本發(fā)明涉及一種利用直鏈麥芽低聚糖生成酶制備直鏈麥芽六糖的方法，屬于功能糖生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

直鏈麥芽低聚糖通常是指由3-10個(gè)α-D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵組成的功能性低聚糖。其具有良好的加工適應(yīng)性和獨(dú)特的生理功效，在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙等多種領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。直鏈麥芽低聚糖的甜度較低，可作為口感柔和的甜度劑；其持水力強(qiáng)而吸濕性小，可調(diào)節(jié)烘焙、膨化食品中的水分調(diào)節(jié)劑；其黏度為蔗糖的2-5倍，可提高冰淇淋的膨脹率或作為某些流質(zhì)食品的增稠劑；能有效地抑制晶體結(jié)晶，抑制巧克力“返砂”；此外，直鏈麥芽低聚糖還能改善冷飲的抗融性能、延緩速凍食品的蛋白質(zhì)變性和淀粉老化進(jìn)程。

值得注意的是，直鏈麥芽低聚糖還具有獨(dú)特的生理功能，它們可以不經(jīng)胃的消化直接進(jìn)入小腸，被小腸上皮細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶水解，而進(jìn)入血液后能迅速合成糖原，加速肝糖原和肌糖原的恢復(fù)，所以引起的胰島素反應(yīng)和血糖反應(yīng)比葡萄糖平穩(wěn)，能長(zhǎng)時(shí)間地為人體提供能量，同時(shí)也能防止運(yùn)動(dòng)時(shí)大量乳酸的形成，因此對(duì)于運(yùn)動(dòng)員和一些胰臟切除病人、腎病患者來說是一種理想的能量補(bǔ)充來源。直鏈麥芽低聚糖還具其它生理特點(diǎn)：(1)可以促使人體更好地吸收Ca²⁺，有效預(yù)防中老年人骨質(zhì)疏松；(2)不易被細(xì)菌發(fā)酵利用，有利于預(yù)防齲齒；(3)能選擇性抑制腸道腐敗菌的生長(zhǎng)地而促進(jìn)益生菌增殖，從而維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境的健康。(4)提供信號(hào)促進(jìn)雙糖酶的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)為有利于其后續(xù)的消化，同時(shí)誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞分化。

現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的生產(chǎn)直鏈麥芽六糖的方法通常需要直鏈麥芽低聚糖生酶與脫支酶進(jìn)行協(xié)同作用，并添加鈣離子，才能獲得60％以上的轉(zhuǎn)化率。且目前國(guó)內(nèi)外對(duì)直鏈麥芽低聚糖生產(chǎn)六糖的研究停留在實(shí)驗(yàn)室水平，其使用的底物濃度較低，一般為0.5％～5％，無法直接擴(kuò)大并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。工業(yè)上酶法工藝生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖，是通過直鏈麥芽低聚糖生成酶從淀粉非還原末端切下多個(gè)葡萄糖單元而成。在日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已開始批量生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖，而國(guó)內(nèi)尚未有直鏈麥芽低聚糖的生產(chǎn)。隨著直鏈麥芽低聚糖在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景越來越廣泛，在國(guó)內(nèi)開發(fā)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的直鏈麥芽低聚糖勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種制備直鏈麥芽六糖的方法，所述方法是以2～10U/g底物的添加量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，水解淀粉或麥芽糊精生成含直鏈麥芽六糖的低聚糖漿。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述直鏈麥芽低聚糖生成酶的GenBank登錄號(hào)為AIV43245.1。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述直鏈麥芽低聚糖生成酶由表達(dá)GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1的酶的基因工程菌發(fā)酵獲得。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌包括以Bacillus subtilis WB 600為宿主，以pST為載體，表達(dá)GenBank登錄號(hào)為AIV43245.1的酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述淀粉包括玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉、木薯淀粉。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以所述直鏈麥芽低聚糖生成酶為催化劑，以pH6.5～7.5的淀粉溶液或麥芽糊精溶液為底物，按2～10U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在60～80℃下反應(yīng)24～72小時(shí)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以2U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60～80℃下反應(yīng)24～72小時(shí)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以5U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反應(yīng)24～72小時(shí)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以10U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反應(yīng)24～48小時(shí)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含30％以上麥芽六糖的低聚糖漿，是由所述方法制備獲得的。

本發(fā)明還提供所述方法在制備含低聚糖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括制備含所述低聚糖的飲品、保健品。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)本發(fā)明所用的直鏈麥芽低聚糖生成酶由食品級(jí)枯草芽孢桿菌表達(dá)，安全性好。該酶比酶活高，熱穩(wěn)定性好，可以水解麥芽糊精生成麥芽六糖含量達(dá)到30％以上的直鏈麥芽低聚糖漿，且即使延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間葡萄糖的含量也很低?？捎糜谏a(chǎn)功能性飲料及流質(zhì)食品或生產(chǎn)高純度的直鏈麥芽六糖，避免了直鏈麥芽低聚糖漿中葡萄糖對(duì)生產(chǎn)加工的影響，有利于直鏈麥芽低聚糖漿的深加工，從而更具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力；

2)本發(fā)明所提供的生產(chǎn)直鏈麥芽六糖糖漿的方法，和其他生產(chǎn)淀粉糖的方法相比，不需要在生產(chǎn)過程中調(diào)節(jié)溫度和pH、不需要普魯蘭酶、異淀粉酶等其他協(xié)同酶制劑，因此工藝更為簡(jiǎn)單、便捷，生產(chǎn)成本更低廉。

3)本發(fā)明的直鏈麥芽低聚糖生成酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度較高，分別達(dá)到75％和30％以上，可以有效降低高純度直鏈麥芽低聚糖漿的生產(chǎn)加工成本，更具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為采用實(shí)施例1的方法制備的糖漿產(chǎn)品的HPAEC-PAD曲線(稀釋1000倍)；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖；

圖2為采用實(shí)施例1的方法制備的糖漿產(chǎn)品中樣品組分及相對(duì)含量；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖；

圖3為采用實(shí)施例2的方法制備的糖漿產(chǎn)品中樣品組分及相對(duì)含量；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

配制10％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 7.0，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，在60℃下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的譜圖如圖1所示。樣品中各組分相對(duì)含量如圖2所示，此時(shí)糖漿中主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖含量為32.3％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)75.5％，而葡萄糖含量極低，無DP值大于等于8的直鏈低聚糖檢出，說明反應(yīng)體系中未被轉(zhuǎn)化的底物可能以大分子的形式存在，分離較容易。

實(shí)施例2

配制30％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 7.0，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，在80℃下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的組分與含量結(jié)果如圖3所示，此時(shí)糖漿中主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖含量為32.8％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)76.2％。

實(shí)施例3

配制10％的馬鈴薯淀粉溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 7.5，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，在60℃下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，糖漿中主產(chǎn)物麥芽六糖含量為31.5％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)76.8％。

實(shí)施例4

采用實(shí)施例3的方法，將馬鈴薯淀粉替換為玉米淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉或木薯淀粉，主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖含量均在30％以上，底物轉(zhuǎn)化率均在75％以上。

實(shí)施例5

配制10％的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 7.0，按5U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，分別在60℃下反應(yīng)24，48h，72h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的組分與含量結(jié)果如表1所示，此時(shí)糖漿中主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖含量為35.0％～37.7％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)75.％以上。

表1不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖漿產(chǎn)品中樣品組分及相對(duì)含量的影響。

實(shí)施例6

配制10％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 7.0，分別按2U/g、5U/g、10U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，在60℃下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的組分與含量結(jié)果如表2所示，此時(shí)糖漿中主產(chǎn)物麥芽六糖含量為30.02～33.9％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)75％以上。

表2不同加酶量對(duì)糖漿產(chǎn)品中樣品組分及相對(duì)含量的影響

實(shí)施例7

配制30％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調(diào)節(jié)pH 6.5，按5U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號(hào)為AIV43245.1)，分別在60～80℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的組分與含量結(jié)果如表3所示，此時(shí)糖漿中主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖含量為31.67～35.15％，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)75％以上。

表3不同反應(yīng)溫度對(duì)糖漿產(chǎn)品中樣品組分及相對(duì)含量的影響。

實(shí)施例8

按實(shí)施例1的方法制備糖漿，區(qū)別在于分別采用GenBank中的編號(hào)為AAS99099.1、CAA39096.1和CAL64397.1的酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)結(jié)束后的糖漿中低聚糖產(chǎn)品的組分和含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，采用GenBank中編號(hào)為AAS99099.1的直鏈麥芽六糖生成酶，底物轉(zhuǎn)化率為51.24％，主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖的比例為31.72％；采用GenBank中編號(hào)為CAA39096.1的直鏈麥芽六糖生成酶，底物轉(zhuǎn)化率為57.12％，主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖的比例為26.74％；采用GenBank中編號(hào)為CAL64397.1的直鏈麥芽低聚糖生成酶，底物轉(zhuǎn)化率為60.34％，主產(chǎn)物直鏈麥芽六糖的比例為30.14％。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。