本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化的培養(yǎng)基及方法。

背景技術(shù)：

在我國(guó)每年近28萬(wàn)人死于肝硬化、肝癌等肝臟相關(guān)疾病。目前對(duì)晚期肝病的臨床治療尚無(wú)特效療法和技術(shù)手段，原位肝移植是公認(rèn)的治療晚期肝病的有效治療方法。但是，由于肝源短缺，手術(shù)費(fèi)用昂貴，操作要求高，術(shù)后免疫反應(yīng)等原因，肝移植治療遇到了瓶頸問(wèn)題。

干細(xì)胞移植治療就是試圖緩解肝源短缺的問(wèn)題。目前，利用干細(xì)胞移植在肝病的治療中取得了一定的成果，潘興南、何金秋和mehdimohamadnejad等人利用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療肝硬化等終末期肝病取得一定的療效；此外還有干細(xì)胞成功治療骨頭壞死、眼疾、耳聾，心臟、血管、肌肉損傷上治療的報(bào)道。但是，干細(xì)胞治療的應(yīng)用還存在一些難題，比如，臨床研究種子細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓或臍血，其來(lái)源相對(duì)局限，獲取的細(xì)胞數(shù)量較低，且誘導(dǎo)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程十分復(fù)雜，效率較低；其次，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量在較高程度上影響著治療的效果；且有研究顯示，骨髓干細(xì)胞移植之后，會(huì)明顯增加受損肝臟內(nèi)星狀細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量，這說(shuō)明骨髓干細(xì)胞移植很大程度上會(huì)加速，而不是改善肝纖維化的進(jìn)展。

另外，本領(lǐng)域當(dāng)前研究的方向主要集中在將干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞，或者不進(jìn)行分化，直接用干細(xì)胞移植后令其在肝內(nèi)自發(fā)分化而起作用；也有研究者將干細(xì)胞分化成膽管上皮樣細(xì)胞。不過(guò)該方法有幾大缺點(diǎn)，包括分化后僅為肝細(xì)胞一種細(xì)胞類型、注射細(xì)胞僅為2d細(xì)胞懸液、治療效率低和移植后成瘤性等問(wèn)題?，F(xiàn)在有研究創(chuàng)造性地將肝細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，提示多種相關(guān)細(xì)胞的混合培養(yǎng)更有利于3d器官芽的形成。但是，雖然肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟細(xì)胞的最重要的細(xì)胞類型，在肝臟的生理、病理進(jìn)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，但目前還沒(méi)有很成熟、簡(jiǎn)單且高效的將干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成這兩種細(xì)胞的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化的培養(yǎng)基及方法，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法能夠?qū)⒅鹃g充質(zhì)干細(xì)胞在體外直接同時(shí)誘導(dǎo)分化成為肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞，操作更加簡(jiǎn)單。

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白20ng/ml～80ng/ml、activina蛋白50ng/ml～100ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml～200μl/ml。

本發(fā)明中，將該培養(yǎng)基標(biāo)記為培養(yǎng)基a。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白20ng/ml、activina蛋白100ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白20ng/ml、activina蛋白100ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs200μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白80ng/ml、activina蛋白50ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白80ng/ml、activina蛋白50ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs200μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白40ng/ml、activina蛋白75ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基a包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和wnt3a蛋白40ng/ml、activina蛋白75ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs200μl/ml。

培養(yǎng)基a中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基a在誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化中的應(yīng)用。所述的脂肪間充質(zhì)為人間充質(zhì)干細(xì)胞。

wnt3a蛋白是包含328個(gè)氨基酸殘基的單鏈蛋白質(zhì)，是wnt1家族成員，參與經(jīng)典的wnt信號(hào)通路。wnt3a蛋白作為一種干細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子，其在信號(hào)表達(dá)、胚胎成長(zhǎng)、干細(xì)胞生長(zhǎng)分化和成體組織維護(hù)方面起關(guān)鍵作用。本發(fā)明采用的wnt3a蛋白是重組人類wnt3a蛋白。

activina蛋白是一種激活素(activins)，activina是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)β家族的一種分泌蛋白，可控制胚胎軸發(fā)育為有功能的前腸源性組織，調(diào)解多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。本發(fā)明采用的activina蛋白為重組人類activina蛋白。

本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和bfgf蛋白2.5ng/ml～10ng/ml、bmp4蛋白10ng/ml～50ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

本發(fā)明中，將該培養(yǎng)基標(biāo)記為培養(yǎng)基b。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基b包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和bfgf蛋白2.5ng/ml、bmp4蛋白50ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基b包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和bfgf蛋白10ng/ml、bmp4蛋白10ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基b包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和bfgf蛋白5ng/ml、bmp4蛋白25ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

培養(yǎng)基b中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基b在誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化中的應(yīng)用。

bfgf蛋白，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是重要的促有絲分裂因子，也是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子。本發(fā)明采用的bfgf蛋白為重組人類bfgf蛋白。

bmp4蛋白，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4，又名骨成型蛋白4，具有促進(jìn)動(dòng)物軟骨形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及遷移的多種功能。本發(fā)明采用的bmp4蛋白為重組人類bmp4蛋白。

一種培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和afgf蛋白10ng/ml～50ng/ml、fgf4蛋白2.5ng/ml～10ng/ml、fgf8b蛋白10ng/ml～40ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

本發(fā)明中，將該培養(yǎng)基標(biāo)記為培養(yǎng)基c。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基c包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和afgf蛋白50ng/ml、fgf4蛋白2.5ng/ml、fgf8b蛋白40ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基c包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和afgf蛋白10ng/ml、fgf4蛋白10ng/ml、fgf8b蛋白10ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基c包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和afgf蛋白25ng/ml、fgf4蛋白5ng/ml、fgf8b蛋白20ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

培養(yǎng)基c中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基c在誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化中的應(yīng)用。

afgf蛋白，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，由147個(gè)氨基酸組成，分子量為15.3kd的活性多肽，對(duì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的代謝和膠原蛋白的形成發(fā)揮著重要功能。本發(fā)明采用的afgf蛋白為重組人類afgf蛋白。

fgf4蛋白，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4，能夠顯著促進(jìn)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)干細(xì)胞向韌帶或肌腱方向分化。本發(fā)明采用的fgf4蛋白為重組人類fgf4蛋白。

fgf8b蛋白，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b，能夠接到胚胎上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。本發(fā)明采用的fgf8b蛋白為重組人類fgf8b蛋白。

一種培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和hgf蛋白5ng/ml～20ng/ml、follistatin蛋白25ng/ml～75ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

本發(fā)明中，將該培養(yǎng)基標(biāo)記為培養(yǎng)基d。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基d包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和hgf蛋白5ng/ml、follistatin蛋白75ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基d包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和hgf蛋白20ng/ml、follistatin蛋白25ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基d包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和hgf蛋白10ng/ml、follistatin蛋白50ng/ml、地塞米松1μmol/l、its2.5μl/ml和fbs50μl/ml。

培養(yǎng)基d中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基d在誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化中的應(yīng)用。

hgf蛋白，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是重要的抗纖維化因子，能修復(fù)受損肺組織，是重要的保護(hù)性因子。本發(fā)明采用的hgf蛋白為重組人類hgf蛋白。

follistatin蛋白，卵泡抑素，又名fsh抑制蛋白，是一種單鏈糖蛋白，可以通過(guò)activin/fsp系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的生殖活動(dòng)。本發(fā)明采用的follistatin蛋白為重組人類follistatin蛋白。

本發(fā)明的培養(yǎng)基a～d中，含有地塞米松、its、fbs。地塞米松又叫德沙美松、氟甲強(qiáng)的松龍，是抗炎、抗過(guò)敏藥物。fbs是胎牛血清(fetalbovineserum)，its是指insulin-transferrin-selenium，是胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的混合物，本發(fā)明采用的是its的市售商品，其規(guī)格是100×，含有胰島素1g/l，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.55g/l，硒0.00067g/l。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中its被稀釋至0.25×。基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)基，適用于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞的分化。以本發(fā)明提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，分化的過(guò)程更加簡(jiǎn)單，操作容易，且同時(shí)得到兩種細(xì)胞類型，相比起每一種都去耗時(shí)耗力分化，更加經(jīng)濟(jì)省力。此外，同時(shí)分化之后的分離措施簡(jiǎn)單，用流式細(xì)胞儀即可輕松完成，能兼容下游多種臨床和基礎(chǔ)研究的需要。

本發(fā)明提供了誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化的方法，其特征在于，包括：

第0天～第6天，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基a培養(yǎng)；

第7天～第10天，以培養(yǎng)基b培養(yǎng)；

第11天～第14天，以培養(yǎng)基c培養(yǎng)；

第15天～第28天，以培養(yǎng)基d培養(yǎng)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方式可采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法自行分離獲得，也可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買獲得。本發(fā)明對(duì)此不作限定。在進(jìn)行誘導(dǎo)前，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)的步驟。

所述復(fù)蘇是指，將液氮中凍存的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其恢復(fù)活性的操作，具體步驟包括：

從液氮中取出人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，37℃水浴溶解；

將溶解的細(xì)胞以dmem/f12完全培養(yǎng)液(包含10％fbs，不包括雙抗)重選后，1000rpm離心5min；棄掉上清；

細(xì)胞沉淀再次以dmem/f12完全培養(yǎng)液(包含10％fbs，不包括雙抗)重懸后進(jìn)行培養(yǎng)；

培養(yǎng)1天后，棄除培養(yǎng)上清液，加入新鮮的dmem/f12完全培養(yǎng)液(包含10％fbs，不包括雙抗)繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)到80％～90％密度(confluence)時(shí)，傳代。

所述傳代的具體步驟包括：

復(fù)蘇后，細(xì)胞長(zhǎng)到80％～90％密度(confluence)時(shí)，吸掉培養(yǎng)上清液，加入2ml無(wú)菌pbs洗滌一遍，然后加入1ml已經(jīng)預(yù)熱的胰酶(濃度0.25％)消化，待到細(xì)胞80％變圓時(shí)加入2mldmem/f12完全培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至干凈的15ml離心管，1000rpm離心5min；棄掉上清，加入1mldmem/f12完全培養(yǎng)液重懸，用移液器吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，培養(yǎng)、傳代。

本發(fā)明實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選為第4代細(xì)胞。

一些實(shí)施例中，

第0天～第2天，培養(yǎng)基a中fbs的濃度為200μl/ml；

第3天～第6天，培養(yǎng)基a中fbs的濃度為50μl/ml。

第0天培養(yǎng)細(xì)胞的接種濃度為10⁵個(gè)/ml。培養(yǎng)采用12孔板，每孔500μl。

一些實(shí)施例中，第7天、第11天、第15天更換培養(yǎng)基前，細(xì)胞經(jīng)無(wú)菌pbs清洗。清洗的次數(shù)為1～2次。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)的條件為：37℃，5％co2，每天更換60v％的新鮮培養(yǎng)基。

一些實(shí)施例中，培養(yǎng)的容器不以matigel包被。

matigel是一種基底膠，現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為脂肪干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化應(yīng)對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行matigel包被或鋪板。但本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，不以matigel包被或鋪板，同樣能夠獲得良好的分化效果，甚至不包被matigel的實(shí)驗(yàn)組中，分化的效果還優(yōu)于包被的實(shí)驗(yàn)組。所述培養(yǎng)的容器為12孔板。

整個(gè)誘導(dǎo)的時(shí)間為28天。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞歷經(jīng)28天的分化誘導(dǎo)，成功轉(zhuǎn)化為肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)流程如圖1。

肝內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞群，在調(diào)節(jié)肝竇血流與周圍組織的物質(zhì)交換中起有效的中樞性的作用，同時(shí)參與多種肝臟的生理病理過(guò)程。肝星狀細(xì)胞是肝臟分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，具有儲(chǔ)脂和儲(chǔ)存維生素a的功能，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在第1天時(shí)，用于分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈短梭形，和對(duì)照組(進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)細(xì)胞形態(tài)并無(wú)二致。分化至第3天時(shí)，分化組與對(duì)照組在形態(tài)上仍然還沒(méi)有區(qū)別。直到分化至第9天時(shí)，分化組的細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始向中央靠攏，出現(xiàn)體積相對(duì)較大的多邊形或星形形態(tài)貼壁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多大小不一的脂滴。該現(xiàn)象到了第23天，也就是誘導(dǎo)分化基本完成的階段，在誘導(dǎo)分化組表現(xiàn)得更為明顯，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)這種情況，一直保持間充質(zhì)干細(xì)胞較為明顯的形態(tài)特征。誘導(dǎo)分化后，對(duì)細(xì)胞的性質(zhì)和功能進(jìn)行檢測(cè)，表明所得細(xì)胞的功能良好，表現(xiàn)出顯著的星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞特性。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠?qū)⒅鹃g充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)同時(shí)分化成為星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，干細(xì)胞來(lái)源廣泛。以本發(fā)明提供培養(yǎng)基對(duì)脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效果要顯著優(yōu)于對(duì)照試驗(yàn)，且分化而來(lái)的兩種細(xì)胞都具備其典型功能和表達(dá)關(guān)鍵基因。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化23天后，有9.6％的細(xì)胞分化為肝星狀細(xì)胞類似的細(xì)胞，有14.3％的細(xì)胞成為人類肝內(nèi)皮細(xì)胞類似的細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1示實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)流程；

圖2示誘導(dǎo)的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)的變化；

圖3示脂肪干細(xì)胞分化星狀細(xì)胞儲(chǔ)存維生素a之后的自發(fā)熒光；

圖4示脂肪干細(xì)胞分化肝內(nèi)皮細(xì)胞孵育ve-cadherin后的免疫熒光。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了提供脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)分化的培養(yǎng)基及方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。

本發(fā)明中英文縮寫(xiě)與中文對(duì)照如下：

wnt3awnt信號(hào)蛋白3a

activina激活素a

its胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒

fbs胎牛血清

bfgf堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

bmp4骨形態(tài)發(fā)生蛋白4

afgf酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

fgf4成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4

fgf8b成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b

hgf肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子

follistatin卵泡抑素

matigel基底膠

ve-cadherin血管內(nèi)皮粘鈣素

pparg過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體gamma

alcam激活性白細(xì)胞黏附分子，又稱cd166

crbp1細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白1

timp1基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1

lox賴氨酰氧化酶

vcam-1血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1

mrc-1甘露糖受體c1

cd31b血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1

復(fù)蘇：從液氮中取出一支凍存的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞來(lái)源，深圳市第三人民醫(yī)院外科抽脂手術(shù)獲得的成年婦女腹部脂肪組織)，在37℃水浴中快速搖晃溶解，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的15ml離心管，加入1mldmem/f12完全培養(yǎng)液(包含10％fbs，不包括雙抗)，1000rpm離心5min；棄掉上清，加入1ml前述dmem/f12完全培養(yǎng)液重懸，用移液器吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。第二天吸掉dmem/f12完全培養(yǎng)液，加入3ml新鮮前述dmem/f12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)：細(xì)胞長(zhǎng)到80％～90％密度(confluence)時(shí)，吸掉dmem/f12完全培養(yǎng)液，加入2ml無(wú)菌pbs洗滌一遍，然后加入1ml已經(jīng)預(yù)熱的胰酶消化，待到細(xì)胞80％變圓時(shí)加入2mldmem/f12完全培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至干凈的15ml離心管，1000rpm離心5min；棄掉上清，加入1mldmem/f12完全培養(yǎng)液重懸，用移液器吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞懸液平均轉(zhuǎn)移至兩個(gè)或三個(gè)6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表1：

表1培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(不以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

實(shí)施例2

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表2

表2培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(不以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

實(shí)施例3

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表3

表3培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(不以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

對(duì)比例1

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表4：

表4培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(不以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

對(duì)比例2

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表5：

表5培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

對(duì)比例3

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表6

表6培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

對(duì)比例4

以實(shí)施例1傳代獲得的第4代脂肪干細(xì)胞作為分化起點(diǎn)，誘導(dǎo)分化：培養(yǎng)基如表7：

表7培養(yǎng)基配方

1)day0～6：常規(guī)培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，待第4細(xì)胞長(zhǎng)到80％-90％密度時(shí)，按照常規(guī)傳代培養(yǎng)操作。用培養(yǎng)基a重懸細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/ml加入12孔板(不以matigel包被)，500ul/孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用dmem/f12完全培養(yǎng)液(fbs)重懸。置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2)day7～10：在day7用無(wú)菌pbs洗細(xì)胞1～2次，整體換新的培養(yǎng)基b，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day7～10每天換60％該分化培養(yǎng)基。

3)day11～14：在day11用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基c，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day11～14每天換60％該分化培養(yǎng)基。

4)day15～28：在day15用無(wú)菌pbs洗1～2次，整體換新的培養(yǎng)基d，然后在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；day15～28每天換60％分化培養(yǎng)基。

實(shí)施例4

對(duì)實(shí)施例1～3和對(duì)比例1～4誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1、形態(tài)學(xué)分析

根據(jù)不同程度分化的細(xì)胞與未分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變和特征，如大小，細(xì)胞器分布復(fù)雜性等，在關(guān)鍵天時(shí)在倒置顯微鏡/熒光顯微鏡下觀察、拍照、記錄。

實(shí)施例和對(duì)比例誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)與未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞的形態(tài)如圖2：在實(shí)施例3的細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)在day1時(shí)，用于分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈短梭形，和對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)并無(wú)二致。分化至day3時(shí)，分化組與對(duì)照組在形態(tài)上仍然還沒(méi)有區(qū)別。直到分化至day9時(shí)，分化組的細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始向中央靠攏，出現(xiàn)體積相對(duì)較大的多邊形或星形形態(tài)貼壁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多大小不一的脂滴。該現(xiàn)象到了day23，也就是誘導(dǎo)分化基本完成的階段，在誘導(dǎo)分化組表現(xiàn)得更為明顯，而不誘導(dǎo)分化的對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)這種情況，一直保持間充質(zhì)干細(xì)胞較為明顯的形態(tài)特征。實(shí)施例1和實(shí)施例2的細(xì)胞在形態(tài)上與實(shí)施例3的細(xì)胞相似。但對(duì)比例1～4的細(xì)胞形態(tài)則與實(shí)施例3有所不同。

2、熒光分析

實(shí)施例和對(duì)比例細(xì)胞分化至約20～23天時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光分析。使用pbs洗滌三次，4％多聚甲醛固定30min；pbs洗滌三次，每次10min；含0.2％triton100的1％bsa的pbs冰上通透5min；pbs洗滌三次，每次10min；含1％bsa的pbs封閉1h；pbs洗滌三次，每次10min；加入合適的一抗(1∶200)，室溫避光孵育2-3h/4℃搖晃過(guò)夜；pbs洗滌三次，每次10min；加入合適的熒光二抗(1∶1000)，室溫避光孵育1-1.5h；pbs洗滌三次，每次10min；加入dapi(1∶1000)進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后37℃避光孵育15min后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

由于星狀細(xì)胞具有儲(chǔ)脂和儲(chǔ)存維生素a的功能，對(duì)其自發(fā)熒光進(jìn)行檢測(cè)。

肝內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞群，在調(diào)節(jié)肝竇血流與周圍組織的物質(zhì)交換中起有效的中樞性的作用，同時(shí)參與多種肝臟的生理病理過(guò)程。為了證明通過(guò)分化，人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中有一部分細(xì)胞已經(jīng)成功分化成了肝內(nèi)皮細(xì)胞，我們首先對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行了ve-cadherin(vascularendothelial-cadherin)的免疫熒光染色。ve-cadherin，即血管內(nèi)皮粘鈣素，一般認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)志物，也是干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。

分化23天的細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果如表8：

表8流式細(xì)胞儀分選百分比

結(jié)果表明，當(dāng)干細(xì)胞分化23天后，實(shí)施例1～3的一部分細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)包含較多脂滴的形態(tài)。此外，在第23天時(shí)如果在實(shí)施例1～3與對(duì)照組(未分化)的培養(yǎng)體系中均加入5μm濃度的維生素a，24小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞漂浮死亡，而實(shí)施例1～3分化細(xì)胞不死且發(fā)出藍(lán)色的自發(fā)熒光，提示實(shí)施例1～3分化細(xì)胞具有將維生素a轉(zhuǎn)化為視黃醇儲(chǔ)存的功能(圖3示實(shí)施例3分化細(xì)胞的分化星狀細(xì)胞儲(chǔ)存維生素a之后的自發(fā)熒光，實(shí)施例1～2的細(xì)胞發(fā)光情況與此相似)。但對(duì)比例1～4在分化23天后，細(xì)胞存活情況不及實(shí)施例，且熒光也顯著低于實(shí)施例1～3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比例1～4的細(xì)胞維生素a自然發(fā)光情況皆顯著低于對(duì)比例1～4，p<0.01。

并且，結(jié)果表明，當(dāng)干細(xì)胞分化23天后，實(shí)施例1～3分化的細(xì)胞能夠在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)大量的ve-cadherin陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明該部分細(xì)胞已經(jīng)成功被分化為內(nèi)皮細(xì)胞。(圖4示實(shí)施例3分化細(xì)胞孵育ve-cadherin后的免疫熒光，實(shí)施例1～2的熒光情況與此相似)。但對(duì)比例1～4在分化23天后，熒光情況顯著低于實(shí)施例1～3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比例1～4的細(xì)胞免疫熒光情況皆顯著低于對(duì)比例1～4，p<0.01。

3、流式細(xì)胞分選

為了將測(cè)定脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)分化成星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞的效率，以及將兩種細(xì)胞類型分離，我們分別利用星狀細(xì)胞自發(fā)紫色熒光或者ve-cadherin標(biāo)記后的綠色熒光(采用綠色熒光二抗)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。結(jié)果表明，沒(méi)有分化時(shí)，干細(xì)胞能夠表達(dá)自發(fā)紫色熒光的比例為0.2％，經(jīng)過(guò)23天分化后，有大約9.6％的細(xì)胞能表達(dá)自發(fā)熒光，說(shuō)明這部分細(xì)胞應(yīng)為人類肝星狀細(xì)胞類似的細(xì)胞。而對(duì)于ve-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞而言，未分化時(shí)僅有0.5％的細(xì)胞有陽(yáng)性信號(hào)，23天分化后，有大約14.3％的細(xì)胞成為人類肝內(nèi)皮細(xì)胞類似的細(xì)胞。

4、關(guān)鍵基因定量pcr的測(cè)試

在經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀篩選富集的星狀細(xì)胞群落中進(jìn)行了定量pcr的測(cè)試，確定星狀細(xì)胞關(guān)鍵基因(pparg、alcam、crbp1、timp1、lox)的表達(dá)水平，其中，pparg(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma)，即過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體gamma，是核激素受體家族中的配體激活受體家族的一種。文獻(xiàn)報(bào)道，pparg的激活會(huì)抑制星狀細(xì)胞的激活，所以在干細(xì)胞向星狀細(xì)胞分化時(shí)，pparg的表達(dá)應(yīng)該被抑制；alcam(activatedleukocytecelladhesionmolecule)，即激活性白細(xì)胞黏附分子，又稱cd166，是免疫球蛋白超家族成員之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道胚胎發(fā)育時(shí)，alcam陽(yáng)性的細(xì)胞擁有向星狀細(xì)胞分化的潛力(19085956)；crbp1(cellularretinol-bindingprotein-1)，即細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白1，是血液中維生素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。已有文獻(xiàn)報(bào)道，crbp1和vinculin(黏著斑蛋白)是人類星狀細(xì)胞激活時(shí)較好的標(biāo)記物；timp1(tissueinhibitorofmetallopeptidase-1)，即基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1，是表達(dá)于組織中常見(jiàn)的一種糖蛋白。timp家族蛋白的主要功能是抑制和調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶，共同維護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。一般認(rèn)為，肝內(nèi)timp-1的主要來(lái)源是星狀細(xì)胞和kupffer細(xì)胞，所以timp-1可以作為星狀細(xì)胞分化和激活的分子標(biāo)志物之一；lox(lysyloxidase)，即賴氨酰氧化酶，是一種銅依賴性單胺氧化酶。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其早期激活階段會(huì)發(fā)生lox的大量表達(dá)，使得lox成為鑒定星狀細(xì)胞的重要標(biāo)志性分子之一。檢測(cè)結(jié)果如表9：

表9相對(duì)定量pcr結(jié)果(以未分化組為100％)

注，同行不同肩標(biāo)字母示存在顯著性差異，p<0.05。

結(jié)果表明，相對(duì)于未分化細(xì)胞，實(shí)施例1～3分化獲得的星狀細(xì)胞中，這5種關(guān)鍵基因都發(fā)生了極其顯著的變化。而與實(shí)施例1～3相比，對(duì)比例1～4分化獲得的細(xì)胞中，這5中關(guān)鍵基因的變化程度顯著低于實(shí)施例1～3，p<0.05。

在富集的內(nèi)皮細(xì)胞中也檢測(cè)了三種關(guān)鍵基因(vcam-1、mrc-1和cd31b)的表達(dá)變化情況。vcam-1(vascularcelladhesionmolecule-1)，即血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1，是細(xì)胞黏附因子的一種，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞向血管內(nèi)皮移動(dòng)和黏附的過(guò)程。一直以來(lái)，vcam-1均被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞最為特異和重要的指示基因之一；mrc-1(mannosereceptorc1)，即甘露糖受體c1，屬于c型凝集素超家族成員，可通過(guò)胞外區(qū)識(shí)別和結(jié)合特定的糖類分子，在識(shí)別病原體、遞呈抗原和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮作用。已有報(bào)道指出，mrc-1在肝內(nèi)皮細(xì)胞激活過(guò)程中會(huì)發(fā)生顯著表達(dá)上調(diào)，可以作為其指示基因；cd-31b(clusterofdifferentiation31b)，又叫pecam(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1)，是身體內(nèi)移除衰老中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵分子。其一直以來(lái)都被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的重要指標(biāo)之一。檢測(cè)結(jié)果如表10：

表10相對(duì)定量pcr結(jié)果(以未分化組為100％)

注，同行不同肩標(biāo)字母示存在顯著性差異，p<0.05。

我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未分化細(xì)胞，實(shí)施例1～3分化獲得的內(nèi)皮細(xì)胞中，這3種關(guān)鍵基因均有顯著高表達(dá)，。而與實(shí)施例1～3相比，對(duì)比例1～4分化獲得的內(nèi)皮細(xì)胞中，這3中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平顯著低于實(shí)施例1～3，p<0.05。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。