本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組腺病毒，尤其是一種能在同一腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒E2基因和藍(lán)耳病病毒GP5基因的重組腺病毒及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。目前，免疫接種仍是豬瘟防治的主要措施，而且是根除本病和阻止野毒傳向無豬瘟豬群傳播的必要手段。豬瘟疫苗無論在過去、現(xiàn)在還是將來，對(duì)控制和消滅豬瘟都具有極其重要的作用，各國學(xué)者對(duì)豬瘟疫苗的研制和開發(fā)一直沒有放棄。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗包括滅活疫苗和弱毒疫苗，但滅活苗免疫效力低，保護(hù)期短，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫力的速度慢，且到目前為止，組織培養(yǎng)豬瘟毒的產(chǎn)量和滅活所造成的病毒有效抗原的損失仍是制造滅活疫苗的二大障礙。豬瘟弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，對(duì)于控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用。但是弱毒疫苗也有其不足的地方，首先近年來豬瘟的流行特點(diǎn)在世界范圍內(nèi)發(fā)生了很大的變化，呈現(xiàn)周期性、波浪形的的地區(qū)性散發(fā)和溫和性豬瘟，發(fā)病后的臨床癥狀是：無名高熱、癥狀不典型、持續(xù)性感染、出生仔豬先天性震顫和母豬繁殖性障礙。用傳統(tǒng)疫苗免疫常常造成免疫失敗，即使將劑量增加到750個(gè)兔體反應(yīng)(國家規(guī)定150個(gè)兔體反應(yīng))也不能預(yù)防其感染，而且有蔓延的趨勢。在妊娠早期接種疫苗還會(huì)發(fā)生疫苗毒通過胎盤感染胎兒，造成死胎或 弱仔并成持續(xù)性帶毒者，產(chǎn)生新的疫源；其次，弱毒疫苗已經(jīng)沿用了近40年，豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化，說明豬瘟病毒的抗原性可能存在著變異，特別是近年來國內(nèi)外應(yīng)用單克隆抗體對(duì)C-株檢測，發(fā)現(xiàn)有不同的反應(yīng)模式，表明經(jīng)過多年在不同細(xì)胞上的馴化，C-株已經(jīng)產(chǎn)生變異，這種流行毒株的變化趨勢國內(nèi)外情況基本一致，流行毒往往逃避免疫，導(dǎo)致免疫失敗的嚴(yán)重后果。第三，接種弱毒疫苗還會(huì)影響到國際貿(mào)易，歐盟已禁止使用豬瘟弱毒疫苗，而采用嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫制度、撲殺豬瘟感染豬和血清學(xué)陽性豬來控制和消滅豬瘟。采用撲殺政策需要大量的人力、物力和巨額資金，發(fā)展中國家是難以承受的，這就促使人們研究和開發(fā)新型的豬瘟疫苗來防控本病。近年來，基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開發(fā)提供了工具，目前，豬瘟基因工程疫苗的研制已經(jīng)成為新的研究方向和熱點(diǎn)。

藍(lán)耳病在我國大面積流行近10年了，其滅活疫苗從最初的普通疫苗發(fā)展到今天的高效濃縮疫苗，其免疫次數(shù)也越來越多，在實(shí)際應(yīng)用中，滅活苗的免疫原性較差，往往接種后抗體效價(jià)較低，達(dá)不到保護(hù)的作用，而且滅活苗注射劑量大、免疫次數(shù)多、抗體產(chǎn)生慢。如果抗體與野毒的基因序列比較相似，同樣會(huì)產(chǎn)生保護(hù)；如果基因序列不相似，則保護(hù)力比較差。在藍(lán)耳病的滅活苗使用中，如果沒有合適的高效的免疫佐劑，其免疫效果更差。弱毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是：能在體內(nèi)繁殖，產(chǎn)生抗體快，成本低，免疫期長。但是弱毒疫苗接種后，存在豬場帶毒的危險(xiǎn)，而且免疫后監(jiān)測指標(biāo)又無法與野毒感染相區(qū)分。有些學(xué)者認(rèn)為，藍(lán)耳病弱毒疫苗免疫后會(huì)對(duì)母豬的繁殖性能和公豬的精子 活力造成影響，所以弱毒苗的安全性和效力不可靠，不主張接種弱毒疫苗。

另外，藍(lán)耳病病毒侵害巨噬細(xì)胞，影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，據(jù)臨床使用結(jié)果表明，藍(lán)耳病弱毒苗和豬瘟弱毒苗同時(shí)免疫后會(huì)導(dǎo)致豬瘟的免疫效果下降，在豬瘟的控制上造成了很大困難。

人－5型腺病毒載體與其他動(dòng)物病毒載體相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起輕微的癥狀，腺病毒重組后，毒力進(jìn)一步降低，并且克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因隨機(jī)整合可能導(dǎo)致插入突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)；其次是宿主范圍廣，腺病毒可感染多種細(xì)胞包括分裂與非分裂細(xì)胞；第三是穩(wěn)定，腺病毒粒子十分牢固，不易突變，并且容易大量制備并純化，得到高滴度的病毒，在體外可獲得1011pfu/mL；第四就是對(duì)于腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能目前研究得比較清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大。在基因治療構(gòu)建重組疫苗中大多采用缺失El和E3區(qū)基因的腺病毒載體，通常復(fù)制缺陷型腺病毒可容納約7kb～8kb的外源基因，比逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒的容量大很多；還有免疫途徑簡便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接種簡便，可口服或氣霧吸入而不需注射，并且經(jīng)口服后能產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易于推廣使用。

非復(fù)制型腺病毒不僅更安全有效，而且以低劑量的方式產(chǎn)生抗原蛋白而不裂解細(xì)胞，故表達(dá)抗原的時(shí)間更持久，有利于激發(fā)長期的免疫反應(yīng)。目前，已經(jīng)有多種產(chǎn)品已經(jīng)上市，例如：“安柯瑞——重組 人5型腺病毒注射液”；“重組人γ-干擾素腺病毒注射液(E10B)”；“今又生(重組人p53腺病毒注射液)”；“人禽流感重組腺病毒疫苗臨床前安全評(píng)價(jià)方法的研究”取得階段性成果；“重組腺病毒-胸苷激酶基因制劑”；另外“豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒和疫苗”已經(jīng)被南京農(nóng)業(yè)大學(xué)申請(qǐng)專利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決豬瘟弱毒苗和藍(lán)耳病弱毒苗不能同時(shí)免疫，以及弱毒疫苗長期接種導(dǎo)致的病毒返祖、獨(dú)立增強(qiáng)的現(xiàn)象，和弱毒疫苗株和野毒發(fā)生重組等問題，本發(fā)明提供一種能在同一腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒E2基因和藍(lán)耳病病毒GP5基因的重組腺病毒及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種重組腺病毒，通過在腺病毒的CMV啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)Bgl II和Sal I酶切位點(diǎn)中插入豬瘟病毒E2基因，在腺病毒的CMV啟動(dòng)子下游Kpn I和Not I酶切位點(diǎn)中插入藍(lán)耳病病毒GP5基因。

所述豬瘟病毒為常規(guī)的市購病毒，該病毒的E2基因在GenBank中的登錄號(hào)為：AY775178.2。

所述藍(lán)耳病病毒為常規(guī)的市購病毒，該病毒的GP5基因在GenBank中的登錄號(hào)為：AY740012.1。

所述腺病毒為常規(guī)的市購人－5型非復(fù)制型腺病毒。

所述在腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒E2基因和藍(lán)耳病病毒GP5基因的重組腺病毒，包括下列構(gòu)建步驟：

A.從市購的豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒中分別擴(kuò)增出E2和GP5基 因；

B.將步驟A獲得的豬瘟病毒E2基因通過Bgl II和Sal I酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2；

C.將步驟A獲得的藍(lán)耳病病毒GP5基因通過Kpn I和Not I酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-GP5；

D.將步驟C的腺病毒穿梭載體pAdTrack-GP5按常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出含有CMV啟動(dòng)子的CMV-GP5基因，通過Xhol I和Xba I酶切位點(diǎn)插入至步驟B的腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2中的Xhol I和Xba I酶切位點(diǎn)中，形成重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5；

E.將步驟D的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5經(jīng)Pme I酶切線性化后，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAd-easy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，形成重組腺病毒骨架載體pAd-easy-E2-CMV-GP5；

F.將重組腺病毒骨架載體pAd-easy-E2-CMV-GP5經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK2983中，包裝出重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果：

采用上述方案獲得的重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5，能在同一腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白和藍(lán)耳病病毒GP5蛋白，解決了 E2和GP5基因融合串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)量低和保護(hù)效果弱的問題，本發(fā)明僅通過一次免疫接種就能夠使免疫后的豬同時(shí)獲得對(duì)豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒的抗體，對(duì)豬瘟和藍(lán)耳病具有較強(qiáng)的抵抗能力，降低了疫苗接種次數(shù)和成本，并從根本上解決了豬瘟弱毒苗和藍(lán)耳病弱毒苗不能同時(shí)免疫的問題，本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5屬于非復(fù)制型病毒，在豬體內(nèi)不繁殖，解決了弱毒疫苗長期接種導(dǎo)致的病毒返祖，毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5僅含有豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒的主要保護(hù)基因，不含病毒的其它基因，因此，使弱毒疫苗株和野毒株之間不會(huì)發(fā)生重組。采用上述方案構(gòu)建獲得的重組腺病毒制成的疫苗，免疫本動(dòng)物后對(duì)豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒聯(lián)合攻擊的保護(hù)效果為87.5％。既解決了豬瘟和藍(lán)耳病疫苗不能同時(shí)免疫的問題，也解決了弱毒疫苗免疫后毒力返強(qiáng)和同源重組的問題。

附圖說明

圖1為ELISA檢測的豬瘟病毒抗體的水平；

圖2為ELISA檢測的藍(lán)耳病病毒抗體的水平。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保 護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

A.豬瘟病毒E2基因和藍(lán)耳病病毒GP5基因的擴(kuò)增

(1)PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

在豬瘟病毒E2基因的上、下游引物中分別加入Kpn I和Bgl II限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述豬瘟病毒E2基因的上、下游引物分別設(shè)計(jì)為：

上游引物P1：5’-AAAGGTACCATGAGGGGACAGATCGTGC-3’

下游引物P2：5’-CCCAGATCTACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3’

在藍(lán)耳病病毒GP5基因的上、下游引物中分別加入Bgl II和Not I和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述藍(lán)耳病病毒GP5基因的上、下游引物分別設(shè)計(jì)為：

上游引物P1：5’-AAAAGATCTATGTTGGGCAAGTGCTTGAC-3’

下游引物P2：5’-CCCGCGGCCGCCTAGAGACGAGCCCATTG-3’

(2)豬瘟病毒E2基因片段的體外擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化

將含有藍(lán)耳病病毒GP5基因的pMD18-T-GP5質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1μL為模板，用藍(lán)耳病病毒GP5基因的引物擴(kuò)增編碼GP5蛋白的目的片段，其中PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃儲(chǔ)存；將PCR產(chǎn)物置于8g/L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收藍(lán)耳病病毒GP5基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)藍(lán)耳病病毒GP5基因片段的體外擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化

將含有藍(lán)耳病病毒GP5基因的pMD18-T-GP5質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1μL為模板，用藍(lán)耳病病毒GP5基因的引物擴(kuò)增編碼GP5蛋白的目的片段，其中PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃儲(chǔ)存；將PCR產(chǎn)物置于8g/L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收藍(lán)耳病病毒GP5基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；

B.腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2的構(gòu)建

(1)豬瘟病毒E2基因PCR產(chǎn)物的Bgl II和Sal I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(2)穿梭載體pAdTrack-CMV的Bgl II和Sal I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(3)豬瘟病毒E2基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV的連接

連接反應(yīng)體系：

16℃水浴連接過夜；

(4)豬瘟病毒E2基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定

①DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

將－70℃甘油保種的DH5α接種于不含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取長勢良好的單菌落，接種于3mL新配置的不含抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，約14h；取100μL培養(yǎng)物，按1:100比例接種于100mL新鮮LB培養(yǎng)液中，300r/min劇烈振蕩培養(yǎng)約3h，至OD600為0.6；無菌條件下轉(zhuǎn)移細(xì)菌培養(yǎng)物至兩個(gè)預(yù)冷的50mL離心管中，冰浴10min；4℃下1600r/min離心10min，棄上清，倒置離心管瀝干液體，加入預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液10mL，懸浮菌體沉淀，置冰浴放置30min；4℃下1100r/min離心10min，棄上清，用2mL 0.1mol/L預(yù)冷的CaCl2(含150mL/L甘油)重懸菌體，然后分裝于預(yù)冷的滅菌Eppendorf管中，每管100μL，置－70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

取一管感受態(tài)細(xì)胞置于冰水混合物上，待完全融化后，將10μL的連接產(chǎn)物加入管中，輕輕混勻；冰浴30min；42℃水浴中熱激90s；冰浴3min；加入800μL LB培養(yǎng)基，37℃下200～250r/min振蕩培養(yǎng)1h；8000r/min離心1min，棄部分上清，存留100μL左右的上清重懸沉淀；取100μL混合物均勻涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB瓊脂平板上，待完全吹干后，37℃培養(yǎng)過夜(12～16h)；挑取單菌落于3mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；堿裂解法提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定；

將豬瘟病毒E2基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為：腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2；

C.腺病毒穿梭載體pAdTrack-GP5的構(gòu)建及CMV-GP5片段的獲得

(1)藍(lán)耳病病毒GP5基因PCR產(chǎn)物的Kpn I和Not I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(2)穿梭載體pAdTrack-CMV的Kpn I和Not I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(3)藍(lán)耳病病毒GP5基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV的連接

連接反應(yīng)體系：

16℃水浴連接過夜；

(4)藍(lán)耳病病毒GP5基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定

①DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

同步驟B的(4)①；

②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

同步驟B的(4)②；

將藍(lán)耳病病毒GP5基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為為：腺病毒穿梭載體pAdTrack-GP5；

(5)CMV-GP5基因的獲得

根據(jù)pAdTrack-GP5載體中CMV啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增CMV-GP5基因的引物：

上游引物P1：5’-AAACTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3’

下游引物P2：5’-CCCTCTAGATTACTACTAGAGACGAGCCCATTG-3’

在CMV-GP5基因的上、下游引物中分別加入Xho I、Xba I和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并在下游引物中引入終止密碼子；

D.重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5的構(gòu)建

(1)CMV-GP5基因PCR產(chǎn)物的Xho I和Xba I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(2)穿梭載體pAdTrack-E2的Xho I和Xba I雙酶切

向1.5mL Eppendorf管中依次加入：

以37℃水浴6h后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；

(3)CMV-GP5基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack-E2的連接

連接反應(yīng)體系：

16℃水浴連接過夜；

(4)CMV-GP5片段和pAdTrack-E2載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定

①DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

同步驟B的(4)①；

②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

同步驟B的(4)②；

將CMV-GP5片段插入至穿梭載體pAdTrack-E2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為：重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5；

E.重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E2-CMV-GP5的構(gòu)建

(1)重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5的線性化

用Pme I對(duì)穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5酶切線性化，按如下所示分別加入各組分：

置37℃水浴中6h后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收；

(2)線性化的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2-CMV-GP5轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞

同步驟B的(4)②；

將重組后的腺病毒骨架載體命名為：重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E2-CMV-GP5；

F.重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5的獲得

(1)重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E2-CMV-GP5的線性化、回收和純化

用Pac I酶切使重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E2-CMV-GP5線性化，酶切反應(yīng)體系為：

在酶切后的產(chǎn)物中，加入2.5體積的無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc，－20℃沉淀1h，在4℃以12000r/min離心15min，棄去上清，加入70％乙醇洗一次，自然干燥后，加入20μL H2O溶解DNA；

(2)重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5的獲得

將線性化的重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E2-CMV-GP5轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細(xì)胞HEK 293細(xì)胞中，具體操作按LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行；收獲的病毒液命名為重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5；

(3)重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5的擴(kuò)增及滴度測定

按照噬斑法測定rAd-E2-CMV-GP5在293細(xì)胞中傳至10代時(shí)的病毒滴度。

實(shí)施例2

1.rAd-E2-CMV-GP5免疫保護(hù)性試驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將24頭豬隨機(jī)分為4組，第一組為rAd-E2-CMV-GP5免疫組，8頭。第二組為豬瘟脾淋苗和藍(lán)耳病弱毒疫苗免疫組，8頭。第三組為非重組腺病毒免疫組，4頭。第四組為空白對(duì)照組，4頭。

(2)免疫和攻毒

重組腺病毒組和非重組腺病毒組的免疫劑量均為1.2×109pfu(約 2mL)，于頸部肌肉和腹部皮下多點(diǎn)注射；豬瘟兔化弱毒疫苗和藍(lán)耳病弱毒疫苗的免疫方法和劑量按照疫苗使用說明進(jìn)行；空白對(duì)照用培養(yǎng)重組腺病毒的DMEM培養(yǎng)液免疫，2mL/頭。所有試驗(yàn)豬在免疫后的20d時(shí)用致死量的豬瘟強(qiáng)毒和藍(lán)耳病強(qiáng)度肌肉注射、點(diǎn)眼、滴鼻和口服攻擊。

(3)體溫檢測和臨床觀察

所有試驗(yàn)豬從攻毒的第1天開始測量體溫，以后每天測量體溫，觀察臨床癥狀。

(4)血清抗體的檢測

從免疫開始和免疫后的每個(gè)星期采集血液，收集血清，用于豬瘟和藍(lán)耳抗體的檢測，另一份加入抗凝劑，用于血液中豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒的檢測。

(5)攻毒后血液中病毒存在的檢測

攻毒后隔天采集抗凝全血，用RT-PCR方法檢測血液中的豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒。

(6)病理觀察

在攻毒后的14天，當(dāng)所有存活豬的臨床癥狀基本消失后，全部處死并進(jìn)行剖檢，觀察下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、膀胱以及心臟是否有病理變化。

2.結(jié)果

(1)體溫和臨床癥狀

第一組(rAd-E2-CMV-GP5免疫組)在免疫后沒有出現(xiàn)任何臨床 癥狀，在攻毒后第4天，8頭免疫豬中3頭豬體溫達(dá)40℃以上，持續(xù)48h左右，第7天時(shí)1頭體溫仍持續(xù)達(dá)40℃以上，精神萎靡，先出現(xiàn)便秘，后拉稀，在第9天死亡。剩余的7頭豬全部存活。保護(hù)率為87.5％。

第二組(豬瘟脾淋苗和藍(lán)耳病弱毒苗免疫組)在攻毒后的第4天，8頭免疫豬中4頭豬體溫達(dá)40℃以上，持續(xù)48h左右，食欲稍微下降，其中2頭在第6天體溫和食欲恢復(fù)正常，另1頭在第10天死亡。剩余的7頭豬全部存活。保護(hù)率為87.5％。

第三組(非重組腺病毒免疫組)和第四組(空白對(duì)照組)的所有試驗(yàn)豬在攻毒后第2天體溫升至40℃以上，病豬便秘；第3天食欲減退，精神沉郁，有些病豬發(fā)生嘔吐，很少采食，僅少量飲水，精神高度沉郁，四肢軟弱無力，行動(dòng)緩慢，搖擺不穩(wěn)，普遍拉稀，兩眼無神，有多量黏液膿性分泌物，腹下、耳和四肢內(nèi)側(cè)有出血點(diǎn)；第4天病豬伏臥不起，全身震顫，四肢呈游泳狀劃動(dòng)，體溫一直稽留在41℃左右。第5天開始陸續(xù)死亡，至第7天全部死亡，死前體溫下降。死亡率為100％。

體溫及死亡情況見表1。

(2)抗豬瘟病毒和抗藍(lán)耳病病毒抗體的檢測

用中國獸藥監(jiān)察所提供的豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒對(duì)所有試驗(yàn)豬的抗體水平進(jìn)行檢測。rAd-E2-CMV-GP5免疫組的抗體呈上升趨勢，在攻毒前抗體OD₆₃₀值分別達(dá)到0.396，攻毒后所有試驗(yàn)組的抗體水平都呈明顯的上升趨勢。豬瘟兔化弱毒苗免疫組的抗體水平在攻 毒前的OD₆₃₀最高值為0.426。非重組腺病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組在攻毒前一直沒有檢測到抗體水平，但是在攻毒后臨死前能檢測到豬瘟抗體水平。圖1。

表1 不同疫苗免疫組CSFV強(qiáng)毒攻擊后體溫情況

用上海寶特生命科學(xué)發(fā)展有限公司生產(chǎn)的藍(lán)耳病病毒ELISA抗體檢測試劑盒對(duì)所有試驗(yàn)豬的抗體水平進(jìn)行檢測。rAd-E2-CMV-GP5免疫組的抗體呈上升趨勢，在攻毒前抗體OD₄₅₀值分別達(dá)到0.436，攻毒后所有試驗(yàn)組的抗體水平都呈明顯的上升趨勢。藍(lán)耳病弱毒苗免疫組的抗體水平在攻毒前的OD₄₅₀最高值為0.542。非重組腺病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組在攻毒前一直沒有檢測到抗體水平，但是在攻毒后臨死前能檢測到藍(lán)耳抗體水平。ELISA檢測藍(lán)耳病病毒抗體水平見圖2。

(3)攻毒后血液中豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒的檢測

攻毒后隔天采集的抗凝血，用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rAd-E2-CMV-GP5免疫組中有4/8頭能檢測出豬瘟病毒，豬瘟脾淋苗免疫組也有4/8能檢測出豬瘟病毒，而非重組腺病毒對(duì)照和空白對(duì)照都100％檢出，結(jié)果見表2。

表2 攻毒后血液中豬瘟病毒的檢測

同樣用RT-PCR方法檢測藍(lán)耳病病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)rAd-E2-CMV-GP5免疫組中有4/8頭能檢測出豬瘟病毒，豬瘟脾淋苗免疫組也有4/8能檢測出豬瘟病毒，而非重組腺病毒對(duì)照和空白對(duì)照都100％檢出，但持續(xù)的時(shí)間要長于豬瘟病毒在血液中的存在時(shí)間，結(jié)果見表3。

表3 攻毒后血液中藍(lán)耳病病毒的檢測

(4)攻毒后組織臟器的病理觀察

非重組腺病毒和空白對(duì)照組死亡豬的剖檢結(jié)果顯示，豬下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)，腎臟、脾臟、膀胱以及心臟均有明顯的出血現(xiàn)象。

rAd-E2-CMV-GP5免疫組和常規(guī)疫苗免疫組所有存活豬的剖檢結(jié)果表明，盡管臨床癥狀已經(jīng)消失，但是某些臟器還存在一些病理變化。rAd-E2-CMV-GP5免疫組7頭存活豬中，1頭下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)出血，1頭腸系膜淋巴結(jié)和腎臟出血。豬瘟脾淋苗免疫組7頭存活豬中，1頭下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和膀胱有出血，1頭腎 臟和膀胱有出血。

綜上所述，本發(fā)明采用ELISA方法檢測了免疫豬的體液免疫水平。重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5和常規(guī)疫苗免疫豬后都能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，這表明本試驗(yàn)構(gòu)建的重組腺病毒接種豬體后，在宿主細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的蛋白具有較好的免疫原性。常規(guī)疫苗接種豬體后誘導(dǎo)的抗體水平略高于重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5誘導(dǎo)的抗體水平，這可能是因?yàn)楸M管重組腺病毒rAd-E2-CMV-GP5在機(jī)體內(nèi)僅表達(dá)了兩種主要的保護(hù)性蛋白，其形成的抗原位點(diǎn)較常規(guī)全病毒疫苗少的緣故。但是，當(dāng)用致死量的強(qiáng)毒攻擊時(shí)，rAd-E2-CMV-GP5免疫組和常規(guī)疫苗免疫組都提供了87.5％的保護(hù)率，可見抗體水平的高低并不是評(píng)價(jià)機(jī)體能否抵抗強(qiáng)毒攻擊的惟一指標(biāo)，出現(xiàn)這一結(jié)果可能是因?yàn)榻臃N重組腺病毒激發(fā)了機(jī)體其他的免疫機(jī)制(例如細(xì)胞免疫)，而抵抗了強(qiáng)毒的攻擊。非重組腺病毒免疫組和空白對(duì)照組全部死亡。

從攻毒后表現(xiàn)的臨床癥狀來看，rAd-E2-CMV-GP5免疫組和常規(guī)疫苗免疫組均有臨床癥狀，rAd-E2-CMV-GP5免疫組有3/8頭出現(xiàn)，而常規(guī)疫苗免疫組有4/8頭出現(xiàn)臨床癥狀，就其原因可能是由于常規(guī)的弱毒苗接種豬體后會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激的原因。

從攻毒后的血毒檢測來看，rAd-E2-CMV-GP5免疫組和常規(guī)疫苗免疫組之間沒有差別，均有4/8頭的檢出率。

從上述的結(jié)果可以看出，本發(fā)明能有效的預(yù)防豬瘟和藍(lán)耳病的發(fā)生，和常規(guī)疫苗相提供相同的保護(hù)率，大量節(jié)約了人工和成本。