本發(fā)明涉及白樺BpSPL9基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)也稱反式作用因子，是指那些具有同真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，或是結(jié)合已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子，具有激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的功能。高等植物中的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量大、種類多且轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為復(fù)雜，轉(zhuǎn)錄因子的研究日益受到人們的廣泛關(guān)注。目前相繼從高等植物中分離出了大量調(diào)控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)及生長發(fā)育等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

典型的植物轉(zhuǎn)錄因子一般包含有4個功能區(qū)，即DNA結(jié)合域(DNA-bindingdomain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域(transcription regulation domain)包括激活和抑制域、寡聚化位點(oligomerization site)以及核定位信號(nuclear localization signal)。但不同的轉(zhuǎn)錄因子可能缺少某一功能區(qū)，如特異的DNA結(jié)合域或轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，轉(zhuǎn)錄因子通過這些功能區(qū)域，在特定的時間進入細胞核內(nèi)與啟動子順式作用元件或與其他轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)域相互作用來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達。

近年來生物技術(shù)的發(fā)展以及分子育種研究的興起，為利用基因工程手段改良林木、加速林木新品種的選育奠定基礎(chǔ)。白樺是我國東北與內(nèi)蒙古地區(qū)重要的造林樹種，是優(yōu)良的短周期闊用材樹種，傳統(tǒng)的育種手段難以在短期內(nèi)實現(xiàn)林木性狀改良的需求，通過轉(zhuǎn)基因手段對其進行遺傳改良具有很大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種白樺基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

本發(fā)明白樺BpSPL9基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明編碼白樺BpSPL9基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明白樺BpSPL9基因的應(yīng)用是指在增強植物的抗逆境脅迫能力上的應(yīng)用。

本發(fā)明公開了白樺BpSPL9基因及其編碼蛋白和應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建一種含有BpSPL9基因的植物表達載體，該載體使用了花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子，并加入了選擇性標(biāo)記卡那霉素。利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，進行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化，并對獲得的轉(zhuǎn)基因白樺株系進行了耐鹽性和抗旱性分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在受到1.0％NaCl和15％PEG脅迫12h、24h后，這兩種酶的活性均明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨砻靼讟錌pSPL9基因能夠正向調(diào)控植物體內(nèi)的SOD活性和POD活性，從而增強植物的抗逆境脅迫能力，測定的H₂O₂含量中，脅迫處理12h、24h后測定的轉(zhuǎn)基因株系中H₂O₂含量比非轉(zhuǎn)基因株系H₂O₂含量減少，說明白樺BpSPL9基因能夠提高白樺的抗鹽、耐旱能力。

附圖說明

圖1為BpSPL9基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜；

圖2為BpSPL9基因TOPO反應(yīng)后菌液PCR檢測電泳圖譜；

圖3為BpSPL9基因LR反應(yīng)后菌液PCR檢測電泳圖譜；

圖4為BpSPL9基因電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后菌液PCR檢測電泳圖譜；

圖5為BpSPL9基因電擊農(nóng)桿菌后引物配對組合PCR檢測電泳圖譜；

圖6為轉(zhuǎn)BpSPL9基因植株的PCR檢測電泳圖譜；

圖7為轉(zhuǎn)BpSPL9基因在白樺不同株系中的表達分析圖；

圖8為1.0％NaCl和15％PEG脅迫處理不同時間不同株系的DAB和NBT染色結(jié)果；其中a為1.0％NaCl脅迫處理部分，b為15％PEG脅迫處理部分；

圖9為1.0％NaCl脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15；

圖10為1.0％NaCl脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的POD活性測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15；

圖11為1.0％NaCl脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15；

圖12為15％PEG脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15；

圖13為15％PEG脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的POD活性測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15；

圖14為15％PEG脅迫處理下白樺轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量測定圖；其中a為NT，b為Ox4，c為Ox15。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式白樺BpSPL9基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

本實施方式公開了白樺BpSPL9基因及其編碼蛋白和應(yīng)用，本實施方式構(gòu)建一種含有BpSPL9基因的植物表達載體，該載體使用了花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子，并加入了選擇性標(biāo)記卡那霉素。利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，進行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化，并對獲得的轉(zhuǎn)基因白樺株系進行了耐鹽性和抗旱性分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在受到1.0％NaCl和15％PEG脅迫12h、24h后，這兩種酶的活性均明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨砻靼讟錌pSPL9基因能夠正向調(diào)控植物體內(nèi)的SOD活性和POD活性，從而增強植物的抗逆境脅迫能力，測定的H₂O₂含量中，脅迫處理12h、24h后測定的轉(zhuǎn)基因株系中H₂O₂含量比非轉(zhuǎn)基因株系H₂O₂含量減少，說明白樺BpSPL9基因能夠提高白樺的抗鹽、耐旱能力。

具體實施方式二：本實施方式編碼白樺BpSPL9基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

具體實施方式三：本實施方式白樺BpSPL9基因的應(yīng)用是指在增強植物的抗逆境脅迫能力上的應(yīng)用。

實施例1、白樺BpSPL9基因的獲得以及pGWB5-BpSPL9重組表達載體的構(gòu)建

1.1目的基因序列的獲得

1.1.1基因的克隆及測序

以10年野生白樺為材料，取其雄花，提取RNA，RNA的提取按照通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)的方法進行。使用TOYOBO的ReverTraqPCR RT Master Mix withgDNA Remover試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以白樺cDNA為模板進行擴增，擴增得到的產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳檢測結(jié)果見圖1。TIANGEN凝膠回收試劑盒回收純化擴增產(chǎn)物，進行TA克隆后測序，測序結(jié)果表明白樺BpSPL9基因具有序列表中SEQ IDNO：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：1由1140個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至1140位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。PCR擴增體系如表1所示。

表1 PCR擴增體系

1.1.2目的片段純化及與pBackZero-T Vector載體的連接：

將PCR擴增獲得的BpSPL9目的片段進行凝膠純化回收，進行目的片段與pBackZero-T Vector連接，反應(yīng)體系如表2所示，16℃反應(yīng)過夜。

表2目的片段與pBackZero-T Vector連接反應(yīng)體系

1.1.3轉(zhuǎn)化大腸桿菌及陽性克隆的鑒定：

連接產(chǎn)物5μL加入50μL大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，含有氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選陽性單菌落，進行陽性克隆的鑒定。

1.2白樺BpSPL9基因表達特性分析

Real-time PCR分析白樺BpSPL9在不同部位不同時期的表達量

以野生熟齡白樺6月5日、6月20日、7月5日、7月20日、8月5日、8月20日、9月5日和9月20日的葉、芽、莖、雄花和經(jīng)歷越冬后4月5日、4月10日和4月15日雄花和雌花的cDNA為模板，進行實時定量PCR擴增，檢測白樺BpSPL9基因的表達情況，選用18SrRNA作為內(nèi)參基因，所有試樣進行三次獨立的生物學(xué)重復(fù)，采用–ΔΔCt方法進行基因的相對定量分析。根據(jù)BpSPL9特異序列設(shè)計上下游定量引物，本研究選用的內(nèi)參基因及其引物序列見表3。

表3白樺BpSPL9定量PCR引物序列

實時定量PCR試劑盒為PremixExTaq^TMⅡ(Perfect Real Time)，反應(yīng)體系為：PremixExTaq^TMⅡ(2×)10μL，引物各0.8μL(10μmol/L)，水6μL，模板2μL，Rox DyeⅡ0.4μL，循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火延伸34s，循環(huán)40次，繪制溶解曲線，溫度由95℃15s，60℃1min，至95℃15s止。以上反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上完成。

在葉片中，BpSPL9在6月20日和9月5日表達顯著下調(diào)，下調(diào)2⁵-2⁹倍，其中9月5日表達水平達到最低峰，其他時間點變化不顯著；頂芽中，BpSPL9在7月5日和8月20日至9月20日顯著上調(diào)表達，上調(diào)2⁵-2⁷倍，7月20日和8月5日下調(diào)表達；莖中，BpSPL9整體呈現(xiàn)出表達下調(diào)的趨勢，7月5日至8月5日和9月5日、9月20日表達顯著下調(diào)，下調(diào)2³-2⁹倍，其中7月20日的表達量達到最低峰；雄花序中，BpSPL9在6月20日至9月5日均顯著上調(diào)，上調(diào)2³-2⁶倍，而在第二年4月份的發(fā)育時期表達水平相對較低，均為下調(diào)表達；雌花序中，BpSPL9在4月10日和4月15日均上調(diào)表達。BpSPL9基因在所選取的組織部位中大部分都有表達，在整個的生長階段，BpSPL9的表達水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，花芽形成之前到達最高水平。

1.3植物表達載體pGWB5-BpSPL9的構(gòu)建

1.3.1TOPO反應(yīng)

按照TOPO試劑盒的說明書操作進行反應(yīng)。隨后將反應(yīng)物放置冰上，進行轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在50mg/L卡那霉素的選擇性LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取陽性單克隆于LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。以裂解后的菌液為模板進行PCR檢測，反應(yīng)體系為20μL，94℃預(yù)變性3min后，進行PCR循環(huán)：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸7min。1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳檢測結(jié)果見圖2，鑒定陽性單克隆。

1.3.2LR反應(yīng)

按照LR Clonase^TMII Enzyme Mix的說明書進行LR反應(yīng)，取5μL LR反應(yīng)產(chǎn)物加入DH5α感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化。

PCR鑒定陽性克隆，反應(yīng)體系為20μL，94℃預(yù)變性3min后，進行PCR循環(huán)：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸7min。1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳檢測結(jié)果見圖3，初步鑒定為陽性的單克隆用于后續(xù)實驗。

1.3.3電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將重組質(zhì)粒pGWB5-BpSPL9通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中。在固體LB(含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)培養(yǎng)基上篩選，獲得帶有重組質(zhì)粒并具有卡那霉素抗性和利福平抗性的根瘤農(nóng)桿菌，對其進行PCR鑒定，反應(yīng)體系為20μL，94℃預(yù)變性3min后，進行PCR循環(huán)：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果為圖4所示，檢測為陽性的單克隆作為侵染植物用的工程菌保存。

同時利用基因上下游引物和pGWB5載體上下游引物組合配對，檢測電擊后獲得的陽性單克隆，以裂解后的菌液作為模板，進行PCR檢測，在濃度為1％的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。電泳檢測結(jié)果如圖5所示。

實施例2、pGWB5-BpSPL9重組表達載體對白樺的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化。首先活化已保存好的工程菌，加入含有卡那霉素和潮霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜，次日取已搖好的菌液，按照2-5％的比例加入新鮮的無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃搖菌4-6h，OD₆₀₀控制在0.2-0.4之間，作為侵染用的工程菌液。

選取健康，生長狀態(tài)良好的外植體，取其頂端以下第3-4片葉子，在距葉柄基部0.3cm附近(即主葉脈分叉處)進行切割。白樺的侵染時間一般控制在3-5min之間，將切割的葉片浸泡在菌液中，期間搖晃數(shù)次，使葉片與菌液充分接觸，隨后將其取出放置在無菌紙中，吸除多余的菌液。

放置在含有0.8mg/L 6-BA、0.02mg/L NAA和0.5mg/LGA₃的WPM培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，暗處培養(yǎng)2-3d，期間更換一次培養(yǎng)基。隨后轉(zhuǎn)入含有50mg/L的卡那霉素的WPM選擇培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，視農(nóng)桿菌生長情況進行脫菌并更換新的選擇培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)15-20d后，在切割的傷口處可以觀察到有膨大的愈傷長出，待愈傷長到一定大小，即可用鑷子或刀片將其取下，進行再分化繼代培養(yǎng)。

實施例3、轉(zhuǎn)基因白樺中BpSPL9基因的分子鑒定

3.1轉(zhuǎn)BpSPL9基因植株的PCR檢測

將獲得的18個轉(zhuǎn)基因株系提取DNA，經(jīng)PCR檢測，PCR反應(yīng)體系為20μL，94℃預(yù)變性5min后，進行PCR循環(huán)：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸7min。證實BpSPL9基因已經(jīng)成功整合到了白樺的基因組上。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果顯示：目的基因BpSPL9在這18個轉(zhuǎn)化子中都能夠檢測出來，同時非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?NT)中未檢測到，且目的條帶位置與陽性對照的位置一致，從而證明已成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，檢測結(jié)果如圖6所示。

3.2轉(zhuǎn)基因白樺中BpSPL9基因的表達分析

為了探明BpSPL9基因在轉(zhuǎn)基因白樺中的表達情況，對其18個轉(zhuǎn)基因株系(Ox1-Ox18)和1個非轉(zhuǎn)基因株系(NT)進行了總RNA提取，根據(jù)TOYOBO的ReverTraqPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的說明書進行反轉(zhuǎn)錄。選取非轉(zhuǎn)基因株系(NT)作為對照，將18個不同轉(zhuǎn)基因株系的表達情況分為3組，即：高表達、中表達和低表達，按照–ΔΔCt計算基因的相對表達量，相對表達量在2⁶-2⁹之間的劃分高表達組，2⁴-2⁵間劃分為中表達組，2¹-2³之間的則歸為低表達組，由圖7可見，Ox1、Ox2、Ox4、Ox6、Ox7、Ox8、Ox9和Ox17為高表達組，Ox10-14為中表達組，Ox3、Ox5、Ox15、Ox16和Ox18為低表達組，由此可知，同一基因的不同轉(zhuǎn)化子株系中基因的表達差異顯著，最高表達的Ox4號轉(zhuǎn)化子株系的最大值為2⁹，最低表達水平的Ox15號轉(zhuǎn)化子株系只有2¹，表達量最高的是表達量最低的株系的2⁸倍。

實施例4、轉(zhuǎn)BpSPL9基因白樺的抗逆性分析

4.1轉(zhuǎn)基因白樺離體葉片的脅迫處理

為了檢測白樺BpSPL9基因在非生物脅迫下可能具有的作用，利用植物葉盤打孔器法進行取樣，選取健康狀態(tài)、葉片厚度及顏色一致的葉片，避開主葉脈選取兩側(cè)葉片，打取直徑為10mm的小葉盤。將選取的小葉盤進行1.0％的NaCl和15％的PEG脅迫處理，每一處理進行三次重復(fù)實驗，處理葉片放在含有NaCl和PEG的WPM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，定時觀察不同時間點離體葉片的狀態(tài)，以找出處理變化較大的時長作為處理時間，最終選取0h、12h和24h三個時間點。

4.2轉(zhuǎn)基因白樺離體葉片的染色分析

4.2.1DAB染色

配制1mg/mL的DAB染液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.8，使用時用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.8，現(xiàn)用現(xiàn)調(diào)。將處理的不同葉片分別置于50mL的玻璃三角瓶中，每瓶吸入同樣體積的DAB染液，保證每個小葉盤都能夠充分接觸到染液，且相互之間不重疊，室溫避光培養(yǎng)過夜。吸走DAB染液，加入95％的乙醇，水浴煮沸10min，至葉片綠色完全脫去，期間更換兩次脫色液，以保證脫色徹底，將脫好色的葉盤放置在無水乙醇中，掃描觀察結(jié)果。

4.2.2NBT染色

配制0.5mg/mL的NBT染液，現(xiàn)用現(xiàn)配，將處理的不同葉片置于放有相同體積染液的50mL玻璃三角瓶中，使每個小葉盤都能夠充分接觸到染液，且相互之間不重疊，28℃避光染色3h，吸去染液，加入80％的乙醇，水浴煮沸至葉片綠色完全脫去，期間更換兩次脫色液，以保證脫色徹底，將脫好色的葉盤放置在無水乙醇中，掃描觀察結(jié)果。

1.0％濃度的NaCl和15％濃度的PEG分別脅迫處理0h、12h、24h的小葉盤進行DAB和NBT染色，每個處理進行3次實驗重復(fù)，染色結(jié)果如圖8所示。

4.3非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺離體葉片的生理生化指標(biāo)測定

植物組織銅鋅-超氧化物歧化酶(Cu²⁺Zn²⁺-SOD)測定試劑盒、過氧化物酶(POD)測定試劑盒和過氧化氫(H₂O₂)測定試劑盒按照說明書進行相關(guān)操作。

4.3.1NaCl脅迫下白樺轉(zhuǎn)基因株系生理生化指標(biāo)的測定

4.3.1.1超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

在1.0％NaCl脅迫處理下，0h測定的三種株系的SOD活性存在著顯著的差異，其中15號轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性最高，可達906U/g濕片，最低的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗抵挥?40U/g濕片，可以看出不同株系間SOD活性的原初活性是不同的，這可能是由轉(zhuǎn)入基因之后所導(dǎo)致的；12h脅迫后測定的結(jié)果中，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性差異不顯著，二者SOD的活性高于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；隨著脅迫時間延長至24h，三種株系間又出現(xiàn)了顯著差異，從所觀察的3個時間點上可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性始終都要高于非轉(zhuǎn)基因株系的，其體內(nèi)的SOD活性較高，說明白樺BpSPL9基因能夠在一定程度上提高植物的抗逆性。結(jié)果如圖9所示。

4.3.1.2過氧化物酶(POD)活性的測定

在1.0％NaCl脅迫處理下，0h測定的三種株系的POD活性中，對照株系與4號轉(zhuǎn)基因株系間差異不顯著，與15號轉(zhuǎn)基因株系間差異顯著，可以看出不同株系間POD活性的原初活性有所不同；12h脅迫后測定的結(jié)果中，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的POD活性差異顯著，二者POD的活性高于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；隨著脅迫時間延長至24h，三種株系間又出現(xiàn)了顯著差異。從所觀察的12h和24h兩個時間點上可以看出，脅迫后的轉(zhuǎn)基因株系的POD活性始終都要高于非轉(zhuǎn)基因株系，其體內(nèi)的POD活性較高，說明白樺BpSPL9基因能夠調(diào)控植物體內(nèi)的POD活性，對于植物的抗逆起到重要的作用。結(jié)果如圖10所示。

4.3.1.3過氧化氫(H₂O₂)含量的測定

在1.0％NaCl脅迫處理下，0h測定的三種株系的H₂O₂含量中，對照株系與15號轉(zhuǎn)基因株系間差異不顯著，而4號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量最少，可以看出不同株系間H₂O₂含量的原初含量是有所不同的；12h脅迫后測定的結(jié)果中，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量差異不顯著，二者H₂O₂含量均低于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；隨著脅迫時間延長至24h，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量差異不顯著，二者H₂O₂含量均明顯低于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著。從所觀察的12h和24h兩個時間點上可以看出，脅迫后的轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量始終都要低于非轉(zhuǎn)基因株系，其體內(nèi)的H₂O₂含量較低，說明白樺BpSPL9基因能夠負向調(diào)控植物體內(nèi)的H₂O₂含量，從而對植物的抗逆起到重要的作用。結(jié)果如圖11所示。

4.4PEG脅迫下白樺轉(zhuǎn)基因株系生理生化指標(biāo)的測定

4.4.1超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

15％PEG脅迫處理下，0h測定的三種株系的SOD活性存在著顯著的差異，其中4號轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性最高，可達788U/g濕片，最低的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗抵挥?80U/g濕片，不同株系間SOD活性的原初活性不同；12h脅迫后測定的結(jié)果中，4號轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性明顯高于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；24h脅迫處理后，兩種轉(zhuǎn)基因株系間差異較小，且非轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性明顯低于兩個轉(zhuǎn)基因株系，從所觀察的3個時間點上也可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性始終都要高于非轉(zhuǎn)基因株系的，其體內(nèi)的SOD活性較高，說明白樺BpSPL9基因能夠調(diào)控植物體內(nèi)的SOD活性，對于植物的抗逆起到重要的作用。結(jié)果如圖12所示。

4.4.2過氧化物酶(POD)活性的測定

15％PEG脅迫處理下，0h測定的三種株系的POD活性差異不顯著，表明不同株系間POD活性的原初活性是相同的；12h脅迫后測定的結(jié)果中，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的POD活性明顯高于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；24h脅迫處理后，15號轉(zhuǎn)基因株系的POD活性高于4號轉(zhuǎn)基因株系高于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著。從所觀察的12h和24h兩個時間點上可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的POD活性始終都要高于非轉(zhuǎn)基因株系，植物體內(nèi)的POD活性高，說明白樺BpSPL9基因能夠調(diào)控植物體內(nèi)的POD活性，對于植物的抗逆起到重要的作用。結(jié)果如圖13所示。

4.4.3過氧化氫(H₂O₂)含量的測定

15％PEG脅迫處理下，0h測定的三種株系的H₂O₂含量中，對照株系與15號轉(zhuǎn)基因株系間差異不顯著，而4號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量較兩者略高，說明不同株系間H₂O₂含量的原初含量是有所不同的；12h脅迫后測定的結(jié)果中，非轉(zhuǎn)基因株系和15號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量差異不顯著，二者H₂O₂含量均高于4號轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著；隨著脅迫時間延長至24h，4號和15號轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量差異不顯著，二者H₂O₂含量均明顯低于非轉(zhuǎn)基因株系，且差異顯著。從所觀察的12h和24h兩個時間點上可以看出，脅迫后的轉(zhuǎn)基因株系的H₂O₂含量始終都要低于非轉(zhuǎn)基因株系，其體內(nèi)的H₂O₂含量較低，說明白樺BpSPL9基因能夠調(diào)控植物體內(nèi)的H₂O₂含量，從而對植物的抗逆起到重要的作用。結(jié)果如圖14所示。

實施列1-4中所用試劑盒和試劑皆為市售產(chǎn)品。

綜上所述，對脅迫處理后的葉片進行DAB和NBT染色，測定其體內(nèi)的SOD活性、POD活性和H₂O₂含量，結(jié)果表明：隨著脅迫時間的延長，不同株系間兩種染液的染色程度均加重，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗迪啾?，兩個BpSPL9基因過表達株系的染色較淺；SOD活性和POD活性的測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在受到1.0％NaCl和15％PEG脅迫12h、24h后，這兩種酶的活性均明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，表明白樺BpSPL9基因能夠正向調(diào)控植物體內(nèi)的SOD活性和POD活性，從而增強植物的抗逆境脅迫能力，測定的H₂O₂含量中，脅迫處理12h、24h后測定的轉(zhuǎn)基因株系中H₂O₂含量比非轉(zhuǎn)基因株系H₂O₂含量減少，說明白樺BpSPL9基因能夠提高白樺的抗鹽、耐旱能力。

序列表

<110> 東北林業(yè)大學(xué)

<120>白樺BpSPL9基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

<160> 8

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213>白樺（Betula platyphylla Suk.）

<400> 1

atgaaaatgg gttcgggttc tctggccgag tcaggagggt cctcttcttc gtccccgccc 60

atctcgtcct ccgagtcgct caacggcttg aaatttgggc ggaaaatcta ctttgaggat 120

gtgggtaccg gggctccgga caaaccgggt ggtgggtccg ggtcctcgtc ttctgtgtcc 180

accccgccga agaagacgag gggtggtggt gtggtgcagg ggggtcagcc acctcggtgt 240

caggttgagg ggtgtaagct agatctgagt gatgccaagg cttactattc caggcacaaa 300

gtctgtggca tgcattccaa gtcacctaag gtcattgttg ctggccttga gcagaggttt 360

tgtcaacagt gcagcagatt tcatcagctt ccagaatttg accaaggaaa acgaagttgt 420

cgtaggcgtc ttgctggtca taatgaacga aggaggaagc caccacctgg atcattattg 480

tcctcacgct atggccgatt ctcttcatct atctttgaaa acagcaccag aggagggttt 540

ctggtggact tttctacata cccaaggctt actgggaggg atgcatggcc atctacaaga 600

tcttctgagc aggtatctgg aaaccaaact accactgcgg cggcaaagta tcttccacat 660

ccatggcaaa gcaacactga aaatcctcca tctgaccttt atctgcaagg gtcagcaagt 720

gggactggtt atcccggtcc tggaattcct ccgggagaat gcttcacagg agtcattgac 780

tcaacttgtg ctctctctct tctgtcaaat caaacatggg gctccagaaa ccaagcatca 840

ggtcttgggg tgaagaacgt gatgaatgct gaaagggctc ctatggttca accaacagct 900

cctcatggtg cagttgttac tgaatttcca agcggctctt gggttttgaa gggcaatgag 960

gctggtagca gttcacatga cctgcccccc gatctgggtt tgggtcaatt ttctcagcct 1020

ctaaccagtc agttttctgg tgagcttggg ctgtctcaac agggtaggag gcaatacatg 1080

gaacttgggc actccagggc ttatgactcc tcccctcagc agatgcactg gtcactttga 1140

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213>白樺（Betula platyphylla Suk.）

<400> 2

Met Lys Met Gly Ser Gly Ser Leu Ala Glu Ser Gly Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Ser Ser Glu Ser Leu Asn Gly Leu

20 25 30

Lys Phe Gly Arg Lys Ile Tyr Phe Glu Asp Val Gly Thr Gly Ala

35 40 45

Pro Asp Lys Pro Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser

50 55 60

Thr Pro Pro Lys Lys Thr Arg Gly Gly Gly Val Val Gln Gly Gly

65 70 75

Gln Pro Pro Arg Cys Gln Val Glu Gly Cys Lys Leu Asp Leu Ser

80 85 90

Asp Ala Lys Ala Tyr Tyr Ser Arg His Lys Val Cys Gly Met His

95 100 105

Ser Lys Ser Pro Lys Val Ile Val Ala Gly Leu Glu Gln Arg Phe

110 115 120

Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Gln Leu Pro Glu Phe Asp Gln

125 130 135

Gly Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu Ala Gly His Asn Glu Arg

140 145 150

Arg Arg Lys Pro Pro Pro Gly Ser Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly

155 160 165

Arg Phe Ser Ser Ser Ile Phe Glu Asn Ser Thr Arg Gly Gly Phe

170 175 180

Leu Val Asp Phe Ser Thr Tyr Pro Arg Leu Thr Gly Arg Asp Ala

185 190 195

Trp Pro Ser Thr Arg Ser Ser Glu Gln Val Ser Gly Asn Gln Thr

200 205 210

Thr Thr Ala Ala Ala Lys Tyr Leu Pro His Pro Trp Gln Ser Asn

215 220 225

Thr Glu Asn Pro Pro Ser Asp Leu Tyr Leu Gln Gly Ser Ala Ser

230 235 240

Gly Thr Gly Tyr Pro Gly Pro Gly Ile Pro Pro Gly Glu Cys Phe

245 250 255

Thr Gly Val Ile Asp Ser Thr Cys Ala Leu Ser Leu Leu Ser Asn

260 265 270

Gln Thr Trp Gly Ser Arg Asn Gln Ala Ser Gly Leu Gly Val Lys

275 280 285

Asn Val Met Asn Ala Glu Arg Ala Pro Met Val Gln Pro Thr Ala

290 295 300

Pro His Gly Ala Val Val Thr Glu Phe Pro Ser Gly Ser Trp Val

305 310 315

Leu Lys Gly Asn Glu Ala Gly Ser Ser Ser His Asp Leu Pro Pro

320 325 330

Asp Leu Gly Leu Gly Gln Phe Ser Gln Pro Leu Thr Ser Gln Phe

335 340 345

Ser Gly Glu Leu Gly Leu Ser Gln Gln Gly Arg Arg Gln Tyr Met

350 355 360

Glu Leu Gly His Ser Arg Ala Tyr Asp Ser Ser Pro Gln Gln Met

365 370 375

His Trp Ser Leu

379

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物BpSPL9-F的核苷酸序列。

<400> 3

caccatgaaa atgggttcgg gttc 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物BpSPL9-R的核苷酸序列。

<400> 4

aagtgaccag tgcatctgc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物qSPL-1的核苷酸序列。

<400> 5

ggtcctcgtc ttctgtgtcc 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物qSPL-2的核苷酸序列。

<400> 6

cgttcattat gaccagcaag acg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物18s-S的核苷酸序列。

<400> 7

atcttgggtt gggcagatcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物18s-A的核苷酸序列。

<400> 8

cattactccg atcccgaagg 20