背景技術(shù)：

齲病(Dental caries)是人類最常見的口腔疾病之一，與同心血管疾病、癌癥并稱為人類三大疾病，嚴(yán)重威脅著人們的口腔健康。目前在我國齲病發(fā)生率有上升趨勢(shì)，老年人群患齲率高達(dá)98.40％，齲均14.65顆。找到控制齲病的有效措施仍是當(dāng)前非常緊迫的任務(wù)。但齲病又是一種非致死性疾病，在尋找控制齲病的有效免疫措施時(shí)，必須充分考慮治療方案以及使用制劑的高效、安全、價(jià)廉物美，以及預(yù)防接種方法易于被人群接受。

變異鏈球菌(Streptococcus mutans)為革蘭氏染色陽性的球菌，能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，引起牙齒脫礦，最終導(dǎo)致齲病發(fā)生。變異鏈球菌是導(dǎo)致人類齲病的一類主要致病菌。變異鏈球菌壁相關(guān)蛋白A(wall-associated protein A gene,wapA)、葡聚糖結(jié)合蛋白(glucan-bind proteins,GBPs)、致齲毒力因子的表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltranferaes,GTFs)是變異鏈球菌的重要抗原物質(zhì)。這些抗原成分參與介導(dǎo)細(xì)菌的粘附，在免疫學(xué)方面有著極為重要的意義。其中，表面蛋白(PAc)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)是變異鏈球菌中最重要的致齲毒力因子。表面蛋白是變異鏈球菌的主要粘結(jié)素，介導(dǎo)牙面的非蔗糖依賴型粘附。研究認(rèn)為，表面蛋白(PAc)結(jié)構(gòu)中的A區(qū)是主要粘附功能區(qū)，可與糖蛋白結(jié)合，介導(dǎo)變異鏈球菌對(duì)牙面的初始附著。表面蛋白(PAc)結(jié)構(gòu)中的A區(qū)富集T、B細(xì)胞表位，是研制防齲疫苗的主要靶點(diǎn)抗原。研究表明，當(dāng)變異鏈球菌毒力因子PAc作為抗原免疫動(dòng)物后，機(jī)體的體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答被激發(fā)，產(chǎn)生特異性的抗體，初步證明利用PAc免疫動(dòng)物后，可有效抑制細(xì)菌在牙面的粘附，從而降低患齲率。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)作為另一種主要的致齲毒力因子，可通過蔗糖合成葡聚糖，介導(dǎo)細(xì)菌在牙面的蔗糖依賴型粘附。GTFs包含兩個(gè)免疫活性區(qū)，能使變異鏈球菌與牙面緊密結(jié)合，分別是葡聚糖結(jié)合區(qū)(glucan binding region,GLU)和催化功能區(qū)(catalytic region,CAT)。PAc和GTFs是變異鏈球菌致病的主要毒力因子，在其分子中存在著相應(yīng)的粘附功能區(qū)以及具有免疫原性的T、B細(xì)胞抗原決定簇，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性唾液sIgA抗體，sIgA抗體可以抑制這兩種毒力因子的功能，阻止變異鏈球菌在牙面附著，從而抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展。

IgG抗體也具有抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展的重要作用。

霍亂毒素B亞單位(CTB)是一種較理想的免疫佐劑，它能與抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)等有核細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體特異性結(jié)合，具有調(diào)節(jié)APC反應(yīng)、T細(xì)胞反應(yīng)和抗體產(chǎn)生的作用，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的系統(tǒng)和局部粘膜免疫應(yīng)答，在疫苗的研究中已被廣泛的使用。

免疫應(yīng)答反應(yīng)主要分為初次應(yīng)答和再次應(yīng)答。初次應(yīng)答時(shí)，機(jī)體僅產(chǎn)生少量抗體且抗體生成緩慢，而再次應(yīng)答時(shí)機(jī)體迅速發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的抗體。再次免疫應(yīng)答是由記憶性B細(xì)胞(memory B cell,Bm)誘導(dǎo)。Bm是初次免疫應(yīng)答后克隆消除保留下來的高親和力細(xì)胞，當(dāng)再次受同一抗原刺激，Bm快速分化成漿細(xì)胞，介導(dǎo)迅速的記憶性應(yīng)答，產(chǎn)生高滴度的抗體，同時(shí)維持Bm庫的更新。Bm在體液免疫中扮演十分重要的角色，對(duì)漿細(xì)胞的產(chǎn)生、抗體的生成、記憶持久的免疫保護(hù)起關(guān)鍵作用；預(yù)示誘導(dǎo)盡可能多的Bm形成是加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗黏膜免疫效果的有效策略。

無功能糖基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(DOCK8)是GTP-交換因子Rho-Rac家族成員之一，其核心功能區(qū)是DHR。在靜息B細(xì)胞遭遇抗原時(shí)，DOCK8促進(jìn)抗原信號(hào)存留，促使B細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)的生發(fā)中心，并分化為長效Bm，維持長效免疫。B細(xì)胞還通過自身表達(dá)的DOCK8分子招募胞內(nèi)的整合素ICAM-1向Th細(xì)胞和B細(xì)胞間的免疫突觸區(qū)域聚集，促進(jìn)Th細(xì)胞活化B細(xì)胞第二信號(hào)的傳導(dǎo)，發(fā)揮生物活性作用。預(yù)示DOCK8可能是Bm形成及其在體內(nèi)長期留存的關(guān)鍵。

近年來各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的創(chuàng)立和改進(jìn)，使基因的轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)基因植物的再生不再是轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗研究的限制因素；基因轉(zhuǎn)入宿主后的高效表達(dá)及其遺傳穩(wěn)定性、表達(dá)蛋白的抗原性和免疫反應(yīng)性、口服免疫機(jī)制、提高植物表達(dá)蛋白的利用率、利用安全篩選標(biāo)記或刪除選擇標(biāo)記的策略、培育安全的轉(zhuǎn)基因植物等問題，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗研究的關(guān)鍵。

轉(zhuǎn)基因植株中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)和維持穩(wěn)定遺傳主要與植物表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化方法、外植體以及外界環(huán)境因素有關(guān)。隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的深入研究發(fā)現(xiàn)，大量外源基因并沒有得到預(yù)期表達(dá)，不同轉(zhuǎn)基因個(gè)體中外源基因的表達(dá)也存在較大差異，這種基因表達(dá)差異不僅受到不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的調(diào)控，而且轉(zhuǎn)錄水平的抑制和轉(zhuǎn)錄后mRNA積累的抑制也會(huì)造成不同程度地基因沉默。

目前，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將致齲毒力因子的表面蛋白(PAc)粘附相關(guān)肽段和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)催化功能區(qū)基因，以及免疫佐劑CTB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)基因，番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子基因E8和雙元穿梭載體pCAMBIA2301質(zhì)粒用于制備重組質(zhì)粒，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化番茄，培育防齲轉(zhuǎn)基因番茄，用于齲病防治的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的防齲DNA序列；進(jìn)一步地，將該防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄，培育防齲轉(zhuǎn)基因番茄，以獲得防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗，用于齲病防治的研究。

一方面，本發(fā)明提供了一種新型防齲DNA序列，該DNA序列包括變異鏈球菌UA159的致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因，以及番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子基因E8。

本發(fā)明提供了上述防齲DNA序列的制備方法，包括以下步驟：1)、將上述E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段來構(gòu)建融合基因表達(dá)質(zhì)粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，2)、將該融合基因表達(dá)質(zhì)粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301雙元穿梭載體中，構(gòu)建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒，3)、將該pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109；獲得所述防齲DNA序列。

經(jīng)鑒定及測(cè)序，所述防齲DNA序列如SEQ ID No1所示。

單純的核苷酸序列進(jìn)入人體后容易被核酸酶降解，較難進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致DNA序列的防齲效果降低。

進(jìn)一步地，本發(fā)明將上述防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄，并培育獲得防齲轉(zhuǎn)基因番茄，利用植物系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，因此，可作為一種防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗。

再一方面，本發(fā)明提供了一種防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制備方法。

利用了上述防齲DNA序列中的番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8基因能夠啟動(dòng)融合蛋白的表達(dá)。在一種實(shí)施方案中，提供了將上述防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)化方法包括步驟：1)、將上述DNA序列經(jīng)添加植物信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列和柔性肽基因修飾后，插入攜帶番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中，構(gòu)建穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并轉(zhuǎn)化番茄，2)、將選擇性標(biāo)記基因Km和GUS去除，篩選出不帶標(biāo)記基因、遺傳穩(wěn)定、表達(dá)高效的轉(zhuǎn)基因番茄植株。

在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)化方法包括步驟：

1)、將所述包含上述防齲DNA序列的重組質(zhì)粒添加植物信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列和柔性肽基因進(jìn)行修飾；

2)、插入攜帶番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8的植物表達(dá)載體中，構(gòu)建穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR；

3)、去除步驟2)所獲得的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR中真核生物中的標(biāo)記抗性基因Km和GUS，保留原核生物中的Km基因作為篩選；

4)、將步驟3)得到的表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105菌株中；

5)、將步驟4)得到的成功轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌采用葉片注射法充分侵染番茄子葉細(xì)胞，將大量T-DNA轉(zhuǎn)入番茄子葉細(xì)胞內(nèi)，將農(nóng)桿菌侵染過的番茄子葉細(xì)胞接種到MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn)基因番茄植株；

6)、提取培養(yǎng)步驟5)得到的番茄子葉細(xì)胞的總RNA；

7)、將步驟6)得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

8)、將步驟7)得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)；

9)、將步驟6)得到的cDNA進(jìn)行GUS檢測(cè)，確認(rèn)防齲DNA序列的轉(zhuǎn)化情況良好。

檢測(cè)表明，上述防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄情況良好，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株中表達(dá)了大量具有防齲效果的植物蛋白，可用為一種可食用的口服的防齲轉(zhuǎn)基因疫苗。

在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制備方法，包括步驟：

(1)E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段的克隆

變異鏈球菌UA159基因組中富含T、B淋巴細(xì)胞表位的致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因，以及番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8的克隆；克隆所需的引物是根據(jù)GeneBank中報(bào)道的基因序列(GeneBank accession number M17361、AE014133、AB615200、NM001037793)設(shè)計(jì)并合成，如表1所示：

表1：cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHRAPB和E8基因的引物序列

加框?yàn)楸Ｗo(hù)性堿基，下劃線為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，加粗為柔性肽。

(2)pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

將步驟(1)中獲得的E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段來構(gòu)建融合基因表達(dá)質(zhì)粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301雙元穿梭載體中，構(gòu)建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后送測(cè)序，獲得防齲DNA序列如SEQ ID No1所示。

(3)將防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄制備防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗

將(2)獲得的DNA序列，利用番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8啟動(dòng)融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)添加植物信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列和柔性肽等基因修飾后，插入攜帶番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體中，構(gòu)建穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并轉(zhuǎn)化番茄，將選擇性標(biāo)記基因Km和GUS去除，篩選出不帶標(biāo)記基因、遺傳穩(wěn)定、表達(dá)高效的轉(zhuǎn)基因植株，從而獲得一種新型的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗。

所述的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制備方法具體如下：

①、去除所獲得的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR中真核生物中的標(biāo)記抗性基因Km和GUS，保留原核生物中的Km基因作為篩選；

②、將成功去除標(biāo)記基因Km和GUS的植物載體pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105菌株中；

③、運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片注射法，用注射器使成功轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌充分侵染番茄子葉細(xì)胞，將大量的T-DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)；

④、將農(nóng)桿菌侵染過的番茄子葉細(xì)胞接種到MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn)基因番茄植株。

經(jīng)GUS檢測(cè)，確認(rèn)防齲DNA序列在番茄中的轉(zhuǎn)化情況良好。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)該防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄后，培育得到的轉(zhuǎn)基因番茄植株，包括該轉(zhuǎn)化番茄植株的果實(shí)、莖、葉中，表達(dá)了大量的具有防齲效果的植物蛋白，可作為一種防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗；該防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗可刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體，尤其是能刺激大鼠產(chǎn)生特異性SIgA和IgG抗體，阻斷變異鏈球菌的粘附和菌斑的形成，能夠抑制大鼠齲齒的發(fā)生，從而預(yù)防齲病，尤其是非蔗糖依賴型齲病。

第三方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因番茄植株中表達(dá)了防齲植物蛋白，防齲植物蛋白作為一種可食用的口服防齲轉(zhuǎn)基因疫苗。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗的防齲食品以及包含本發(fā)明轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的防齲食品。

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于，首次構(gòu)建包括一種新型的DNA序列，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功將防齲DNA序列轉(zhuǎn)化番茄，獲得了穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株。實(shí)驗(yàn)證明該轉(zhuǎn)基因番茄植株表達(dá)的外源蛋白具有免疫原性；說明該轉(zhuǎn)基因番茄可有效的誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，能夠作為一種新型的可食用的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗。采用本發(fā)明的防齲DNA序列轉(zhuǎn)化得到的防齲轉(zhuǎn)基因番茄安全性高，對(duì)環(huán)境無明顯影響，能表達(dá)天然抗原，免疫應(yīng)答持久，能有效防齲。本發(fā)明方法簡單，生產(chǎn)成本低廉，易于推廣。

附圖說明

圖1是葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat電泳鑒定圖；其中，1為cat基因PCR產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖2是致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和佐劑CTB的編碼基因ctxB融合基因PacA-ctxB的電泳鑒定圖；其中，1為陰性對(duì)照；2為PacA-ctxB基因PCR產(chǎn)物；M為BM2000DNA Marker。

圖3是靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因DOCK8/DHR的電泳鑒定圖；其中：1為DOCK8/DHR基因PCR產(chǎn)物；M為BM2000DNA Marker。

圖4是pCAMBIA-cat酶切電泳鑒定圖；其中，1為T-cat單酶切產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖5是pCAMBIA-PacA-ctxB的酶切電泳鑒定圖；其中，1為T-PacA-ctxB雙酶切產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖6是pCAMBIA-DOCK8/DHR的酶切電泳鑒定圖；其中，1為T-DOCK8/DHR三酶切產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖7是重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB電泳鑒定圖；其中，1為pCAMBIA-cat-PacA-ctxB PCR產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖8是重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR電泳鑒定圖；其中，1為cat擴(kuò)增產(chǎn)物；2為DOCK8/DHR擴(kuò)增產(chǎn)物；3為PacA-ctxB擴(kuò)增產(chǎn)物；M為1kb Ladder DNA Marker。

圖9是重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切電泳鑒定圖；其中，1為pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR酶切產(chǎn)物；2為pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒；M為1kb Ladder DNA Marker。

圖10是番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8序列基因電泳鑒定圖；其中：1為E8PCR產(chǎn)物；M為BM5000DNA Marker。

圖11是重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR結(jié)構(gòu)示意圖。

圖12是再生番茄苗gus染色結(jié)果。

圖13顯示了SD大鼠采集血液的過程。

圖14顯示了SD大鼠采集唾液的過程。

圖15顯示了各組大鼠體重的變化。

圖16顯示了各組大鼠唾液中的lgA抗體水平OD₄₅₀值變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達(dá)載體的基本骨架為雙元穿梭載體pCAMBIA2301(購自上海邁其生物科技有限公司，序列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過程以及制備過程中，質(zhì)粒擴(kuò)增所用的宿主菌為E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(購自寶生物工程大連有限公司)；插入的外源基因?yàn)椋河勺儺愭溓蚓鶸A159基因組中提取富含T、B淋巴細(xì)胞表位的致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因構(gòu)建的融合基因表達(dá)質(zhì)粒cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，以及番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8序列。

縮寫

在本文的實(shí)施例中，以下的縮寫具有如下的含義：min代表分鐘、h代表小時(shí)、w代表星期(周)。

實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的構(gòu)建

步驟一、變異鏈球菌的培養(yǎng)

將凍存的變異鏈球菌UA159菌株(貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)劃線培養(yǎng)于BHI平板培養(yǎng)基(商品化平板培養(yǎng)基，購自北京索萊寶生物科技有限公司)上，培養(yǎng)條件為37℃厭氧箱(80％N₂，10％H₂，10％CO₂)，避光復(fù)蘇4-7天，觀察到黑色菌落生長至1mm左右。挑取平板上長出的單菌落接種至LB培養(yǎng)基(購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天，觀察到液體變渾濁，有少量菌體沉淀。收集富含變異鏈球菌UA159的菌液用于后續(xù)試驗(yàn)。

步驟二、變異鏈球菌UA159菌株基因組的獲得

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bacterial DNA Extraction Kit(Solution type)，Biotekecorporation)提取UA159基因組，步驟簡述如下：

1、取2ml上述步驟一收集的富含變異鏈球菌UA159的菌液，10000rpm，離心30s。棄上清，收集菌體，盡可能的吸凈上清；

2、加入200μl緩沖液RB重懸洗滌細(xì)胞，10000rpm，離心30s，棄上清后再次將菌體重懸于200μl緩沖液RB中；

3、加入50～100μl lysozyme(10mg/ml in 10mMTris-HCl，PH8.0)，顛倒混勻，37℃溫育30—60min。10000rpm離心2min，棄上清后將菌體再次重懸于200μl緩沖液RB中；

4、加入200μl結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒充分混勻，再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混勻，70℃放置10min。

5、冷卻后加入100μl異丙醇，劇烈顛倒充分混勻；

6、將上一步所得溶液及可能出現(xiàn)的絮狀沉淀物移至吸附柱AC中(吸附柱套入收集管中)，10000rpm離心30s，棄廢液；

7、加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm離心30min，棄廢液；

8、加入700μl漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄廢液；

9、加入500μl漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄廢液；

10、吸附柱AC放回收集管中，13000rpm離心2min；

11、取出吸附柱AC，放入干凈離心管中，在吸附膜中部加100μl洗脫緩沖液EB(洗脫液65-70℃預(yù)熱)，室溫放置3-5min，12000離心1min，獲得清液，得到變異鏈球菌UA159菌株基因組DNA樣品溶液。

步驟三、融合基因表達(dá)質(zhì)粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的構(gòu)建

致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因的克隆以及載體的構(gòu)建

1、以變異鏈球菌UA159為模板，以雙元穿梭載體pCAMBIA2301為骨架，體外擴(kuò)增目的基因cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR。根據(jù)致齲毒力因子的表面蛋白A區(qū)編碼基因PacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因序列設(shè)計(jì)并合成如表1所示的引物，并按下述PCR體系及擴(kuò)增條件克隆cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR基因。

PCR擴(kuò)增cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR的反應(yīng)體系如表2所示：

表2、cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR PCR反應(yīng)體系

cat PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：

PacA-ctxB PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：

DOCK8/DHR PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：

循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)電泳(如圖1-圖3所示)鑒定大小正確后于12℃保存，長期保存需移至-20℃或-80℃條件。

2、獲得的目的基因片段分別進(jìn)行凝膠電泳回收：cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因的PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證是否獲得預(yù)期大小的基因。

3、將瓊脂糖凝膠回收的試劑盒回收的cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因片段進(jìn)行XhoI和PmlI雙酶切，去除保護(hù)性堿基，酶切體系如表3所示，37℃水浴12-16h。

表3：XhoI和PmlI雙酶切體系

4、按照AxyPrepPCR純化試劑盒的說明方法回收純化產(chǎn)物，步驟如下：

a、加入PCR產(chǎn)物三倍體積Buffer PCR-A混勻，過柱，12000rpm，1min；

b、柱內(nèi)加入700μl Buffer W2 10000rpm，1min，重復(fù)1次；

c、空離1min，56℃烘箱靜置至乙醇揮發(fā)，加入ddH₂O(56℃預(yù)熱)，靜置5min，12000rpm，1min，得到cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟四、cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因與pCAMBIA載體連接

將步驟三純化得到的cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR目的基因連接至pCAMBIA載體上，其連接體系如表4所示：

表4：目的基因與載體連接體系

上述連接混合液室溫過夜連接，得到連接好的pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒。

步驟五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將步驟四連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌E.coli JM109細(xì)胞中，步驟如下：

1、取-80℃中取出感受態(tài)細(xì)胞2支，置于冰浴中；

2、向感受態(tài)細(xì)胞中各加入連接產(chǎn)物10μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物，冰浴中靜置30min；

3、將離心管置于42℃水浴90s，快速轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻2min，盡量靜置；

4、超凈臺(tái)內(nèi)向離心管中加入500μl無菌、不含抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻置于37℃恒溫?fù)u床45min，復(fù)蘇菌液；

5、菌液3000rpm，10min收集菌體，加入50μl重新混勻菌體；

6、超凈臺(tái)內(nèi)將菌液接種至含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板中，37℃培養(yǎng)過夜，得到pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒的感受態(tài)E.coli JM109細(xì)胞菌液。

7、挑選單菌落，置于加入500μl抗性液體培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，37℃恒溫?fù)u床4-6h，觀察長勢(shì)，挑出擴(kuò)增的菌體進(jìn)行菌液PCR。

步驟六、挑取單菌落，菌液PCR、酶切鑒定

挑選出步驟五擴(kuò)增的菌體進(jìn)行菌液PCR，篩選重組子，菌液PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)擴(kuò)增條件同步驟三。

篩選重組子pCAMBIA-cat質(zhì)粒的酶切體系如表5所示：

表5 pCAMBIA-cat質(zhì)粒的酶切體系

混勻后置于37℃酶切6h。

篩選重組子pCAMBIA-PacA-ctxB質(zhì)粒的酶切體系如表6所示：

表6 pCAMBIA-PacA-ctxB質(zhì)粒的酶切體系

混勻后置于37℃酶切6h。

篩選重組子pCAMBIA-DOCK8/DHR質(zhì)粒的酶切體系如表7所示：

表7 pCAMBIA-DOCK8/DHR質(zhì)粒的酶切體系

混勻后置于37℃酶切6h。

酶切產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖4-圖6所示)，以確定重組產(chǎn)物pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR是否正確，在全自動(dòng)凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果并保存圖像。

步驟七、重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR采用凝膠回收DNA

按照AxyPrepPCR純化試劑盒的說明方法回收純化產(chǎn)物，步驟如下：

a、加入PCR產(chǎn)物三倍體積Buffer PCR-A混勻，過柱，12000rpm，1min；

b、柱內(nèi)加入700μl Buffer W210000rpm，1min，重復(fù)1次；

c、空離1min，56℃烘箱靜置至乙醇揮發(fā)，加入ddH₂O(56℃預(yù)熱)，靜置5min，12000rpm，1min，得到pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR目的基因；

d、在紫外分光光度計(jì)分別測(cè)其在OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值及DNA濃度，-20℃保存。

步驟八、重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB的構(gòu)建和鑒定

1、利用DNA的黏性末端的特性，將pCAMBIA-cat和pCAMBIA-PacA-ctxB的凝膠回收DNA片段體外連接，其連接體系如表8所示：

表8 cat和PacA-ctxB的連接體系

上述連接混合液16℃過夜連接，得到連接好的cat-PacA-ctxB的重組質(zhì)粒。

2、對(duì)載體pCAMBIA進(jìn)行XhoI和EcoRI雙酶切，酶切體系如表9所示，37℃水浴6h，然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混勻后37℃，1h，75℃金屬浴10min以滅活去磷酸化酶。

表9：XhoI和EcoRI雙酶切體系

3、按照AxyPrepPCR純化試劑盒的說明方法回收純化產(chǎn)物，步驟如下：

a、加入PCR產(chǎn)物三倍體積Buffer PCR-A混勻，過柱，12000rpm，1min；

b、柱內(nèi)加入700μl Buffer W2 10000rpm，1min，重復(fù)1次；

c、空離1min，56℃烘箱靜置至乙醇揮發(fā)，加入ddH₂O(56℃預(yù)熱)，靜置5min，12000rpm，1min，得到pCAMBIA-cat和pCAMBIA-PacA-ctxB目的基因，-20℃保存。

4、重組質(zhì)粒cat-PacA-ctxB與載體pCAMBIA的連接反應(yīng)，其連接體系如表10所示：

表10 cat-PacA-ctxB和載體pCAMBIA的連接體系

上述連接混合液16℃過夜反應(yīng)12-16h，得到連接好的pCAMBIA-cat-PacA-ctxB的重組質(zhì)粒。

5、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化步驟同步驟五，得到pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重組質(zhì)粒的感受態(tài)JM109細(xì)胞菌液。

6、將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB進(jìn)行篩選、PCR擴(kuò)增與酶切鑒定。pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系同步驟三，PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：

循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)電泳(如圖7所示)鑒定大小正確后，所篩得陽性克隆于12℃保存，長期保存需移至-20℃或-80℃條件。pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重組質(zhì)粒酶切鑒定同步驟六所示。

步驟九、重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的構(gòu)建和鑒定

1、cat-PacA-ctxB目的基因片段的獲取

使用KpnI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB進(jìn)行雙酶切，酶切體系如表11所示：

表11 XhoI和EcoRI雙酶切體系

混勻后置于37℃酶切6h。膠回收的步驟同步驟八，獲得基因片段cat-PacA-ctxB，在紫外分光光度計(jì)分別測(cè)其在OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值及DNA濃度，-20℃保存。

2、對(duì)載體pCAMBIA進(jìn)行KpnI和SalI雙酶切，酶切體系如表12所示，混勻后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混勻后37℃反應(yīng)1h后75℃金屬浴10min以滅活去磷酸化酶，經(jīng)PCR純化試劑盒純化(具體過程同步驟八)，-20℃保存。

表12：KpnI和SalI雙酶切體系

3、載體pCAMBIA與cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的連接反應(yīng)，其連接體系如表13所示：

表13 載體pCAMBIA與cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的連接體系

上述連接混合液16℃過夜反應(yīng)12-16h，得到連接好的pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的重組質(zhì)粒。

4、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化步驟同步驟五，得到pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒的感受態(tài)JM109細(xì)胞菌液。

5、對(duì)pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定

由于融合基因分子量大，用PCR直接擴(kuò)增較難，因此選擇分別用cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR的引物PCR擴(kuò)增重組子，體系及循環(huán)條件同步驟三，以確定目的基因插入pCAMBIA載體中。

PCR循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)電泳(如圖8所示)鑒定大小正確后，所篩得陽性克隆于12℃保存，長期保存需移至-20℃或-80℃條件

6、重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鑒定同步驟六，其酶切體系如表14所示：

表14 重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR酶切體系

酶切產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖9所示)，以確定是否正確重組pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，在全自動(dòng)凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果并保存圖像。

步驟十、重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的構(gòu)建和鑒定

一、目的基因E8片段的獲取

1、番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8啟動(dòng)融合蛋白基因片段的獲取

①.以T-E8為模板，根據(jù)番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8啟動(dòng)融合蛋白基因序列并設(shè)計(jì)如表1所示引物，并按下述PCR體系及擴(kuò)增條件體外擴(kuò)增目的基因E8。

PCR擴(kuò)增目的基因E8的反應(yīng)體系如表15所示：

表15 PCR反應(yīng)體系

E8PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：

循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)電泳(如圖10所示)鑒定大小正確后于12℃保存，長期保存需移至-20℃或-80℃條件。

②.使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒膠回收E8片段，紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算DNA的濃度。

③.使用HindⅢ和SalⅠ對(duì)E8回收片段進(jìn)行酶切，切去保護(hù)堿基，酶切體系見表16，混勻后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混勻后37℃反應(yīng)1h后75℃金屬浴10min以滅活去磷酸化酶，經(jīng)PCR純化試劑盒純化(具體過程同步驟八)，-20℃保存。

表16 HindⅢ、SalⅠ雙酶切體系

2、使用HindⅢ和SalⅠ對(duì)載體質(zhì)粒pCAMBIA進(jìn)行雙酶切，酶切體系參照表16，37℃酶切6-8h；膠回收切出的11.6kb線性載體，測(cè)定回收產(chǎn)物濃度。

二、E8目的基因與載體質(zhì)粒pCAMBIA的連接

將上述純化得到的E8目的基因連接至pCAMBIA載體上，其連接體系同步驟四表4所示，得到連接好的pCAMBIA-E8重組質(zhì)粒。

三、重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將上述連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM109細(xì)胞中，具體方法同步驟五。

四、挑選出上述菌體進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定，篩選重組子。菌液PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)擴(kuò)增條件同步驟三。

篩選重組子pCAMBIA-E8質(zhì)粒的單酶切體系如表17所示，混勻后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混勻后37℃反應(yīng)1h后75℃金屬浴10min以滅活去磷酸化酶，經(jīng)PCR純化試劑盒純化(具體過程同步驟八)，得到pCAMBIA-E8質(zhì)粒，-20℃保存。

表17 pCAMBIA-E8質(zhì)粒XhoⅠ酶切體系

五、目的基因cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR片段的獲取

使用XhoⅠ和SalⅠ對(duì)步驟九獲取的重組質(zhì)粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR進(jìn)行雙酶切，酶切體系如表18所示，37℃水浴8h，膠回收切出的4.6kb片段cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，測(cè)定回收產(chǎn)物濃度。

表18 pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的XhoⅠ和SalⅠ雙酶切體系

六、目的基因cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR片段與重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8的連接

將上述純化得到cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR目的基因連接至重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8載體上，其連接體系同步驟四表4所示，得到連接好的pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質(zhì)粒。

七、重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞

將上述連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM109細(xì)胞中，具體方法同步驟五。

八、挑選出上述菌體進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定，篩選重組子。菌液PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)擴(kuò)增條件同步驟三。

重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鑒定同步驟六，其酶切體系如表18所示，酶切產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定是否正確重組pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，在全自動(dòng)凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果并保存圖像。

將重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR送公司測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果及載體序列，繪制DNA序列圖譜(如圖11所示)及全序列如SEQ ID:1所示。

SEQ ID No1所示的序列中，6745-6850位的GGTCAC；10302-1037位的TCTAGA；12622-12627位的GTCGAG分別為Xho I、Xba I和Sal I的酶切位點(diǎn)。

實(shí)施例2、防齲轉(zhuǎn)基因番茄的培育

為提高本發(fā)明防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗的免疫能力，本發(fā)明通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將實(shí)施例1獲得的防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗采用注射法對(duì)蕃茄子葉細(xì)胞進(jìn)行浸染，培育得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化番茄植株。

該防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗的具體培育方法如下所述：

步驟一、無菌苗的培養(yǎng)

1、將挑選好的番茄種子放置于干凈的離心管中并加入ddH₂O浸泡番茄種子，將離心管放入50-55℃水浴中30min；

2、用一次性滴管移出離心管中的液體，加入75％酒精浸泡消毒30s，無菌ddH₂O沖洗一次；

3、用20％次氯酸鈉浸泡消毒15min，高壓滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗3-5次；

4、將消毒后的種子放置于滅菌紙上吸干種子表面多余的水分；

5、用無菌金屬接種鏟將番茄種子均勻接種于裝有MS固體培養(yǎng)基(購自于北京康倍斯)的錐形瓶中，密封培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)、25℃、3-5d)；

6、待約60％的種子萌發(fā)出胚根后轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：濕度：40-50％，溫度：25±3℃，光照：16h/d，黑暗：8h/d)；

步驟二、重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞農(nóng)桿菌EHA105中，步驟如下：

1、取-80℃中取出感受態(tài)細(xì)胞2支，置于冰浴中

2、超凈臺(tái)內(nèi)向感受態(tài)細(xì)胞中各加入實(shí)施例1獲得的重組質(zhì)粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR 10μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物，依次放于冰上靜置15min、-80℃5min、37℃水浴5min和冰上放置5min；

3、超凈臺(tái)內(nèi)加入無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基(購自于青島拓普生物工程有限公司)，28℃震蕩培養(yǎng)2-3h；

4、4℃離心6000rpm，1min，超凈臺(tái)內(nèi)棄部分上清，預(yù)留部分上清輕輕吹打重懸菌塊混勻；

5、將混勻的菌液涂布于含卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基的平板上，倒置28℃培養(yǎng)1-2d；

6、待YEB平板上菌落直徑約1.5-2mm時(shí)，超凈臺(tái)內(nèi)用無菌牙簽挑取單菌落于裝有卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)24h；

7、對(duì)E8、cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的片段進(jìn)行PCR鑒定。

步驟三、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的制備

1、將講述步驟二鑒定后的陽性克隆菌液轉(zhuǎn)接到含卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)12h；

2、用含MS液體培養(yǎng)基的懸浮液和含乙酰丁香酮的浸染液4℃懸浮離心10000rpm，1min，收集菌體，所得到的菌體即為轉(zhuǎn)化液；

3、調(diào)節(jié)OD₆₀₀分別為0.2、0.5和0.7。

步驟四、番茄子葉注射及共培養(yǎng)

1、挑選合適的番茄子葉；

2、用無菌注射器在番茄子葉背面葉脈分支處注射OD₆₀₀分別為0.2、0.5和0.7的轉(zhuǎn)化液；

3、將注射后的番茄子葉放于MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(濕度：40-50％，溫度25±3℃，光照：16h/d，黑暗：8h/d)。

步驟五、總RNA的提取

1、將上述步驟四共培養(yǎng)的番茄子葉放于RNAiso Plus液(購自于大連TaKaRa公司)中，-80℃保存24h；

2、取出后的番茄子葉在高通量組織研磨器中研磨，直至番茄子葉組織完全裂解；

3、室溫靜置5min，4℃離心12000rpm，5min，再靜置5min；

4、取上清液至干凈的去酶EP管中，加入氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min，4℃離心12000rpm，15min；

5、取上清液至干凈的去酶EP管中，加入異丙醇，緩慢顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃離心12000rpm，10min；

6、棄上清，加入無水乙醇與0.1％焦碳酸二乙酯水配成的75％酒精，4℃離心12000rpm，5min；

7、棄上清，將EP管倒置于濾紙上，于空氣中干燥2-3min；

8、加入高壓滅菌的0.1％焦碳酸二乙酯水于空氣干燥過的EP管中，靜置30-60min。

紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并記錄結(jié)果。

步驟六、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA

運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自于大連TaKaRa公司，使用方法參照說明書)，將上述步驟五獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA加入量(μl)計(jì)算公式為：500ng/測(cè)值。逆轉(zhuǎn)錄體系如表19所示：

表19 逆轉(zhuǎn)錄體系

注：RNA加入量不應(yīng)大于所計(jì)算的體積

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15min，85℃5s，4℃∞。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存。

步驟七、目的基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

將上述步驟六逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中目的基因的進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其擴(kuò)增檢測(cè)同實(shí)施例1。

步驟八、GUS檢測(cè)

取2μl步驟六獲得的cDNA作為模板，進(jìn)行GUS片段的PCR鑒定。GUS基因片段鑒定引物序列見表20，反應(yīng)體系和條件同前。

表20 gus基因片段鑒定引物序列

參照J(rèn)efferson等的方法，將待檢測(cè)番茄植株的葉片、莖段及根須放入配置好的GUS染液中，液體需浸沒植物。設(shè)立陰性和陽性對(duì)照，在37℃水浴染色4h，觀察染色情況，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示。圖12顯示了再生苗GUS染色結(jié)果，陽性對(duì)照及再生苗的根、莖、葉都有暗藍(lán)色物質(zhì)生成。本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)基因番茄苗的葉、莖和根中都檢測(cè)到了GUS基因的存在，說明其他外源基因已轉(zhuǎn)入番茄植株。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

1、細(xì)菌培養(yǎng)

將保存菌種S.mutans Ingbritt接種于MSB瓊脂培養(yǎng)基，95％N₂，5％CO₂，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。取單菌落干BHI培養(yǎng)基中，95％N2，5％CO₂，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。調(diào)整細(xì)菌濃度為1×10⁹CFU/mL，備用。

2、齲齒模型的制備

18天齡SD大鼠18只，雌鼠，斷乳后即給于致齲飼料2000#(Navia 1997)(表23)。20天時(shí)給予含氯霉素、氨芐青霉素及羧芐青霉素(用量為1克/公斤飼料)的致齲飼料，連續(xù)喂養(yǎng)3天。然后用無菌棉簽涂拭幼鼠口腔并接種于BHI和MSB培養(yǎng)基中，95％N₂，5％CO₂，37℃培養(yǎng)48小時(shí)以觀察幼鼠口腔中抗生素滅菌情況。24--26天于牙面上連續(xù)接種細(xì)菌濃度為1×10⁹CFU/ml S.mutans Ingbritt，每天接種3次，間隔30分鐘，每次200μl變形鏈球菌菌液。接種后以棉拭子采集口腔及磨牙牙合面的細(xì)菌標(biāo)本，檢測(cè)口腔變形鏈球菌感染情況。

表21 2000#Keyes致齲飼料構(gòu)成成分

Table 21 Forage prescription 2000^#of dental caries

3、動(dòng)物選擇和分組

根據(jù)課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用大鼠最大胃容量作為灌胃的最大劑量，將18d SD大鼠隨機(jī)分3大組：A組為實(shí)驗(yàn)組1mL/100g劑量喂食表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁，5只動(dòng)物。陰性對(duì)照組：以1mL/100g劑量喂食非轉(zhuǎn)基因番茄汁，5只動(dòng)物。陽性對(duì)照組：喂食變異鏈球菌UA159滅活全菌疫苗(0.4m1/10g)，5只動(dòng)物。

4、免疫方式及樣本采集

4.1免疫時(shí)間

共免疫4次，每周免疫一次，連續(xù)免疫4周。相同條件下，大鼠單籠飼養(yǎng)，免疫前禁食、禁水12小時(shí)，并在免疫前1天及免疫后1、2、3、4、5周采集血液、唾液樣本。

4.2血液樣本

采用眶后靜脈叢采血法收集靜脈血約200-400μl血液樣本，4℃過夜。次日，用一無菌木制棒將血塊輕輕挑起，使之由采血管側(cè)壁脫落，4℃，4000rpm×10min，收集血清，-80℃保存。血液采集見圖13。

4.3唾液樣本

2％硝酸毛果蕓香堿(0.1g/mL)按照0.6mg/100g的劑量對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射，大約3分鐘后開始收集唾液約300μl-500μl，4℃,12000rpm×10min，收集上清，棄去唾液中雜質(zhì)后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ僖翰杉妶D14。

5、樣本檢測(cè)

5.1交叉連續(xù)稀釋分析法確定抗原包被的最佳濃度、酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度及待測(cè)樣品最佳稀釋濃度

通過交叉連續(xù)稀釋分析法來確定抗原包被的最佳濃度、標(biāo)本最佳稀釋濃度以及酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度：PacA唾液最佳包被濃度為5μg/mL；酶標(biāo)抗體最佳工作濃度過氧化酶標(biāo)記羊抗大鼠IgA(1:4000)。PacA血清最佳包被濃度為5μg/mL；酶標(biāo)抗體最佳工作濃度過過氧化酶標(biāo)記羊抗大鼠IgG(1:10000)；唾液最佳稀釋濃度1:6，血清最佳稀釋濃度1：40。

SD大鼠的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、體重變化見表22，表23，圖15

表22 隨時(shí)間變化各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重(n＝6)結(jié)果

從表22，圖15，大鼠體重整體呈逐漸上升趨勢(shì)，體重在相同時(shí)間點(diǎn)陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2、唾液中SIgA型抗體水平的觀察見表23，圖16。

表23 隨時(shí)間變化各實(shí)驗(yàn)組大鼠唾液中SIgA型抗體(OD₄₅₀，n＝6)值結(jié)果

從表23，圖16可知，實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組都在初始免疫后的1周SIgA型抗體水平開始有上升趨勢(shì)，3-5周上升比較迅速。免疫前各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；免疫后2周至6周陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間相同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3、血液中IgG型抗體水平的觀察

在血清中檢測(cè)到特異性IgG抗體，且與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)口服途徑免疫SD大鼠后可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性SIgA和IgG抗體，由此可得出：該轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有較好的免疫原性，能夠抑制SD大鼠齲齒的發(fā)生。

SEQUENCE LISTING

<110> 遵義醫(yī)學(xué)院

<120> 防齲轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制備方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 60

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 120

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg 180

aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 240

aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga 300

ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt 360

cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag 420

aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct cgcggagggt agcatgttga 480

ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc 540

gatactatgt tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta 600

aggttttaga atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg 660

ggtatcttta aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat 720

caccggaatt gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt 780

ctcctgctaa ggtatataag ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg 840

acagccggta taaagggacc acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc 900

tggaaggaaa gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca 960

atctgctcat gagtgaggcc gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa 1020

gccctgaaaa gattatcgag ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca 1080

tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac 1140

tgaataacga tctggccgat gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag 1200

atccgcgcga gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt 1260

cccacggcga cctgggagac agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta 1320

ttgatcttgg gagaagcggc agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt 1380

cgatcaggga ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga 1440

tcaagcctga ttgggagaaa ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc 1500

tagaatgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1560

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1620

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1680

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1740

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1800

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1860

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1920

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1980

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 2040

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2100

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 2160

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2220

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 2280

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 2340

aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 2400

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 2460

cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 2520

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2580

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg 2640

tgccttgatg tgggcgccgg cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta 2700

gattgcctgg ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg 2760

aagcggcggg gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg 2820

ctgtgcgctg gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt 2880

ttaaagagtt ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt 2940

gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 3000

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt 3060

cccctgctag ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt 3120

cgccctcgat caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct 3180

ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 3240

acttcttgaa ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg 3300

cttctgcctt gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat 3360

cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 3420

cgcggtacat ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct 3480

ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 3540

tcttggcctt cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt 3600

ctaccaggtc gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg 3660

caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 3720

tggattcggt tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca 3780

tgccggccgg ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct 3840

cgccagctcg tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac 3900

tatcgcgggt gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct 3960

tgggcggctt cctaatcgac ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga 4020

ttcgatcagc ggccgcttgc cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc 4080

gctgggcggc ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga 4140

tttgtaccgg gccggatggt ttgcgaccgt cacgccgatt cctcgggctt gggggttcca 4200

gtgccattgc agggccggca gacaacccag ccgcttacgc ctggccaacc gcccgttcct 4260

ccacacatgg ggcattccac ggcgtcggtg cctggttgtt cttgattttc catgccgcct 4320

cctttagccg ctaaaattca tctactcatt tattcatttg ctcatttact ctggtagctg 4380

cgcgatgtat tcagatagca gctcggtaat ggtcttgcct tggcgtaccg cgtacatctt 4440

cagcttggtg tgatcctccg ccggcaactg aaagttgacc cgcttcatgg ctggcgtgtc 4500

tgccaggctg gccaacgttg cagccttgct gctgcgtgcg ctcggacggc cggcacttag 4560

cgtgtttgtg cttttgctca ttttctcttt acctcattaa ctcaaatgag ttttgattta 4620

atttcagcgg ccagcgcctg gacctcgcgg gcagcgtcgc cctcgggttc tgattcaaga 4680

acggttgtgc cggcggcggc agtgcctggg tagctcacgc gctgcgtgat acgggactca 4740

agaatgggca gctcgtaccc ggccagcgcc tcggcaacct caccgccgat gcgcgtgcct 4800

ttgatcgccc gcgacacgac aaaggccgct tgtagccttc catccgtgac ctcaatgcgc 4860

tgcttaacca gctccaccag gtcggcggtg gcccatatgt cgtaagggct tggctgcacc 4920

ggaatcagca cgaagtcggc tgccttgatc gcggacacag ccaagtccgc cgcctggggc 4980

gctccgtcga tcactacgaa gtcgcgccgg ccgatggcct tcacgtcgcg gtcaatcgtc 5040

gggcggtcga tgccgacaac ggttagcggt tgatcttccc gcacggccgc ccaatcgcgg 5100

gcactgccct ggggatcgga atcgactaac agaacatcgg ccccggcgag ttgcagggcg 5160

cgggctagat gggttgcgat ggtcgtcttg cctgacccgc ctttctggtt aagtacagcg 5220

ataaccttca tgcgttcccc ttgcgtattt gtttatttac tcatcgcatc atatacgcag 5280

cgaccgcatg acgcaagctg ttttactcaa atacacatca cctttttaga cggcggcgct 5340

cggtttcttc agcggccaag ctggccggcc aggccgccag cttggcatca gacaaaccgg 5400

ccaggatttc atgcagccgc acggttgaga cgtgcgcggg cggctcgaac acgtacccgg 5460

ccgcgatcat ctccgcctcg atctcttcgg taatgaaaaa cggttcgtcc tggccgtcct 5520

ggtgcggttt catgcttgtt cctcttggcg ttcattctcg gcggccgcca gggcgtcggc 5580

ctcggtcaat gcgtcctcac ggaaggcacc gcgccgcctg gcctcggtgg gcgtcacttc 5640

ctcgctgcgc tcaagtgcgc ggtacagggt cgagcgatgc acgccaagca gtgcagccgc 5700

ctctttcacg gtgcggcctt cctggtcgat cagctcgcgg gcgtgcgcga tctgtgccgg 5760

ggtgagggta gggcgggggc caaacttcac gcctcgggcc ttggcggcct cgcgcccgct 5820

ccgggtgcgg tcgatgatta gggaacgctc gaactcggca atgccggcga acacggtcaa 5880

caccatgcgg ccggccggcg tggtggtgtc ggcccacggc tctgccaggc tacgcaggcc 5940

cgcgccggcc tcctggatgc gctcggcaat gtccagtagg tcgcgggtgc tgcgggccag 6000

gcggtctagc ctggtcactg tcacaacgtc gccagggcgt aggtggtcaa gcatcctggc 6060

cagctccggg cggtcgcgcc tggtgccggt gatcttctcg gaaaacagct tggtgcagcc 6120

ggccgcgtgc agttcggccc gttggttggt caagtcctgg tcgtcggtgc tgacgcgggc 6180

atagcccagc aggccagcgg cggcgctctt gttcatggcg taatgtctcc ggttctagtc 6240

gcaagtattc tactttatgc gactaaaaca cgcgacaaga aaacgccagg aaaagggcag 6300

ggcggcagcc tgtcgcgtaa cttaggactt gtgcgacatg tcgttttcag aagacggctg 6360

cactgaacgt cagaagccga ctgcactata gcagcggagg ggttggatca aagtactttg 6420

atcccgaggg gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg ataaaccttt 6480

tcacgccctt ttaaatatcc gttattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc 6540

caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta attcccgatc tagtaacata gatgacaccg 6600

cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 6660

ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt 6720

taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 6780

caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatcg gggaaattcg 6840

agctggtcac ctttcacgaa atcggccctt attcaaaaat aacttttaaa taatgaattt 6900

taaattttaa gaaataatat ccaatgaata aatgacatgt agcattttac ctaaatattt 6960

caactatttt aatccaatat taatttgttt tattcccaac aatagaaagt cttgtgcaga 7020

catttaatct gacttttcca gtactaaata ttaattttct gaagattttc gggtttagtc 7080

cacaagtttt agtgagaagt tttgctcaaa attttaggtg agaaggtttg atatttatct 7140

tttgttaaat taatttatct aggtgactat tatttattta agtagaaatt catatcatta 7200

cttttgccaa cttgtagtca taataggagt aggtgtatat gatgaaggaa taaacaagtt 7260

cagtgaagtg attaaaataa aatataattt aggtgtacat caaataaaaa ccttaaagtt 7320

tagaaaggca ccgaataatt ttgcatagaa gatattagta aatttataaa aataaaagaa 7380

atgtagttgt caagttgtct tctttttttt ggataaaaat agcagttggc ttatgtcatt 7440

cttttacaac ctccatgcca cttgtccaat tgttgacact taactaatta gtttgattca 7500

tgtatgaata ctaaataatt ttttaggact gactcaaata tttttatatt atcatagtaa 7560

tatttatcta atttttagga ccacttatta ctaaataata aattaactac tactatatta 7620

ttgttgtgaa acaacaacgt tttggttgtt atgatgaaac gtacactata tcagtatgaa 7680

aaattcaaaa cgattagtat aaattatatt gaaaatttga tatttttcta ttcttaatca 7740

gacgtattgg gtttcatatt ttaaaaaggg actaaactta gaagagaagt ttgtttgaaa 7800

ctacttttgt ctctttcttg ttcccatttc tctcttagat ttcaaaaagt gaactacttt 7860

atctctttct ttgttcacat tttattttat tctattataa atatggcatc ctcatattga 7920

gatttttaga aattattcta atcattcaca gtgcaaaagc tcgagaagct agcaatgacc 7980

gaagtgacat ctaagcaaga agctgctagt agtcaaacta atcatacagt aacgacaatc 8040

agtagctcta cttcagtagt taatcccaaa gaggttgtaa gtaatcctta tactgttggg 8100

gaaacagctt ctaatggtga aaagctacaa aatcaaacaa ctacagttga caaaacttct 8160

gaagctgctg ctaataatat tagtaaacaa acaaccgaag ctgatacaga tgttattgat 8220

gatagcaatg cagccaatct acaaatattg gaaaaacttc ccaatgtaaa agaaattgat 8280

ggtaagtatt attattatga caataacggc aaagttcgta ctaattttac attaattgct 8340

gatggcaaaa ttttacattt tgatgaaact ggcgcttata ctgatacatc aattgacact 8400

gtaaataaag acatcgtcac aacaagaagt aatctataca aaaaatataa tcaagtttat 8460

gatcgctctg cacagagctt tgagcatgtt gatcattatt tgacagccga aagtccacca 8520

ggcccaccca ggcggaggac caggccgatg gtagatacta aagtagttgg aacacaaact 8580

ggaaatccag cgaccaattt gccagaggct caagggagtg cgagtaagga agctgaacaa 8640

agtcaaaacc aagctggaga gacaaatggt tcaataccag ttgaagtacc taaaactgat 8700

cttgatcaag cagcaaaaga tgctaagtct gctggtgtca atgttgtcca agatgccgat 8760

gttaataaag gaactgttaa aacagctgaa gaagcagtcc aaaaagaaac tgaaattaaa 8820

gaagattaca caaaacaagc tgaggatatt aagaagacaa cagatcaata taaatcggat 8880

gtagctgctc atgaggcaga agttgctaaa atcaaagcta aaaatcaggc aactaaagaa 8940

cagtatgaaa aagatatggc agctcataaa gccgaggttg aacgcattaa tgctgcaaat 9000

gctgccagta aaacagctta tgaagctaaa ttggctcaat atcaagcaga tttagcagcc 9060

gttcaaaaaa ccaatgctgc caatcaagca gcctatcaaa aagcccttgc tgcttatcag 9120

gctgaactga aacgtgttca ggaagctaat gcagccgcca aagccgctta tgatactgct 9180

gtagcagcaa ataatgctaa aaatacagaa attgccgctg ccaatgaaga aattagaaaa 9240

cgcaatgcaa cggccaaagc tgaatatgag actaagttag ctcaatatca agctgaacta 9300

aagcgtgttc aggaagctaa tgccgcaaac gaagcagact atcaagctaa attgaccgcc 9360

tatcaaacag agcttgctcg cgttcaaaaa gccaatgcgg atgctaaagc ggcctatgaa 9420

gcagctgtag cagcaaataa tgccaaaaat gcggcactca cagctgaaaa tactgcaatt 9480

aagcaacgca atgagaatgc taaggcgact tatgaagctg cactcaagca atatgaggcc 9540

gatttggcag cggtgaaaaa agctaatgcc gcaaacgaag cagactatca agctaaattg 9600

accgcctatc aaacagaact cgctcgcgtt caaaaagcca atgcggatgc taaagcggcc 9660

tatgaagcag ctgtagcagc aaataatgcc gcaaatgcag cgctcacagc tgaaaatact 9720

gcaattaaaa agcgcaatgc ggatgctaaa gctgattacg aagcaaaact tgctaagtat 9780

caagcagacc ttgccaaata tcaaaaagat ttagcagact atccagttaa gttaaaggca 9840

tacgaatctg agaaggatga gctgcggagg accaggaggc ggaggaccag gccgatgatt 9900

aaattaaaat ttggtgtttt ttttacagtt ttactatctt cagcatacgc acatggaaca 9960

cctcaaaata ttactgattt gtgtgcagaa taccacaaca cacaaatata tacgctaaat 10020

gataagatat tttcgtatac agaatctcta gctggaaaaa gagagatggc tatcattact 10080

tttaagaatg gtgcaatttt tcaagtagaa gtaccaggta gtcaacatat agattcacaa 10140

aaaaaagcga ttgaaaggat gaaggatacc ctgaggattg catatcttac tgaagctaaa 10200

gtcgaaaagt tatgtgtatg gaataataaa acgcctcatg cgattgccgc aattagtatg 10260

gcaaataggc ggaggaccag gccgccacca ggcccaccca ttctagacct gctgttcatc 10320

tgtgtctcct gctttgaata caagggaaag cagagttctg acaaagtcag taaccaggtc 10380

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gcccgggggg agatgatgcg acgtcggatt ccaggcactg accggtttcc aggcctaaat 10500

gagaatctga ggtggaggaa ggagcagaca cagtggcggc aagctaacga gaagctggac 10560

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aatttgatca tactggacat gcaggaaaac atcatccagg caagctcctc cctggactgt 10680

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tacttccgag ttggtttcta cggatccaaa tttggggatt tggatgagca ggaatttgtg 11760

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accaagttgg atcctaacaa ggcctacata cagatcactt ttgtggagcc ttactttgat 11940

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cagttgtcac agggcagctg agtcgag 12627