1)結(jié)合于Plk1的PBD的特定區(qū)域并阻斷其功能的阻斷劑，所述的Plk1的PBD的特定區(qū)域為Plk1蛋白三級結(jié)構(gòu)中的His538、Lys540、Arg557構(gòu)成的結(jié)構(gòu)區(qū)域；

(2)阻滯細胞至G2/M期的細胞周期調(diào)節(jié)劑，所述的細胞優(yōu)選為腫瘤細胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細胞；

(3)促進細胞凋亡制劑，所述的細胞優(yōu)選為腫瘤細胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細胞；

(4)抑制腫瘤細胞遷移的抑制劑，所述的腫瘤細胞優(yōu)選為子宮癌細胞。

本發(fā)明還涉及所述的小分子化合物F083-0063的如下應(yīng)用：

(1)抑制Plk1與其天然配體結(jié)合；

(2)阻滯細胞至G2/M期；

(3)促進細胞凋亡，所述的細胞優(yōu)選為腫瘤細胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細胞；

(4)抑制腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移，所述的腫瘤細胞優(yōu)選為子宮癌細胞；

(5)抑制腫瘤和/或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，所述的腫瘤優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌。

本發(fā)明還涉及一種以Plk1 PBD活性中心的關(guān)鍵氨基酸空間結(jié)構(gòu)為靶標的Plk1抑制劑的篩選方法，所述的Plk1 PBD活性中心的關(guān)鍵氨基酸空間結(jié)構(gòu)為Plk1蛋白的His538、Lys540、Arg557在具備生物學活性的Plk1蛋白三級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象中形成的立體結(jié)構(gòu)，所述的篩選方法為：使用分子對接預(yù)測靶標和化合物的相互結(jié)合。

附圖說明

圖1、F083-0063的結(jié)構(gòu)及基本功能，1A，F(xiàn)083-0063的分子結(jié)構(gòu)；1B，F(xiàn)083-0063的量效關(guān)系曲線；1C，F(xiàn)083-0063在HeLa細胞中的細胞毒性。

圖2、F083-0063的功能驗證，2A，F(xiàn)083-0063時間依賴性的引發(fā)HeLa細胞G2/M期阻滯；2B，F(xiàn)083-0063引發(fā)時間依賴性的G2/M期阻滯的定量分析；2C，F(xiàn)083-0063劑量依賴性的引發(fā)HeLa細胞G2/M期阻滯；2D，F(xiàn)083-0063引發(fā)劑量依賴性的G2/M期阻滯的定量分析；2E，Western Blot分析F083-0063引發(fā)G2/M期阻滯。

圖3、F083-0063促進腫瘤細胞凋亡，3A，F(xiàn)083-0063引發(fā)HeLa細胞的大量凋亡；3B，F(xiàn)083-0063引發(fā)細胞大量凋亡的定量分析。

圖4、F083-0063抑制細胞遷移，4A，F(xiàn)083-0063時間依賴性的抑制HeLa細胞遷移；4B，F(xiàn)083-0063引發(fā)時間依賴性的細胞遷移的定量分析；4C，F(xiàn)083-0063劑量依賴性的抑制HeLa細胞遷移；4D，F(xiàn)083-0063引發(fā)劑量依賴性的細胞遷移的定量分析。

圖5、F083-0063與Plk1PBD結(jié)合方式驗證，F(xiàn)083-0063和Plk1PBD分子對接示意圖。

具體實施方式

實施例1.細胞的培養(yǎng)

人成骨肉瘤細胞MG63、人子宮頸癌細胞HeLa、人結(jié)腸癌細胞HCT-116、人結(jié)腸癌細胞HT-29、人肝癌細胞HepG2、人前列腺癌PC3、人肝細胞L02，所有細胞均為貼壁細胞，約48h傳代一次。待細胞長滿后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS漂洗細胞后棄掉，之后加適量胰酶，在室溫下消化約2-10min，棄掉消化液，立即加入含10％FBS的培養(yǎng)基，以抑制胰蛋白酶活力，用彎頭吸管反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞，使細胞完全脫離瓶底且吹打使之分散為單個細胞懸液。再按1:3-1:6比例接種細胞懸液于新的細胞瓶內(nèi)，然后補加適量完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃，5％CO₂。

實施例2.化合物F083-0063對PLK1PBD抑制活性的測定

本活性測定采用熒光偏振(FP)高通量篩選模型進行化合物活性的測定。

測定原理：

主要基于熒光分子的偏振性與其受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度密切相關(guān)的原理。當熒光分子受平面偏振光激發(fā)時，如果熒光分子在受激發(fā)時保持靜止狀態(tài)，那么發(fā)射光將位于同樣的偏振平面；如果熒光分子在受激發(fā)時保持旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，那么發(fā)射光將位于與激發(fā)光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激發(fā)熒光素，可以在垂直的和水平的偏振平面檢測發(fā)射光光強(發(fā)射光從垂直平面偏向水平平面的程度與熒光素標記的分子的遷移率有關(guān))。如果分子量較大，受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較慢，則發(fā)射光偏振程度較高；如果分子量較小，受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較快，則發(fā)射光相對于激發(fā)光平面將去偏振化。因此，本研究擬建立的熒光偏振高通量篩選方法將以FITC-Poloboxtide((FITC-GPMQSpTPLNG-OH；MW:1583.61；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm，由上海強耀生物科技有限公司合成)作為Plk1PBD的模擬底物，從而進行靶向Plk1PBD的小分子抑制劑的活性測定。

測定方法：

(1)將400nM Plk1PBD溶液以30μL/孔依次加入到384孔板中，將10mg·mL^-1的F083-0063進行倍比稀釋后，以終濃度10μg·mL^-1、5μg·mL^-1、2.5μg·mL^-1、2μg·mL^-1、1μg·mL^-1、0.5μg·mL^-1、0.25μg·mL^-1、0.1μg·mL^-1、0.05μg·mL^-1、0.02μg·mL^-1、0.01μg·mL^-1依次加入到384孔板中并做好對應(yīng)的準確記錄，以同時加入0.3μL DMSO孔作為陰性對照(Negative Control,0％Inhibition)；以僅含有60μL 30nM FITC-Probe孔為陽性對照(Positive Control,100％Inhibition)。將其混勻后室溫緩慢振搖，孵育60min。

(2)將60nM FITC-Probe以30μL/孔依次加入到384孔板中的上述各反應(yīng)孔中，將其混勻后室溫緩慢振搖，避光孵育15min，以多功能微孔板檢測儀進行mP檢測。

(3)用如下方程計算待測化合物抑制率：

并以GraphPad Primer 5擬合抑制曲線確定化合物F083-0063的表觀IC₅₀。

以FP實驗測得不同濃度化合物對Plk1PBD的抑制率(表1)對化合物F083-0063進行量效關(guān)系分析，表觀IC₅₀≈1.9±0.1μM(圖1B)，能在體外抑制Plk1PBD的活性。

選用HeLa細胞作為腫瘤細胞的代表細胞，以MTT方法進行小分子抑制劑F083-0063的細胞毒性初步評價。在上述實驗中，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑F083-0063對HeLa細胞具有明顯的細胞毒性，其IC₅₀值約為5.8±0.6μM(圖1C，表2)。

表1不同濃度化合物F083-0063對Plk1PBD的抑制率

實施例3、小分子抑制劑F083-0063的細胞毒性測定

利用MTT比色實驗進行。

測定原理：

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在560nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與活細胞數(shù)成正比。

測定方法：

(1)從保存細胞凍存管的液氮中取出細胞凍存管后，迅速投入37℃水浴中，輕輕搖動使其盡快融化。然后從37℃水浴中取出細胞凍存管，用乙醇消毒后，1000rpm×5min離心，小心地吸去上清液，再加入1mL培養(yǎng)液重懸細胞并再次離心。用生長培養(yǎng)基適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，接種密度以5×10⁵/mL為宜。將細胞培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱37℃、5％CO2靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化單層貼壁培養(yǎng)的細胞，用含10％FBS的生長培養(yǎng)基配成單細胞懸液，以4～5×10³/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積200μL，同時96孔細胞培養(yǎng)板的邊緣孔以無菌PBS填充，盡量避免邊緣效應(yīng)。

(3)將上述接種細胞的96孔細胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、5％CO₂條件下靜止培養(yǎng)24小時至對數(shù)生長期。

(4)準備從10μg·mL^-1開始以生長培養(yǎng)基梯度稀釋的化合物F083-0063，共制備8個梯度濃度(100μM、75μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM)的稀釋液。

(5)小心地吸棄各孔內(nèi)的生長培養(yǎng)基后，將化合物F083-0063的上述8個梯度濃度分別加入對應(yīng)96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200μL，每個濃度設(shè)置3組復(fù)孔并做好相應(yīng)的標記。以加入DMSO組為陰性對照，只含正常培養(yǎng)基組為陽性對照，各組分別設(shè)置3組復(fù)孔。

(6)在37℃、5％CO₂培養(yǎng)條件下，化合物F083-0063與細胞繼續(xù)共培養(yǎng)48小時。小心地吸棄各孔內(nèi)生長培養(yǎng)基，每孔各加入200μL新鮮生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。

(7)培養(yǎng)24小時后，每孔加入MTT溶液22μL，37℃避光培養(yǎng)4小時后終止培養(yǎng)。小心地吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)基后，每孔加入150μL DMSO，避光震蕩15min，使甲瓚充分溶解呈紫色。

(8)選擇560nm波長，在多功能微孔板檢測儀上測定各孔OD值，記錄并保存數(shù)據(jù)，以GraphPad Prism 5擬合化合物F083-0063在各細胞株的生長抑制曲線并計算其IC₅₀值。

本實驗選用本室保存的6株臨床常見的人癌細胞系和1株正常人源細胞，以MTT比色法進行小分子抑制劑F083-0063的細胞毒性評價。發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑F083-0063對6株腫瘤細胞具有不同的細胞毒性，IC₅₀值差別較大，其中對Hela的細胞毒性最為明顯，IC₅₀小于10μM(表2)。但是，小分子抑制劑F083-0063對L02代表的正常細胞的細胞毒性與腫瘤細胞的細胞毒性相比并沒有顯著差別。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑F083-0063在體外對腫瘤細胞和正常細胞具有等同的細胞毒性。

表2小分子抑制劑F083-0063對腫瘤細胞和正常細胞的細胞毒性

實施例4、小分子抑制劑F083-0063對Hela細胞周期的影響

利用流式細胞儀和Western blot進行。

測定原理：

由于細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期,獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

測定方法：

周期同步化的HeLa細胞是后續(xù)FACS和Western Blot進行細胞周期分析的基礎(chǔ)，周期同步化方法如下：

(1)將HeLa細胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁵/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板，接種量2mL/孔。將細胞板置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h至指數(shù)生長期。

(2)細胞貼壁后，小心地棄掉生長培養(yǎng)基后，以無菌PBS漂洗細胞1次。然后加入終濃度2mM Thymidine的生長培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

(3)小心地棄掉含2mM Thymidine的生長培養(yǎng)基后，以無菌PBS漂洗細胞1次。更換新鮮的生長培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

(4)輕輕地棄掉正常生長培養(yǎng)基后，以無菌PBS漂洗細胞1次。然后再次加入終濃度2mM Thymidine的生長培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)12h后，此時所有的HeLa細胞的周期將被阻滯在G1/S期。

將同步化的HeLa細胞以小分子抑制劑F083-0063作用24h，在各設(shè)置的時間點收集細胞并與DMSO對照組比較，以FACS進行HeLa細胞周期的綜合分析。

以FACS進行HeLa細胞周期的綜合分析：

(5)在上述含有細胞周期同步化的HeLa細胞6孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入含有20μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、12h、16h和24h時間點分別收集細胞。

(6)在上述各時間點收集的細胞分別以4℃預(yù)冷的PBS漂洗細胞3次并以0.25％胰酶消化細胞，再以4℃預(yù)冷的PBS重懸細胞，1000rpm×6min離心并收集細胞。

(7)小心地棄掉離心后的細胞上清液，緩慢加入4℃預(yù)冷的含70％乙醇的PBS固定液1mL充分懸浮細胞，4℃固定30min。

(8)固定后的細胞以1200rpm×6min離心并收集細胞，小心地棄掉乙醇固定液。爾后加入100μL PI/RNase A溶液并充分混勻，37℃避光孵育30min。

(9)各樣品做好對應(yīng)的標記后，將細胞過濾到BD流式細胞管，各管再補加400μL PBS后，以FACS進行分析。

(10)將含5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)基加入到周期同步化的HeLa細胞中并在作用12h后收集細胞，固定步驟及PI染色步驟同上所述，以FACS進行量效關(guān)系分析。

或，以Western Blot進行HeLa細胞周期的綜合分析：

(5)將周期同步化的HeLa細胞以5μM、10μM和15μM小分子抑制劑F083-0063作用16h后，收集細胞。各收集的細胞樣品分別加入60μL RIPA細胞裂解液(含100μg/mL PMSF)，充分懸浮細胞，冰浴30min，12000rpm×30min離心，小心地吸取上清液并做好對應(yīng)的標記，再以BCA法進行裂解蛋白的定量。裂解蛋白定量后，將各樣品的蛋白裂解液濃度調(diào)整為2mg/mL，每次上樣量約為30～40μg/Lane。

(6)準備15％SDS-PAGE，上樣量30μg/Lane。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將聚丙烯酰胺凝膠和2張3mm Bio-Rad濾紙放入4℃預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡2～5min。

(7)將裁剪的與膠尺寸相當?shù)腜VDF膜先用甲醇潤濕30s，再用蒸餾水洗1min，然后置于上述1×轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡2min。

(8)在Bio-Rad半干法轉(zhuǎn)膜儀的正極上放置一張平衡過的濾紙，將PVDF膜整齊地放在濾紙上，然后將聚丙烯酰胺凝膠平鋪于PVDF膜上，最后在該凝膠上面再整齊地放置另一張平衡過的濾紙。用潔凈的試管小心地輕壓，以去除夾層中的氣泡，然后以上述少許1×轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕周圍，使其保持一定的導(dǎo)電性。最后放置轉(zhuǎn)膜儀的負極并壓緊、壓實。

(9)Western Blot電轉(zhuǎn)條件設(shè)置：恒流轉(zhuǎn)膜0.2A×30min。

(10)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用鑷子小心地取出PVDF膜浸入TBST洗滌1次，再用鑷子小心夾出并室溫晾干后，依據(jù)預(yù)染Marker標示分子量和目的蛋白分子量適當裁剪PVDF膜并做好相應(yīng)的標記。

(11)將裁剪的PVDF膜放入含5％Milk-TBST的封閉液中室溫緩慢振搖2h進行封閉。

(12)封閉結(jié)束后，取出PVDF膜，將其放入到TBST中漂洗3次，每次10min。漂洗完畢后將標記好的PVDF膜放入孵育盒中進行一抗孵育反應(yīng)。

(13)按照相關(guān)抗體說明書，以封閉液稀釋上述抗體并將抗體稀釋液置于孵育盒中，室溫緩慢振搖1h后，4℃過夜。

(14)從孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗完畢后再將PVDF膜放入孵育盒中進行二抗孵育反應(yīng)。

(15)用封閉液稀釋對應(yīng)的HPR-Secondary Antibody(WB 1:2000)并將其置于含有對應(yīng)一抗孵育完畢的PVDF膜的孵育盒中，室溫緩慢振搖1～2h。

(16)從孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。然后進行顯色反應(yīng)。

(17)顯色反應(yīng)：在PVDF膜正面(印記目的蛋白一面)加入適量增強型HRP底物化學發(fā)光液(按照說明書配制A:B＝1:1)，立即置于凝膠成像儀中曝光5～10s后成像。

從流式結(jié)果可以看到，化合物F083-0063作用12h后G2/M的含量為53.3±1.8％，作用16h時G2/M的含量為7.3±0.2％，作用24h時G2/M的含量為3.1±0.4％，如(表3，圖2A，2B)所示趨勢呈現(xiàn)逐漸下降，這應(yīng)該是與化合物在不同時間的作用強度有關(guān)。接下來我們選取12h作為G2/M期阻滯的比較時間點。

在流式實驗中發(fā)現(xiàn)，當5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制劑F083-0063作用于周期同步化的HeLa細胞12h時，與DMSO對照組相比，隨著小分子抑制劑F083-0063劑量的不斷增加，HeLa細胞的G2/M期比率逐漸升高(表4)。與DMSO對照組的G2/M期比率0.3±0.1％相比，20μM小分子抑制劑F083-0063作用于周期同步化的HeLa細胞12h后，HeLa細胞的G2/M期比率達到56.4±2.3％，HeLa細胞的G2/M期比率呈劑量依賴性的增加趨勢(圖2C，2D)。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑F083-0063對HeLa細胞的G2/M期阻滯作用具有明顯的劑量依賴性。

表3化合物F083-0063作用12h后對細胞周期的阻滯效果

表4化合物F083-0063劑量變化對HeLa細胞的G2/M期的阻滯效率

Western Blot實驗中，我們發(fā)現(xiàn)5μM、10μM、15μM小分子抑制劑F083-0063作用12h的HeLa細胞中Plk1、Cyclin B1、pHH-3隨著F083-0063劑量的不斷增加而逐漸積聚。其中，15μM小分子抑制劑F083-0063引發(fā)的周期阻滯中含有大量的M期細胞(圖2D)。Plk1、CyclinB1、pHH-3在HeLa細胞周期中的大量積聚表明，小分子抑制劑F083-0063引發(fā)了HeLa細胞的G2/M期阻滯。

綜上所述，小分子抑制劑F083-0063可以引發(fā)HeLa細胞發(fā)生G2/M期阻滯。

實施例5.小分子抑制劑F083-0063對HeLa細胞凋亡的影響

利用Annexin V/PI雙染法進行。

測定原理：

磷酯酰絲氨酸(PS)是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。但PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細胞，即凋亡晚期的細胞和壞死細胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI-)；而左上象限為許可范圍內(nèi)的檢測誤差。

測定方法：

Annexin V/PI雙染法

(1)將HeLa細胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁶/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板，接種量2mL/孔。將細胞板置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h至指數(shù)生長期。

(2)上述HeLa細胞培養(yǎng)24后，以無菌PBS清洗細胞3次，更換分別含有DMSO、5μM、10μM、15μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)液。做好相應(yīng)標記后，將細胞板置于37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(3)取出上述細胞培養(yǎng)板，以PBS小心地漂洗1次，再以0.25％胰酶消化細胞，1000rpm×5min離心，收集細胞。

(4)用去離子水按1:4稀釋結(jié)合緩沖液(1×結(jié)合緩沖液：10mM Hepes/NaOH、140mM NaCl,2.5mM CaCl₂pH7.4)。

(5)將上述消化的HeLa細胞以4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，用250μL 1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為5×10⁶/mL。

(6)取100μL的細胞懸液(細胞數(shù)約為5×10⁵)于EP管中，再加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，室溫避光孵育30min。

(7)在上述反應(yīng)體系中再加入5μL PI，室溫避光孵育5～10min。

(8)將上述細胞懸液過濾到BD流式管中，再補加400μL PBS并做好對應(yīng)的標記，立刻以流式細胞儀(BD Biosciences)進行檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

根據(jù)雙染實驗中，小分子抑制劑F083-0063作用24h后，通過流式細胞儀檢測與對照組相比加藥組在5μM、15μM、25μM濃度下，隨著小分子抑制劑劑量的逐漸增加，HeLa細胞的凋亡比例逐漸增大。如早期凋亡比例由6.2±0.1％增加到37.1±0.4％(表5，圖3A，3B)。當濃度達到25μM時早期凋亡比例增加到43.6±3.5％?？梢娦》肿右种苿┛梢院苊黠@的引起細胞凋亡并且具有較為明顯的濃度依賴性。

表5化合物F083-0063劑量變化對細胞凋亡的影響

綜上所述，小分子抑制劑F083-0063可以引發(fā)HeLa細胞發(fā)生大量凋亡。

實施例6.小分子抑制劑F083-0063對HeLa細胞遷移的影響

利用細胞劃痕法進行

測定原理：

細胞劃痕法是測定腫瘤細胞的運動性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等試驗條件觀察其對腫瘤細胞遷移的影響。

測定方法：

劃痕實驗

(1)事先將Maker筆，直尺，槍，槍頭均放入超凈臺中紫外照射至少30min，先用Maker筆在6孔板的背面比著直尺劃線，線與線之間距離至少為0.5-1cm，橫穿過孔，每孔至少穿過3條線，以便在不同視野下觀察。

(2)以5×10⁵個/孔的密度接種于6孔板中，接種的密度以不同細胞而有所差異，掌握為過夜鋪滿為好。

(3)培養(yǎng)24h后，顯微鏡下觀察細胞的生長情況，看細胞是否鋪滿，若狀態(tài)良好，則用槍頭比著直尺，劃得線盡量垂直于背面的橫線痕跡，槍頭要垂直，不要傾斜。

(4)用滅過菌的PBS清洗3次，除去劃痕下的細胞，加入以配好濃度的陽性化合物(5μM、10μM、15μM、20μM)，放入37℃5％CO2的培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)48h后取樣，拍照。

(5)小分子抑制劑F083-0063濃度為20μM，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后，進行取樣拍照。

20μM的小分子抑制劑F083-0063，分別作用12h、24h、36h、48h后觀察細胞的遷移情況，與對照組相比，12h與對照組相近，隨時間延長，加藥組遷移明顯受到抑制，表現(xiàn)出時間依賴性(圖4A、4B)。

細胞遷移結(jié)果如(圖4C、4D)所示,與對照組相比,加藥組的細胞遷移能力明顯減弱,尤其是在20μM時,由最開始的58.8±0.5％變?yōu)?9.6±0.7％。隨著劑量的逐漸增加,遷移率明顯受抑制,存在劑量依賴性。

實施例7.小分子抑制劑F083-0063與Plk1PBD結(jié)合方式的研究-分子對接

利用Discovery Studio 4.0軟件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)軟件進行。

測定原理：

分子對接(Molecular Docking)是指配體與受體之間通過能量匹配和幾何匹配而互相識別的過程，其主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用力、范德華力等。近年來，隨著計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)的飛速發(fā)展，分子對接技術(shù)已成為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計和計算機輔助藥物設(shè)計的重要方法之一。Discovery Studio 4.0軟件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)是目前全球應(yīng)用最為廣泛的計算機輔助設(shè)計平臺之一，其在計算分子模擬和藥物設(shè)計領(lǐng)域都有著極其廣泛的應(yīng)用。

Discovery Studio 4.0軟件有多個模塊，主要功能包括：蛋白質(zhì)的表征(包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)、同源建模、分子力學計算、分子動力學模擬、基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(包括配體-蛋白質(zhì)相互作用、全新藥物設(shè)計和分子對接)、基于小分子的藥物設(shè)計(包括定量構(gòu)效關(guān)系、藥效團、數(shù)據(jù)庫篩選、ADMET)和組合庫的設(shè)計與分析等。

測定方法：

在以Discovery Studio 4.0軟件進行的小分子抑制劑F083-0063和Plk1PBD的分子對接中，我們選擇PDB(Protein Data Bank)中4H71結(jié)構(gòu)。

使用Discovery Studio 4.0軟件將小分子抑制劑F083-0063與Plk1PBD的活性中心(PDB code 4H71)進行分子對接。PLK1PBD結(jié)構(gòu)域是由His538、Lys540、TRP414(是氨基酸中的一種色氨酸，是人體必需氨基酸)、Lys540和Asp416等多個氨基酸組成，通過對接結(jié)果顯示(圖5)，F(xiàn)083-0063與PLK1PBD的結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出較高的親和性，其中小分子抑制劑苯環(huán)上的羰基能與His538、Lys540、TRP414形成牢固的氫鍵，同時與TRP414、ASP416、ARG516以及ARG557形成疊加的π鍵，此外，F(xiàn)083-0063與PLK1PBD還存在非共價鍵的競爭結(jié)合方式，進而使得小分子抑制劑與PBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合得更加緊密。

最后需要說明的是，以上實施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)，而不用于對本發(fā)明保護范圍的限制。