本發(fā)明涉及一種利用軍團(tuán)菌菌體及其代謝產(chǎn)物將D-L型氨基酸轉(zhuǎn)換成L-型氨基酸的方法。

背景技術(shù)：

自然界中，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸通常為L構(gòu)型。氨基酸合成的方法通常包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶法?；瘜W(xué)合成法可獲得的氨基酸種類多，但是合成的外消旋體（D-L氨基酸）需要經(jīng)過對映體拆分才能獲得單一構(gòu)型的氨基酸，而這一過程成本十分昂貴。發(fā)酵法是一種利用微生物具有合成自身所需各種氨基酸的能力，通過發(fā)酵工藝制備氨基酸的一種常用方法。該法盡管原料廉價(jià)，但制備的氨基酸產(chǎn)品單一，純度不高，有伴生氨基酸產(chǎn)生，并且發(fā)酵菌種的選育較為麻煩也不易控制。酶法是借助多種活性酶將有機(jī)物轉(zhuǎn)變成所需的氨基酸的一種方法。此法盡管可獲得100 %純度的L型氨基酸，但過程中必然會導(dǎo)致酶的失活，而酶再生成本依然昂貴。本發(fā)明直接利用經(jīng)過營養(yǎng)篩選的軍團(tuán)菌菌體濕品，無需精細(xì)的分離純化，即可高效實(shí)現(xiàn)氨基酸外消旋體選擇性構(gòu)型拆分，用生物的方法解決了化學(xué)合成法后期對映體拆分難、成本高的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：

為彌補(bǔ)現(xiàn)有氨基酸合成技術(shù)成本昂貴，工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值低的不足，本發(fā)明提供了一種利用軍團(tuán)菌菌體濕品作為氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換試劑，直接對化學(xué)合成得到的D-L型氨基酸進(jìn)行構(gòu)型轉(zhuǎn)換，制備高純度的L-氨基酸。該法工藝簡單、成本較低、獲得的產(chǎn)品純度高，具備廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)方案：

本發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)代生物學(xué)理論，運(yùn)用工業(yè)微生物關(guān)鍵技術(shù)及現(xiàn)代分析檢測技術(shù)，從而完成本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是提供一種能將D-L型氨基酸轉(zhuǎn)化為L型氨基酸的一種生物方法。具體工藝過程如下：

1.細(xì)菌的培養(yǎng)條件

按照以下方法制備適合軍團(tuán)菌快速生長的液體培養(yǎng)基。稱取10g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid; ACES buffer)；10g 酵母抽提物 (Yeast extract) 溶解至800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至6.9-7.0后，高壓蒸汽滅菌，冷卻備用。另外分別稱取5g 小牛血清蛋白 (Bovin serum albumin), 0.4g L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-cysteine hydrochloride), 0.25g 焦磷酸亞鐵 (Ferrous pyrophosphate), 充分溶解于200 mL雙蒸水中，通過0.22μm孔徑的微孔濾膜抽濾除菌后，加入到上述已滅菌備用的溶液中，混合即得。該菌在固體瓊脂中的生長所用的平板采用BCYE瓊脂平板（已有商品）。

2.菌種的營養(yǎng)適應(yīng)性篩選

將嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC33152（購自美國菌種保藏中心）接種于另外添加有10 % D-L型半胱氨酸的上述液體培養(yǎng)中，于37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔7日，吸取1mL傳代至新鮮的上述培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述操作10次以上，即可獲得具有較高氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換效率的菌種。將該突變菌株妥善保藏于-70 ℃ 冰箱備用。

3.細(xì)菌的傳代與增殖

將上述經(jīng)營養(yǎng)適應(yīng)性篩選的菌種活化后，接種于新鮮的不含D-L型半胱氨酸的液體培養(yǎng)基 (工藝1中所述) 中，置于37 ℃恒溫軌道培養(yǎng)箱中，200rmp震蕩培養(yǎng)48 h, 向培養(yǎng)液中加入等體積的3mol/L的硫酸銨，使其中的蛋白或酶沉淀到底部，再將其于10000 rmp離心 30 min，菌體及其中的蛋白或酶均沉淀于管底，將沉淀濕體收集起來，保藏于-70 ℃ 冰箱備用。

4.氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換與產(chǎn)品回收

向化學(xué)合成得到的外消旋體D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中加入上述濕體沉淀物（包含菌體及代謝產(chǎn)物中的蛋白成分或其它成分），加入量為100 mg/mL, 將溶液置于37 ℃，200 rmp的搖床中震蕩培養(yǎng)24 h。再向溶液中加入等體積的3 mol/L硫酸銨，10000 rmp離心 30 min后，棄去沉淀，將上清液通過離子交換法進(jìn)行處理，可收獲純度達(dá)97%以上的L型半胱氨酸。

有益效果：

本發(fā)明所涉及的外消旋體拆分方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：

1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)過嗜肺軍團(tuán)菌ATCC33152具有D-L型氨基酸進(jìn)行構(gòu)型轉(zhuǎn)換，可以制備高純度的L-氨基酸。

2、本發(fā)明涉及的方法屬于生物方法，無需使用有毒化學(xué)品，對人體和環(huán)境幾乎無危害。

3、本發(fā)明涉及的方法工藝簡單，成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可解決氨基酸產(chǎn)品價(jià)格過于昂貴的問題。

以下通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明保護(hù)范圍不以實(shí)施例為限。本發(fā)明在本技術(shù)領(lǐng)域具有多種公知的替代或變形，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)意義的前提下，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

附圖說明：

圖1：經(jīng)營養(yǎng)適應(yīng)性篩選的嗜肺軍團(tuán)菌的菌落形態(tài)。

圖2：L型半胱氨酸電化學(xué)差分脈沖伏安（DPV）曲線。曲線1：0.125mg/ml濃度的L型半胱氨酸溶液；曲線2：同法配制的不含L型半胱氨酸的陰性對照溶液。

圖3：L型半胱氨酸電化學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線（Ipmax vs Cmg/ml）。

圖4：電化學(xué)方法監(jiān)測L型半胱氨酸的含量。

圖5：營養(yǎng)適應(yīng)性篩選頻次對L-半胱氨酸轉(zhuǎn)換收率的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本發(fā)明涉及的氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換方法如下：

1. 細(xì)菌的培養(yǎng)條件

按照以下方法制備適合軍團(tuán)菌快速生長的液體培養(yǎng)基。稱取10g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid; ACES buffer)；10g 酵母抽提物 (Yeast extract) 溶解至800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至6.9-7.0后，高壓蒸汽滅菌，冷卻備用。另外分別稱取5g 小牛血清蛋白 (Bovin serum albumin), 0.4g L-半胱氨酸(L-cysteine hydrochloride), 0.25g 焦磷酸亞鐵 (Ferrous pyrophosphate), 充分溶解于200 mL雙蒸水中，通過0.22μm孔徑的微孔濾膜抽濾除菌后，加入到上述已滅菌備用的溶液中，混合即得。

2. 菌種的營養(yǎng)適應(yīng)性篩選

將嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC33152（購自美國菌種保藏中心）接種于另外添加有10 % D-L型半胱氨酸的上述液體培養(yǎng)中，于37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔7日，吸取1mL傳代至新鮮的上述培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述操作10次以上，即可獲得具有較高氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換效率的菌種。將該突變菌株妥善保藏于-70 ℃ 冰箱備用。

3. 細(xì)菌的傳代與增殖

將上述經(jīng)營養(yǎng)適應(yīng)性篩選的菌種活化后，接種于新鮮的不含D-L型半胱氨酸的液體培養(yǎng)基 (工藝1中所述) 中，置于37 ℃恒溫軌道培養(yǎng)箱中，200rmp震蕩培養(yǎng)48 h, 向培養(yǎng)液中加入等體積的3mol/L的硫酸銨，使其中的蛋白或酶沉淀到底部，再將其于10000 rmp離心 30 min，菌體及其中的蛋白或酶均沉淀于管底，將沉淀濕體收集起來，保藏于-70 ℃ 冰箱備用。

4. 氨基酸構(gòu)型轉(zhuǎn)換與產(chǎn)品回收

向化學(xué)合成得到的外消旋體D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中加入上述濕體沉淀物（包含菌體及代謝產(chǎn)物中的蛋白成分或其它成分），加入量為100 mg/mL, 將溶液置于37 ℃，200 rmp的搖床中震蕩培養(yǎng)24 h。再向溶液中加入等體積的3 mol/L硫酸銨，10000 rmp離心 30 min后，棄去沉淀，將上清液通過離子交換法進(jìn)行處理，可收獲純度達(dá)97%以上的L型半胱氨酸。

實(shí)施例2

按照上述工藝（工藝2所述）進(jìn)行菌種的營養(yǎng)適應(yīng)性篩選，所獲得的嗜肺軍團(tuán)菌菌株在BCYE瓊脂平板上的菌落生長形態(tài)，見圖1。

實(shí)施例3

電化學(xué)分析法監(jiān)測轉(zhuǎn)換過程中L-半胱氨酸的含量

1. L型半胱氨酸在金盤電極上的電化學(xué)行為

1.1. 實(shí)驗(yàn)方法：配制一定濃度的L型半胱氨酸，定性檢測其在三電極體系（工作電極：金盤電極φ=5mm；參比電極：飽和甘汞電極；對電極：鉑絲）中的電化學(xué)行為。

1.2. 結(jié)果與結(jié)論：見圖2，DPV結(jié)果表明L-半胱氨酸在金盤電極表面有電化學(xué)信號響應(yīng)，故有望構(gòu)建該物質(zhì)的含量定量分析方法。

型半胱氨酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1. 實(shí)驗(yàn)方法：分別配制0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0313，.......等2倍稀釋的L型半胱氨酸水溶液，按照上述方法進(jìn)行電化學(xué)測定，并記錄最大峰電流（Ip_max）值。以物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，Ip _max 為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2. 結(jié)果與結(jié)論：見圖3，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出Ip _max 與L型半胱氨酸的濃度呈線性關(guān)系。此法可用以檢測樣品中L型半胱氨酸物質(zhì)的含量變化。

根據(jù)電化學(xué)DPV Ip_max值檢測工藝中L型半胱氨酸的含量變化

3.1. 實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)工藝，將化學(xué)合成獲得的外消旋體D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中工藝所述的濕體100 mg/mL, 置于37 ℃，200 rmp的搖床中震蕩培養(yǎng)24 h。不同時(shí)間段分別取樣進(jìn)行電化學(xué)DPV檢測, 將檢測得到的Ip_max 值

代入線性方程：Ip _max=32.468C+0.37642; 計(jì)算出溶液中不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的L型半胱氨酸的含量。

3.2. 結(jié)果與結(jié)論：見圖4，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中，L型半胱氨酸物質(zhì)的含量在不斷增加，表明了DL型半胱氨酸正逐漸轉(zhuǎn)換成單一L型構(gòu)象，當(dāng)達(dá)到18小時(shí)后，基本無增加，表明轉(zhuǎn)換反應(yīng)基本完成。

實(shí)施例4

菌種的營養(yǎng)適應(yīng)性篩選實(shí)驗(yàn)對L-半胱氨酸轉(zhuǎn)換收率的影響

3.1. 實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)工藝2，將不同傳代篩選頻次( 0,1,2...10,11,12) 分別收獲菌種，然后按照工藝3和4進(jìn)行氨基酸轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)，再根據(jù)實(shí)例所需的方法計(jì)算L型半胱氨酸的含量，通過計(jì)算得到不同傳代頻次的13個(gè)批次（Batch）產(chǎn)品的收率（Yield）百分比。

3.2. 結(jié)果與結(jié)論：見圖5，由曲線可以看出，L型半胱氨酸的收率百分比隨著傳代頻次的增加而增長，達(dá)到10次傳代以后，收率百分比達(dá)到較高水平，隨后的增長幅度很低。因此，工藝選擇傳代至少10次。