本發(fā)明屬于有機(jī)分子分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的有機(jī)分子用于特異性識(shí)別鋅離子并用于細(xì)胞、切片及斑馬魚(yú)中鋅離子成像。

背景技術(shù)：

鋅離子作為生物體系中穩(wěn)定的d區(qū)元素，在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控中扮演著重要的角色，同時(shí)也是大腦神經(jīng)信號(hào)傳遞過(guò)程中必需的離子信號(hào)分子。當(dāng)大腦中的鋅離子的穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，例如阿爾茲海默癥等的神經(jīng)退行性疾病可能就會(huì)由此產(chǎn)生。而且早期的一些臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明鋅離子的螯合物可以抑制aβ的沉積，且自由的鋅離子會(huì)誘導(dǎo)淀粉樣蛋白沉積。而淀粉樣蛋白沉積又是阿爾茲海默癥的一個(gè)明顯標(biāo)志。因此鋅離子和阿爾茲海默癥有密切的關(guān)系。然而，目前腦中鋅離子行為的研究還有很多挑戰(zhàn)，因此尋找一種有效的檢測(cè)阿爾茲海默癥中鋅離子行為的方法，具有重要的意義。

分子熒光探針以其特有的高選擇性以及高靈敏度，為生物體中的活性氧、ph、金屬離子和其他的氧化應(yīng)激小分子的檢測(cè)提供了一種有效的方法。然而目前已有的檢測(cè)探針大部分是單光子，它的激發(fā)往往需要更大的能量。雙光子熒光探針近些年來(lái)逐漸變成了熱點(diǎn)，因其原理是通過(guò)兩個(gè)或兩個(gè)以上的光子同時(shí)到達(dá)熒光團(tuán)，且只發(fā)生在焦平面上，與共焦顯微鏡相比，雙光子熒光探針檢測(cè)方法減少了焦外激發(fā)和光損傷，增加了細(xì)胞活力，同時(shí)長(zhǎng)波長(zhǎng)可以保證最低限度的散射和更深的滲透性。對(duì)于較厚的樣品，比如斑馬魚(yú)和鼠腦切片的成像，雙光子熒光探針檢測(cè)方法具有很大的優(yōu)勢(shì)。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，雙光子熒光探針檢測(cè)方法仍然存在雙光子吸收截面小、熒光量子產(chǎn)率低和選擇性差等的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種熒光探針p-zn，其具有高選擇性、高熒光量子產(chǎn)率及高雙光子吸收截面，通過(guò)結(jié)合特異性響應(yīng)分子對(duì)鋅離子(zn²⁺)進(jìn)行成像能實(shí)現(xiàn)對(duì)zn²⁺的檢測(cè)，具有高時(shí)空分辨率、高穩(wěn)定性和高靈敏度以及低毒性的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供了p-zn熒光探針，其結(jié)構(gòu)如式(a)所示：

本發(fā)明還提供了一種p-zn熒光探針的合成方法，所述方法包括以下步驟：

在有機(jī)溶劑中，氫化鈉、四乙基2,2'–聯(lián)吡啶-5,5'-亞甲基二磷酸鹽、4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛，進(jìn)行反應(yīng)，得到式(a)所示p-zn熒光探針，反應(yīng)過(guò)程如反應(yīng)式(i)所示。

其中，所述氫化鈉、四乙基2,2'–聯(lián)吡啶-5,5'-亞甲基二磷酸鹽、4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛的摩爾濃度比為5-8：1-1.2：1-3；優(yōu)選地，為6：1：2。

其中，所述反應(yīng)的溫度為30℃-50℃；優(yōu)選地，為32℃。

其中，所述反應(yīng)的時(shí)間為10h-15h；優(yōu)選地，為12h。

其中，所述有機(jī)溶劑選自thf、ch2cl2、ch3oh；優(yōu)選地，為thf。

其中，所述p-zn熒光探針為d-π-a-π-d構(gòu)型(d表示電子給體，a表示電子受體)，為高雙光子吸收截面的比率型熒光探針。

其中，在反應(yīng)結(jié)束后，還可以包括以下步驟，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化：將裝置冷卻到室溫，旋蒸除去thf，將旋蒸得到的產(chǎn)物加入水中，然后再用二氯甲烷萃取，再向萃取得到的有機(jī)相加入na2so4，旋蒸得到粗產(chǎn)物，過(guò)柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:20)即可得到純物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述p-zn熒光探針的合成方法包括以下步驟：將12mmol的氫化鈉加入到50ml無(wú)水的thf中，然后再向上述溶液中緩慢加入2mmol四乙基2,2'–聯(lián)吡啶-5,5'-亞甲基二磷酸鹽，及4mmol4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛。將反應(yīng)攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束后將裝置冷卻到室溫，旋蒸除去thf，將旋蒸得到的產(chǎn)物加入水中，然后再用二氯甲烷萃取，再向萃取得到的有機(jī)相加入na2so4，旋蒸得到粗產(chǎn)物，過(guò)柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:20)即可得到純物質(zhì)。

本發(fā)明還提供了一種如上所述方法制備得到的p-zn熒光探針，所述p-zn熒光探針為d-π-a-π-d構(gòu)型(d表示電子給體，a表示電子受體)，為高雙光子吸收截面的比率型熒光探針。

本發(fā)明還提供了如上所述p-zn熒光探針在體外通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)zn²⁺中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了如上所述p-zn熒光探針在體外通過(guò)熒光壽命成像檢測(cè)zn²⁺中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了如上所述p-zn熒光探針在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)zn²⁺中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了如上所述p-zn熒光探針在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)熒光壽命成像檢測(cè)zn²⁺中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種如上所述p-zn熒光探針在通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)鼠腦切片zn²⁺中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種如上所述p-zn熒光探針在通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)斑馬魚(yú)zn²⁺中的應(yīng)用。

利用zn²⁺可以特異性和p-zn中的聯(lián)吡啶絡(luò)合的特點(diǎn)，將p-zn與不同濃度的zn²⁺反應(yīng)，從而得到雙光子熒光光譜及其線性范圍，熒光壽命衰減曲線及其線性范圍，進(jìn)而可以根據(jù)這兩個(gè)方面來(lái)檢測(cè)zn²⁺濃度的變化，其中，所述熒光壽命衰減曲線是根據(jù)熒光成像的平均壽命的衰減所作的曲線。

本發(fā)明還提供了一種通過(guò)雙光子熒光成像在體外檢測(cè)zn²⁺的方法，所述方法包括：

(1)將式(a)p-zn熒光探針與zn²⁺發(fā)生反應(yīng)；

(2)雙光子作為激發(fā)光進(jìn)行雙光子熒光成像檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，來(lái)測(cè)定zn²⁺含量。

其中，所述反應(yīng)的溫度為室溫25℃。

其中，所述反應(yīng)的時(shí)間為4-20s；優(yōu)選地，為5s。

其中，優(yōu)選地，所述反應(yīng)在常壓下進(jìn)行。

其中，所述方法適用的p-zn熒光探針濃度為1-10μm；優(yōu)選地，為5μm(整個(gè)反應(yīng)體系中的探針濃度)。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的線性范圍為0.1μm-6μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的最低檢測(cè)限為15nm。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述通過(guò)雙光子熒光成像在體外檢測(cè)zn²⁺的方法，包括：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與不同濃度的zn²⁺(0.1μm-80μm)常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，記錄不同濃度zn²⁺的雙光子發(fā)射曲線，然后做出fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為0.1μm-6μm；

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與樣品中zn²⁺在常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明還提供了一種通過(guò)熒光壽命成像在體外檢測(cè)zn²⁺的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將式(a)p-zn熒光探針與zn²⁺發(fā)生反應(yīng)；

(2)測(cè)定熒光壽命，通過(guò)測(cè)定所得的熒光壽命和zn²⁺的關(guān)系，來(lái)測(cè)定zn²⁺含量。

其中，步驟(1)中，所述反應(yīng)的溫度為室溫25℃。

其中，步驟(1)中，所述反應(yīng)的時(shí)間為4-20s；優(yōu)選地，為5s。

其中，步驟(1)中，優(yōu)選地，所述反應(yīng)在常壓下進(jìn)行。

其中，所述方法適用的p-zn熒光探針濃度為1-10μm；優(yōu)選地，為5μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的線性范圍為0-15μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的最低檢測(cè)限為15nm。

其中，所述zn²⁺來(lái)自細(xì)胞裂解液；所述細(xì)胞包括：shsy-5y細(xì)胞、hela細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述熒光壽命成像在體外檢測(cè)zn²⁺的方法，包括：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與含有不同濃度的zn²⁺(5,10,15,20,25μm)的細(xì)胞裂解液在常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，記錄不同濃度下的熒光壽命衰減曲線，然后做出各組熒光壽命和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為0-15μm。

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與樣品中zn²⁺在常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定熒光壽命，并根據(jù)zn²⁺濃度和熒光壽命的關(guān)系，計(jì)算樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明根據(jù)上述方法得到的雙光子熒光光譜及其線性范圍、熒光壽命衰減曲線及其線性范圍，可以用于體外檢測(cè)zn²⁺濃度的變化。

本發(fā)明還提供了一種在通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)zn²⁺的方法，具體步驟如下：

(1)將p-zn熒光探針和細(xì)胞共培養(yǎng)，使探針進(jìn)入細(xì)胞；

(2)雙光子作為激發(fā)光進(jìn)行雙光子熒光成像檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，來(lái)測(cè)定zn²⁺含量；通過(guò)雙光子熒光成像中各個(gè)通道中的顏色變化來(lái)判斷zn²⁺的變化。

其中，步驟(1)中，所述細(xì)胞可以是神經(jīng)瘤母細(xì)胞；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為培養(yǎng)24h的細(xì)胞。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的溫度為37℃。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為60min-120min；優(yōu)選地，為90min。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的條件為95％o2，5％co2。

其中，步驟(1)中，p-zn探針的濃度為5μm。

其中，步驟(2)中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的濃度為5～25μm。

其中，步驟(2)中，所述反應(yīng)的時(shí)間為20-50min；優(yōu)選地，為30min。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)zn²⁺的方法，包括：

①向已經(jīng)培養(yǎng)24h的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入5μm的p-zn探針，在培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)90min，控制培養(yǎng)條件為95％o2，5％co2，37℃；

②向步驟(1)中加入不同濃度的zn²⁺(5，10，15,25μm)，共培養(yǎng)30min；

③用pbs將上述樣品清洗3次，再向步驟(2)中加入0.5mlpbs溶液，并于leica共聚焦上成像(tcssp8)；

④向zn²⁺濃度為25μm的細(xì)胞樣品中加入25μmtpen，通過(guò)tpen和zn²⁺的絡(luò)和作用，減少樣品中的zn²⁺，反應(yīng)5min后于leica共聚焦上成像(tcssp8)；然后做出fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為記錄成像的深淺和zn²⁺濃度的相互關(guān)系，由結(jié)果可知，隨著zn²⁺濃度的減少或增加，樣品的熒光強(qiáng)度有很明顯的減弱或增強(qiáng)，以上結(jié)果說(shuō)明p-zn熒光探針可以很好的示蹤細(xì)胞中zn²⁺的變化。

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

操作方法同步驟(1)，加入樣品中的zn²⁺，并于leica共聚焦上成像(tcssp8)；并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或成像的深淺，得出樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明還提供了一種通過(guò)熒光壽命成像檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)zn²⁺的方法，具體步驟如下：

(1)將p-zn熒光探針和細(xì)胞共培養(yǎng)，使探針進(jìn)入細(xì)胞；

(2)測(cè)定熒光壽命，通過(guò)熒光壽命成像，根據(jù)單細(xì)胞中不同區(qū)域的壽命變化情況判斷zn²⁺的變化及分布情況，從而來(lái)測(cè)定zn²⁺含量。

其中，步驟(1)中，所述細(xì)胞可以是神經(jīng)瘤母細(xì)胞；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為培養(yǎng)24h的細(xì)胞。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的溫度為37℃。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為60min-120min；優(yōu)選地，為90min。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的條件為95％o2，5％co2。

其中，步驟(1)中，p-zn探針的濃度為5μm。

其中，步驟(2)中，所述zn²⁺的濃度為5～25μm。

其中，步驟(2)中，所述反應(yīng)的時(shí)間為30min。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)通過(guò)熒光壽命成像檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)zn²⁺的方法，包括：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

①向已經(jīng)培養(yǎng)24h的培養(yǎng)皿中加入5μm的p-zn探針，在培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)90min，控制培養(yǎng)條件為95％o2，5％co2，37℃；

②向樣品中加入不同濃度的zn²⁺(5，10，25μm)，共培養(yǎng)30min；

③用pbs將上述樣品清洗3次，再向樣品中加入0.5mlpbs溶液，并于leica共聚焦上進(jìn)行熒光成像(tcssp8)；

④根據(jù)各組成像用syphotime-64進(jìn)行壽命擬合；根據(jù)單細(xì)胞中不同區(qū)域的壽命變化情況判斷zn²⁺的變化及分布情況。

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

操作方法同步驟(1)，將樣品于leica共聚焦上成像(tcssp8)；并根據(jù)壽命擬合曲線或成像的深淺，得出樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明還提供了一種雙光子熒光成像檢測(cè)鼠腦切片zn²⁺的方法，具體步驟如下：

(1)將p-zn熒光探針與鼠腦切片共培養(yǎng)90min；

(2)雙光子作為激發(fā)光進(jìn)行雙光子熒光成像檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，來(lái)測(cè)定zn²⁺含量；或利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和切片顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷鼠腦中zn²⁺的含量。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的溫度為37℃。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為60min-120min；優(yōu)選地，為90min。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的環(huán)境為腦脊液；可選地，為人工腦脊液；所述人工腦脊液的組成為124mmnacl，3mmkcl,26mmnahco3，1.25mmnah2po4，10mmd-葡萄糖，2.4mmcacl2,和1.3mmmgso4的混合溶液。

其中，所述方法適用的p-zn熒光探針濃度為10-50μm；優(yōu)選地，為25μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的線性范圍為0.1-6μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的最低檢測(cè)限為15nm。

其中，步驟(2)中，所述雙光子作為激發(fā)光的波長(zhǎng)為690-900nm；優(yōu)選地，為800nm。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述雙光子熒光成像檢測(cè)鼠腦切片zn²⁺的方法，包括：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

向鼠腦切片中加入25μm的p-zn探針，于37℃下共孵育90min，控制培養(yǎng)條件為95％o2，5％co2；

將鼠腦切片用acsf分別清洗3次，并于leica共聚焦上進(jìn)行熒光成像(tcssp8)；用800nm的雙光子作為激發(fā)光，在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像檢測(cè)；

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

操作方法同步驟(1)，對(duì)鼠腦切片樣品中的zn²⁺進(jìn)行熒光成像(tcssp8)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或成像深淺，得出鼠腦切片樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明中，將p-zn熒光探針與正常鼠腦切片以及ad鼠腦切片在人工腦脊液中共培養(yǎng)90min，然后在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像研究。利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和切片顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷正常鼠腦和患有阿爾茲海默癥的老鼠鼠腦中zn²⁺含量的差異，進(jìn)而可以用于探究zn²⁺在腦中的行為和阿爾茲海默癥的關(guān)系。

本發(fā)明還提供了一種斑馬魚(yú)中通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)zn²⁺的方法，具體步驟如下：

(1)將p-zn熒光探針與三天大的斑馬魚(yú)共培養(yǎng)；

(2)在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像研究，通過(guò)測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，來(lái)測(cè)定zn²⁺含量；或利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和斑馬魚(yú)的疊加通道的顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷斑馬魚(yú)中zn²⁺含量的差異。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的溫度為28℃。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為60min-120min；優(yōu)選地，為90min。

其中，步驟(1)中，所述共培養(yǎng)的環(huán)境為水。

其中，所述方法適用的p-zn熒光探針濃度為10-50μm；優(yōu)選地，為25μm。

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的線性范圍為0.1-6μm

其中，所述方法適用檢測(cè)的zn²⁺的最低檢測(cè)限為15nm。

其中，步驟(2)中，所述雙光子作為激發(fā)光的波長(zhǎng)為690-900nm；優(yōu)選地，為800nm。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述斑馬魚(yú)中通過(guò)雙光子熒光成像檢測(cè)zn²⁺的方法，包括：

(1)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

將25μmp-zn熒光探針與三天大的斑馬魚(yú)共培養(yǎng)90min，并且控制溫度為28℃，然后向除對(duì)照組的其他組加入不同濃度的zn²⁺(5，10，25μm)。

將上述各組斑馬魚(yú)用pbs清洗三次，之后放入培養(yǎng)皿中，用800nm的雙光子激光作為激發(fā)光源，在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像研究，然后做出fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為0.1μm-6μm；或利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和斑馬魚(yú)的疊加通道的顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷斑馬魚(yú)中zn²⁺含量的差異。

(2)測(cè)定樣品中zn²⁺含量

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與樣品中zn²⁺在常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或成像的深淺，得出樣品中zn²⁺含量。

本發(fā)明的有益效果在于，通過(guò)利用四乙基2,2'–聯(lián)吡啶-5,5'-亞甲基二磷酸鹽中的聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了一種以d-π-a-π-d為構(gòu)型的雙光子熒光探針p-zn，本發(fā)明的雙光子熒光探針p-zn以分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移為機(jī)理，具有高選擇性、高熒光量子產(chǎn)率、高雙光子吸收截面和高時(shí)空分辨率，為高雙光子吸收截面的比率型熒光探針，最大雙光子吸收截面由500.85±75.13gm增加至950.43±42.56gm(圖1a)，其熒光量子產(chǎn)率由0.54增加至0.71(圖1b)，其雙光子線性范圍為0.1～6μm(圖1c)，最低檢測(cè)線為15nm(s/n＝3)，解離常數(shù)為2.58±0.33μm，熒光壽命變化范圍為2.68±0.084ns～3.55±0.077ns(圖1d)。通過(guò)結(jié)合特異性響應(yīng)分子對(duì)zn²⁺(zn²⁺)進(jìn)行成像能實(shí)現(xiàn)對(duì)zn²⁺的檢測(cè)，具有高時(shí)空分辨率、高穩(wěn)定性和高靈敏度以及低毒性的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的p-zn熒光探針具有良好的雙光子性能，能夠很好地滿足體外或體內(nèi)對(duì)zn²⁺的檢測(cè)，以及鼠腦切片以及斑馬魚(yú)的雙光子成像研究及對(duì)應(yīng)的zn²⁺在各個(gè)過(guò)程中的變化情況研究，對(duì)于探究zn²⁺在生物體內(nèi)的行為以及與疾病的關(guān)系具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1：(a)5μmp-zn熒光探針加zn²⁺前后的雙光子吸收截面；(b)5μmp-zn探針加zn²⁺前后及同濃度的n,n,n',n'-四(2-吡啶甲基)乙二胺(tpen)的紫外吸收和熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系；(c)5μmp-zn熒光探針在不同濃度zn²⁺(0-80μm)條件下的雙光子熒光曲線；(d)p-zn探針在不同濃度zn²⁺(0，5，10，15，20，25μm)條件下的熒光壽命曲線。

圖2：5μmp-zn探針培養(yǎng)的神經(jīng)瘤母細(xì)胞在加入不同濃度zn²⁺及n,n,n',n'-四(2-吡啶甲基)乙二胺后的雙光子熒光成像圖。

圖3：5μmp-zn探針培養(yǎng)的神經(jīng)瘤母細(xì)胞在加入不同濃度的zn²⁺的熒光壽命成像圖(a～d)和熒光壽命成像相應(yīng)的柱形圖(g)。

圖4：(a-g)25μmp-zn探針培養(yǎng)的正常鼠腦切片和患有阿爾茲海默癥的鼠腦切片在不同放大倍數(shù)下(10×，63×，100×)的雙光子熒光成像圖；(h)正常鼠腦切片和ad鼠腦切片的fred/fgreen相對(duì)含量關(guān)系圖。

圖5：25μmp-zn探針培養(yǎng)的斑馬魚(yú)在不同濃度的zn²⁺(a-d)及加入25μmtpen的雙光子熒光成像(e)及fred/fgreen相對(duì)含量關(guān)系圖(f)。

圖6：5μmp-zn熒光探針對(duì)生物體內(nèi)含有的常見(jiàn)金屬離子、氨基酸、活性氧及活性氮的選擇性實(shí)驗(yàn)圖(a～c)；其中，a為金屬離子，b為氨基酸，c為活性氮和活性氮。d為不同ph條件中，p-zn熒光探針測(cè)定的fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)和ph的相互關(guān)系圖。a,b,c圖中白色柱表示金屬離子、氨基酸、活性氧及活性氮加入后探針的熒光強(qiáng)度，黑色柱表示再向各個(gè)白色柱所對(duì)應(yīng)的組中加入等量的zn²⁺后的熒光強(qiáng)度。d圖中，a表示p-zn熒光探針的熒光強(qiáng)度和ph的關(guān)系，b表示加入zn²⁺后p-zn熒光探針的熒光強(qiáng)度和ph的關(guān)系。

圖7：shsy-5y細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a為24h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，b為48h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門(mén)提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1：p-zn熒光探針的合成

將12mmol的氫化鈉加入到50ml無(wú)水的thf中，然后再向上述溶液中緩慢加入2mmol四乙基2,2'–聯(lián)吡啶-5,5'-亞甲基二磷酸鹽，及4mmol4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3,5-二甲基苯甲醛。將反應(yīng)攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束后將裝置冷卻到室溫，旋蒸除去thf，將旋蒸得到的產(chǎn)物加入水中，然后再用二氯甲烷萃取，再向萃取得到的有機(jī)相加入na2so4，旋蒸得到粗產(chǎn)物，過(guò)柱(乙酸乙酯：石油醚＝1:20)即可得到純物質(zhì)。

實(shí)施例2：p-zn熒光探針體外檢測(cè)zn²⁺

將5μm實(shí)施例1制備的p-zn熒光探針與不同濃度的zn²⁺常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，記錄不同濃度下的雙光子發(fā)射曲線，然后做出fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm，fred＝f495-585nm)和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為0.1μm-6μm。

將式(a)5μm的p-zn熒光探針與含有不同濃度的zn²⁺(5,10,15,20,25μm)的細(xì)胞裂解液常溫常壓下發(fā)生反應(yīng)，記錄不同濃度下的熒光壽命衰減曲線，然后做出各組熒光壽命和zn²⁺濃度的關(guān)系曲線，得出線性范圍為0-15μm。得到雙光子變化以及相關(guān)線性以及熒光壽命衰減曲線和其線性關(guān)系(圖1)。其中，圖1a為5μmp-zn探針加zn²⁺前后的雙光子吸收截面，由圖可知，最大雙光子吸收截面由500.85±75.13gm增加至950.43±42.56gm，說(shuō)明本發(fā)明制備的p-zn探針具有很大的雙光子吸收截面；圖1b為5μmp-zn探針加zn²⁺前后、同濃度的n,n,n',n'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的紫外吸收和熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，根據(jù)斜率計(jì)算可得，本發(fā)明制備的p-zn探針其熒光量子產(chǎn)率由0.54增加至0.71，表明該p-zn探針具有很大的熒光量子產(chǎn)率；圖1c為5μmp-zn熒光探針在不同濃度zn²⁺(0-80μm)條件下的雙光子熒光曲線，由圖1c可知，雙光子線性范圍為0.1～6μm，與未加zn²⁺的探針的熒光強(qiáng)度相比有高達(dá)6倍的增長(zhǎng)；圖1d為p-zn探針在不同濃度zn²⁺(0，5，10，15，20，25μm)條件下的熒光壽命曲線，由圖1d可知，熒光壽命變化范圍為2.68±0.084ns～3.55±0.077ns，表明該探針可很好的用于熒光壽命成像分析。

實(shí)施例3：p-zn熒光探針用于神經(jīng)瘤母細(xì)胞(shsy-5y)的雙光子成像及熒光壽命成像

在3.5cm四格共聚焦玻底培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)處于增殖期的神經(jīng)瘤母細(xì)胞24小時(shí)后，向其中加入5μm實(shí)施例1制備的p-zn熒光探針共培養(yǎng)90min，使探針進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組b～f共六組，對(duì)照組不加zn²⁺，向?qū)嶒?yàn)組b～f中加入不同濃度的zn²⁺(5，10，15，25μm，25μm)，然后向?qū)嶒?yàn)組f中加入25μmn,n,n',n'-四(2-吡啶甲基)乙二胺(tpen)，800nm的雙光子作為激發(fā)光，在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像檢測(cè)，如圖2所示，通過(guò)雙光子熒光成像中各個(gè)通道中的顏色變化來(lái)判斷zn²⁺的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著很明顯的顏色變化，隨著zn²⁺濃度的增加，細(xì)胞成像的顏色由最初的綠色(a)變成黃綠(b)，橙色(c,d)最后變成了紅色(e)，與實(shí)驗(yàn)組e相比，加入25μmtpen的實(shí)驗(yàn)組f的雙光子熒光強(qiáng)度因?yàn)槠渲械膠n²⁺濃度的減少，其熒光強(qiáng)度有著明顯降低，顏色也變成了綠色(圖2)。結(jié)果表明本發(fā)明的p-zn熒光探針可以很好的應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的zn²⁺的檢測(cè)。

將上述含有不同濃度zn²⁺的神經(jīng)瘤母細(xì)胞進(jìn)行熒光壽命成像實(shí)驗(yàn)，向已經(jīng)培養(yǎng)24h的培養(yǎng)皿中加入5μm的p-zn探針，在培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)90min，控制培養(yǎng)條件為95％o2，5％co2，37℃，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組b～d共四組，對(duì)照組不加zn²⁺，向?qū)嶒?yàn)組b～d中分別加入不同濃度的zn²⁺(5，10，25μm)，共培養(yǎng)30min。用pbs將上述樣品清洗3次，并于leica共聚焦上進(jìn)行熒光壽命成像(tcssp8)，最后根據(jù)各組成像用syphotime-64進(jìn)行壽命擬合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖可知，p-zn熒光探針可很好的用于細(xì)胞的熒光壽命成像。

通過(guò)測(cè)定熒光壽命成像，通過(guò)單細(xì)胞中不同區(qū)域的熒光壽命變化情況，可以用于單細(xì)胞中不同區(qū)域zn²⁺變化的研究。

實(shí)施例4p-zn熒光探針用于正常鼠腦切片和ad鼠腦切片的雙光子熒光成像

利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和切片顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷正常鼠腦和患有阿爾茲海默癥的鼠腦中zn²⁺含量的差異，進(jìn)而探究zn²⁺在腦中的行為和阿爾茲海默癥的關(guān)系。

將25μm實(shí)施例1制備的p-zn熒光探針與正常鼠腦切片以及阿爾茲海默癥的鼠腦切片，在人工腦脊液中(95％o2，5％co2)共培養(yǎng)90min，控制溫度為37℃。然后將切片用人工腦脊液清洗三次，之后放入培養(yǎng)皿中，用800nm的雙光子作為激發(fā)光，在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像檢測(cè)，通過(guò)雙光子熒光成像中各個(gè)通道中的顏色變化來(lái)判斷zn²⁺的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，由圖可知，正常鼠腦切片的成像結(jié)果為綠色(a,b,c)，而ad鼠腦切片成像結(jié)果為橙色(d,e,f,g)，這表明ad鼠腦中的zn²⁺含量明顯高于普通的鼠腦切片，表明p-zn探針可用于區(qū)分ad鼠腦和正常鼠腦。利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和切片顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷正常鼠腦和患有阿爾茲海默癥的鼠鼠腦中zn²⁺含量的差異，進(jìn)而可以用于探究zn²⁺在腦中的行為和阿爾茲海默癥的關(guān)系。

實(shí)施例5：p-zn熒光探針用于斑馬魚(yú)雙光子熒光成像

將25μm實(shí)施例1制備的p-zn熒光探針與三天大的斑馬魚(yú)共培養(yǎng)90min，控制溫度為28℃，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組b～e共五組，對(duì)照組不加zn²⁺，向?qū)嶒?yàn)組b～e中分別加入不同濃度的zn²⁺(5，10，25μm，25μm)，然后向?qū)嶒?yàn)組e中加入25μmtpen。將上述各組斑馬魚(yú)用pbs清洗三次，之后放入培養(yǎng)皿中，用800nm的雙光子激光作為激發(fā)光源，在leicatcssp8上進(jìn)行雙光子成像研究，通過(guò)雙光子熒光成像中各個(gè)通道中的顏色變化來(lái)判斷zn²⁺的變化。如圖5所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著很明顯的顏色變化，隨著zn²⁺濃度的增加，斑馬魚(yú)成像的顏色由最初的綠色(a)變成黃色(b)，橙色(c)最后變成了紅色(d)，與實(shí)驗(yàn)組d相比，加入25μmtpen的實(shí)驗(yàn)組e的雙光子熒光強(qiáng)度因?yàn)槠渲械膠n²⁺濃度的減少，其熒光強(qiáng)度有著明顯降低，顏色也變成了綠色。結(jié)果表明，本發(fā)明p-zn熒光探針可很好的用于斑馬魚(yú)成像，可用于簡(jiǎn)單脊椎動(dòng)物成像分析。利用雙光子光譜對(duì)應(yīng)的顏色和斑馬魚(yú)的疊加通道的顏色進(jìn)行對(duì)照，判斷斑馬魚(yú)中zn²⁺含量的差異。

實(shí)施例6：選擇性試驗(yàn)

將實(shí)施例1制備的p-zn熒光探針與生物體內(nèi)含有的常見(jiàn)金屬離子、氨基酸、活性氧及活性氮等進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行選擇性實(shí)驗(yàn)。

將5μm的p-zn探針與金屬離子(1.0mm的k⁺，na⁺，ca²⁺，mg²⁺；25μm的ba²⁺，co²⁺，fe³⁺，mn²⁺，ni²⁺，pb²⁺，al³⁺，fe²⁺，cu⁺；及5μm的cd²⁺，cu²⁺)(圖6a)，氨基酸(25μm的arg，d-try，cys，his，leu，lys，glu，phe，ser，gly，met及val)(圖6b)以及活性氧和活性氮(25μm的·oh，¹o2，clo^-，h2o2，o2·^-，onoo^-及no)(圖6c)反應(yīng)后，得到對(duì)應(yīng)的熒光值，再向每組溶液中加入25μm的zn²⁺，再得到對(duì)應(yīng)的熒光值，根據(jù)各組曲線繪制fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)圖。

5μm的p-zn探針在ph為5.0-8.0的范圍內(nèi)，測(cè)得加入zn²⁺前后的熒光值，繪制不同ph和fred/fgreen(fgreen＝f460-495nm,fred＝f495-585nm)關(guān)系圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：p-zn熒光探針具有很好的選擇性和ph穩(wěn)定性，可以很好的用于活體成像實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例7：細(xì)胞毒性試驗(yàn)

利用mtt實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行p-zn的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。將96孔板中的shsy-5y細(xì)胞分為8組，分別為陰性組、陽(yáng)性組、空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組(共8組)，其中，實(shí)驗(yàn)組p-zn探針濃度分別為5，10，15，20，25μm。8組分別共培養(yǎng)24h和48h后，加入20μlmtt試劑，反應(yīng)4h后，去除96孔中的上清液，加入80μl的dmso進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后進(jìn)行紫外測(cè)定。

其中，所述陰性對(duì)照組加入了曲拉通，細(xì)胞全致死組。

其中，所述陽(yáng)性對(duì)照組未加p-zn探針。

其中，所述空白對(duì)照為未加細(xì)胞及探針。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，由圖可知，細(xì)胞活性在p-zn探針濃度分別為5，10，15，20，25μm的條件下都大于90％，表明p-zn熒光探針具有很低的細(xì)胞毒性，可以很好的用于活體成像實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。