本發(fā)明涉及一種腸桿菌，具體涉及一株從湖南省懷化市盛產(chǎn)的米刺葡萄表面分離得到的能利用葡萄糖、蔗糖等多種糖為原料發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的enterobacterxiangfangensis10-17。
背景技術(shù)：
：刺葡萄(vitisdavidii)又被稱為山葡萄，是葡萄科(vitiaceae)葡萄屬植物。隨著刺葡萄的栽種技術(shù)逐漸達(dá)到成熟化，在湖南鳳凰、吉首、懷化等地已經(jīng)有了較大的種植基地，刺葡萄的品質(zhì)較好，產(chǎn)量較高且穩(wěn)定。僅湖南省懷化市中方縣葡萄的種植面積已達(dá)4.15萬畝，年產(chǎn)量可達(dá)8.2萬噸。刺葡萄的果肉晶瑩剔透、質(zhì)感細(xì)膩，果皮的顏色為黑紫色，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。由于刺葡萄的果實較小，皮厚而肉甜，而不適宜鮮食，但卻是釀造葡萄酒的優(yōu)質(zhì)原材料，由刺葡萄所釀制的紅葡萄酒，顏色深紅艷麗，風(fēng)味品質(zhì)極佳。然而目前在刺葡萄酒的發(fā)酵過程中通常采用的是活性干酵母，使得發(fā)酵過程高效并且便于控制，但也導(dǎo)致市場上的產(chǎn)品出現(xiàn)高度的相似化，喪失獨特的風(fēng)味，使得消費者逐漸失去了新鮮感。研究表明，在葡萄酒的自然發(fā)酵過程中，該種葡萄產(chǎn)區(qū)的微生物群體也可以參與到發(fā)酵中，使得葡萄酒有特殊的風(fēng)味。目前研究者們正力求從葡萄酒的自然發(fā)酵料液中、葡萄酒廠的土壤中、葡萄的果皮果肉等多個分離源分離篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的野生菌種，使適宜本地葡萄酒的發(fā)酵釀造中能釀造出風(fēng)味獨特、品質(zhì)較佳的葡萄酒。在酒的釀造中常用的是酵母菌，利用酵母菌生產(chǎn)乙醇的優(yōu)點是乙醇得率高，轉(zhuǎn)化率高，受污染的危險小，副產(chǎn)物生成少。缺點是基質(zhì)的利用范圍窄，菌體生成量多。近年來有研究表明不少細(xì)菌在好氧或厭氧的條件下能產(chǎn)生乙醇，并且可利用的基質(zhì)較為廣泛，其優(yōu)點是可直接發(fā)酵淀粉和纖維素，葡萄糖為原料時轉(zhuǎn)化率很高，發(fā)酵時的菌體生成量少，容易保持無菌狀態(tài)，能夠進(jìn)行真空發(fā)酵等。缺點是有機酸生成較多、耐酒精度低、酒精得率中等、耐酸能力不強等。隨著對細(xì)菌產(chǎn)乙醇的研究及應(yīng)用的發(fā)展，將細(xì)菌投用于生產(chǎn)乙醇的研究越來越多，并且發(fā)現(xiàn)在工業(yè)運用方面具有潛在的應(yīng)用價值，如用于燃料乙醇、酶制劑以及酒類生產(chǎn)等。如今，無論是將產(chǎn)乙醇細(xì)菌應(yīng)用于飲料酒生產(chǎn)過程中，還是對菌種進(jìn)行誘變改良或者基因工程改良以提高乙醇得率、耐酸能力等問題，首先都是建立在篩選出具有產(chǎn)乙醇潛質(zhì)的細(xì)菌的基礎(chǔ)上。因此，篩選及發(fā)現(xiàn)能夠發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌并對其進(jìn)行改良對今后葡萄酒釀造業(yè)的發(fā)展及微生物研究應(yīng)用具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對目前在葡萄酒釀造過程中使用活性干酵母而造成獨特風(fēng)味缺失的不足，而野生菌種經(jīng)過自然選擇在釀造本地葡萄酒時具有優(yōu)勢，而提供一種可利用葡萄糖或蔗糖等發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的腸桿菌10-17。本發(fā)明所述的腸桿菌10-17，其分類命名為enterobacterxiangfangensis10-17，已于2017年3月29日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno：m2017152。將本發(fā)明菌株10-17接種到含糖源(如葡萄糖、蔗糖或麥芽糖)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，能產(chǎn)生乙醇。發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：接種量為4-6％、溫度為27-29℃、時間為24-48h。表明該菌株10-17能利用葡萄糖、蔗糖等多種糖發(fā)酵生成乙醇。該株細(xì)菌10-17在乙醇生產(chǎn)領(lǐng)域鮮有報道，本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)enterobacterxiangfangensis具有產(chǎn)乙醇的能力。附圖說明圖1是本發(fā)明菌株的菌落形態(tài)圖。圖2是本發(fā)明菌株的菌體形態(tài)(100×)圖。圖3是本發(fā)明菌株的生長曲線圖。圖4是本發(fā)明菌株16srdnapcr擴增電泳圖。圖5是本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖6是本發(fā)明菌株不同時間的甲基紅實驗結(jié)果圖。具體實施方式實施例1以湖南省懷化市內(nèi)盛產(chǎn)的湘釀1號、紫葡萄、米刺葡萄和高山刺葡萄這四種刺葡萄為篩選原料，在刺葡萄的種植園中隨機摘取不同植株不同部位的新鮮成熟的刺葡萄果實后進(jìn)行標(biāo)記，并將其保存于低溫環(huán)境中運輸至實驗室4℃保藏。對四種刺葡萄進(jìn)行果實表面菌種分離，分別取25g新鮮完整的葡萄果實放入225ml的已滅菌的生理鹽水中，在24℃40khz的超聲清洗器中超聲2min制成混濁液。分別取1ml的混濁液以10倍遞增稀釋后，從10-5、10-6、10-7這三個梯度的稀釋液中取100μl均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于28±1℃倒置培養(yǎng)3-5d。觀察菌落生長情況，挑取具有典型特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，鑒別菌落為細(xì)菌或真菌并進(jìn)行平板反復(fù)劃線純化后，將其接到斜面培養(yǎng)基中保藏。將斜面培養(yǎng)基上保藏的菌株用無菌水以10倍遞增稀釋，取10-4的梯度稀釋液100μl分別接至ttc底層培養(yǎng)基(即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上并且均勻涂布，在28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)48h，待菌落充分長成后，緩慢倒入一層較薄的ttc上層培養(yǎng)基將底層培養(yǎng)基完全覆蓋，然后在28℃條件下培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況及菌落顏色的變化。初步選擇在培養(yǎng)相同時間后菌落顏色較深的菌株。將選擇的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，然后將活化后的菌種在無菌條件下分別挑取兩環(huán)接種于3瓶每瓶30ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以在28℃條件下發(fā)酵48h后測定的發(fā)酵液中的乙醇含量進(jìn)行復(fù)篩以篩選出發(fā)酵能力最好的菌株，實驗設(shè)置3個重復(fù)，即得本發(fā)明菌株。實施例21.將實施例1篩選得到的本發(fā)明菌株10-17在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)3d，菌落呈規(guī)則的圓形，白色，菌落表面光滑且凸起，菌落直徑達(dá)1.5mm-2.0mm，菌落形態(tài)如圖1所示。革蘭氏染色并拍照。在油鏡下觀察到本發(fā)明菌株的菌體形態(tài)如圖2所示，菌體形態(tài)特征見下表1，菌株呈短桿狀，革蘭氏陰性。表1本發(fā)明菌株的菌體形態(tài)特征菌種enterobacterxiangfangensis10-17大小(長×寬，單位μm)0.8-1×1-1.5μm形狀桿狀芽孢無革蘭氏染色-運動性+注：“-”代表陰性，“+”代表陽性。2.本發(fā)明菌株的生長曲線如圖3所示。3.本發(fā)明菌株的生理生化鑒定過程及結(jié)果如下所示：3.1碳源同化試驗采用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、d-木糖、d-阿拉伯糖、檸檬酸、可溶性淀粉、甘露醇、纖維二糖、山梨醇、棉子糖。將12.5％的豆芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，每只試管中裝入10ml豆芽汁培養(yǎng)基，并于121℃滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至40-50℃時，加入625μl10％的無菌糖溶液。然后將本發(fā)明菌株10-17進(jìn)行活化后，按照5％的接種量接入到已準(zhǔn)備好的豆芽汁培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3-5d，觀察是否出現(xiàn)渾濁，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁則為陽性，反之則為陰性。以不含糖的試管為陰性對照管，設(shè)置三個重復(fù)。實驗結(jié)果見表2。表2碳源同化試驗注：“+”表示培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁；“-”表示培養(yǎng)基中無渾濁。3.2氮源同化試驗采用的氮源有：l-賴氨酸、硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸銨、天門冬素。在無氮培養(yǎng)基上分別加入以上氮源作為培養(yǎng)基的唯一氮源，加入量為0.078％(w/w)，并于115℃滅菌20min。按5％的接種量將以活化的本發(fā)明菌株10-17接入已制備好的培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)48h。實驗設(shè)置三個重復(fù)，以不加入氮源的無氮培養(yǎng)基作為陰性對照。根據(jù)本發(fā)明菌株在不同氮源培養(yǎng)基上生長情況，判斷氮源是否能夠被本菌株同化。實驗結(jié)果見表3。表3氮源同化試驗注：“+”表示培養(yǎng)基上有菌落長成；“-”表示培養(yǎng)基上無菌落長成。3.3甲基紅試驗挑取少量新鮮的本發(fā)明菌株10-17接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中，于28℃恒溫培養(yǎng)3-5d，從第48h后每日取培養(yǎng)液加入甲基紅試劑1-2滴，立即觀察現(xiàn)象。直至發(fā)現(xiàn)陽性或第5天仍為陰性即可判定結(jié)果。滴入指示劑，呈鮮紅色或橘紅色為陽性；橘黃色或黃色為陰性“-”，實驗結(jié)果見圖6。3.4耐乙醇試驗向帶有杜氏小管且已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙醇，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇濃度(v/v)達(dá)到10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，混勻后接入已活化好的本發(fā)明菌株10-17，28℃培養(yǎng)2-3d，觀察菌體生長情況和產(chǎn)氣情況。通過試驗結(jié)果縮小耐受限值范圍，并再進(jìn)行試驗確定。實驗結(jié)果見表4、表5。表4本發(fā)明菌株10-17在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的產(chǎn)氣情況注：“-”表示不產(chǎn)氣，“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5，“++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的2/5，“+++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的3/5，“++++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的4/5，“+++++”表示氣體量充滿杜氏小管。表5乙醇耐受限度注：“-”表示不產(chǎn)氣，“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5。3.5耐高滲透壓試驗將經(jīng)過隔夜活化的本發(fā)明菌株10-17劃線接種于糖濃度(v/v)為25％、30％、35％、40％、45％的pda培養(yǎng)基上，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，進(jìn)行檢查。實驗過程中需采取蠟紙封口等措施預(yù)防培養(yǎng)基干燥。實驗結(jié)果見表6。表6高滲透壓試驗注：“-”表示無菌落長成，“+”表示有菌落長成。4.采用tiangen細(xì)菌基因組dna提取試劑盒提取本發(fā)明菌株的dna，對提取的dna以通用引物27-f/1492-r進(jìn)行pcr擴增16srdna，得到片段長度為1502bp的16srdna片段，如圖4所示。委托武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司完成16srdna測序，獲得dna測序結(jié)果。將測序得到的基因序列在ncbi上進(jìn)行blast比對，從中選取同源性高的菌株，再使用mega7.0軟件，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖5)。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)和16srdna分子鑒定，確定本菌株為enterobacterxiangfangensis，命名為enterobacterxiangfangensis10-17。實施例3將本發(fā)明菌株10-17在無菌條件下接種5％于3瓶每瓶30ml的發(fā)酵培養(yǎng)基(以葡萄糖為糖源)中，在28℃條件下發(fā)酵48h后測定發(fā)酵液中的乙醇含量，實驗設(shè)置3個重復(fù)。結(jié)果顯示，三個重復(fù)實驗的測定結(jié)果為10.0(v/v)、10.7(v/v)、11.3(v/v)，所以其發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到10.67％(v/v)。表明，本發(fā)明菌株10-17能發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇。乙醇含量的測定方法：在無菌條件下，從3瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中各取10ml的發(fā)酵液，采用直徑為13mm孔徑為0.22μm的水系微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，將濾液裝入已滅菌的離心管中待測。采用手持酒精濃度計(lal1t)對濾液的酒精濃度進(jìn)行測定，先用蒸餾水對酒精計進(jìn)行校準(zhǔn)后再進(jìn)行測定，將3個重復(fù)試驗的結(jié)果記錄后計算平均值，得出乙醇含量。本說明書中提及的培養(yǎng)基如下：(1)ttc上層培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，葡萄糖6.0g，氯化鈉2.5g，硫代硫酸鈉0.5g，瓊脂15g，l-胱氨酸-鹽酸0.25g，維生素k1g，亞硫酸鈉0.1g，ttc0.5g，蒸餾水1000ml。(2)ttc底層培養(yǎng)基(即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸出粉300g，葡萄糖20g，瓊脂15g，氯霉素0.1g，蒸餾水1000ml，最終ph6.0±0.2。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。(4)12.5％豆芽汁培養(yǎng)基：稱取125g黃豆芽放入1l水中，煮沸0.5h后冷卻過濾至1000ml容量瓶中，并補充蒸餾水至1l，即成12.5％豆芽汁,并在121℃滅菌20min。(5)無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10g，磷酸二氫鉀0.2g，七水合硫酸鎂0.2g，二水合硫酸鈣0.2g，瓊脂20g，碳酸鈣0.2g，蒸餾水1000ml。(6)緩沖葡萄糖蛋白水：磷酸二氫鉀5g，多胨7g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，矯正ph為7.0。當(dāng)前第1頁12