本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，研究者們對dna的關(guān)注日益增加。無論是基因測序、pcr擴(kuò)增，還是構(gòu)建bca文庫等，都對dna的濃度、純度、一級結(jié)構(gòu)的完整性有很高的要求，因此需要提取高品質(zhì)的dna和大量的dna樣本。但是基因組dna樣本傳統(tǒng)上都是從血液中提取的。這種采血方法對被收集者會(huì)造成一定的傷害，帶來痛苦，被大多數(shù)人所厭惡或拒絕。由于唾液和血液有一定的相似性，而且唾液中含有大量口腔脫落上皮細(xì)胞，通過采集唾液或者口腔拭子來收集口腔樣本，是一種對人體無傷害、無痛苦的方法。而且隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和體外診斷技術(shù)蓬勃發(fā)展，需要處理的樣品量日益龐大，因此迫切需要開發(fā)高效、方便、可靠、高通量的唾液或拭子基因組dna提取方法。

唾液基因組dna的提取方法有很多，目前市場上商品化的主要是離心柱法，其原理是根據(jù)dna與離心柱上所修飾化學(xué)基團(tuán)之間的氫鍵、靜電等作用力，在高鹽溶液中離心柱特異性吸附dna，漂洗蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)后，用低鹽溶液洗脫得到基因組dna。離心柱型試劑盒操作簡單，缺點(diǎn)為需要在ep管中操作，需要反復(fù)的離心清洗后方可獲得dna產(chǎn)物，操作過程需要將離心柱頻繁轉(zhuǎn)出和轉(zhuǎn)入ep管、并配合大量離心工作，導(dǎo)致操作時(shí)間隨之增加并且需要大量人工，不適合大規(guī)模高通量dna提取工作。

磁珠法的出現(xiàn)使得高通量快速提取不同體系的基因組dna變成可能。其原理是磁珠表面修飾有特殊化學(xué)基團(tuán)，在不同條件下可以對dna分子形成特異性吸附或者解吸附作用，再加上其本身擁有順磁性的特性，富集dna后，在外加磁場作用下，可以方便、快捷地實(shí)現(xiàn)與母液分離的操作。這種富集dna的方法不僅方法簡單快速，而且容易實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。而現(xiàn)有磁珠法仍做不到無需離心和高通量化的技術(shù)問題，并且現(xiàn)有技術(shù)中所使用的磁珠比表面積較小，密度較大，從而導(dǎo)致懸浮能力較差，捕獲核酸的能力較弱，當(dāng)樣本中核酸含量很小時(shí)，磁珠無法高效捕獲核酸。因此，需要開發(fā)一款以市場為導(dǎo)向、以磁珠法為基礎(chǔ)、能夠高通量快速高效提取唾液或拭子基因組dna的試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒及其使用方法?？谇粯颖景ㄍ僖夯蚩谇皇米訕颖尽Ｔ撛噭┖锌梢詮耐僖夯蚴米又刑崛「呒兌然蚪Mdna，所得基因組dna可直接應(yīng)用于臨床體外檢測使用；且提取方法簡便，無需離心，提取效率高，可用于高通量和自動(dòng)化提取。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其包括有分別獨(dú)立分裝的保存液、蛋白酶k溶液、裂解液、磁珠分散液、清洗液i、清洗液ii和洗脫液；

其中，所述保存液包含有tris堿和螯合劑i；

所述裂解液包含有胍類化合物i、氯化鈉、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化銨和螯合劑ii；

所述磁珠分散液中包含有磁珠，該磁珠的內(nèi)核為超順磁性四氧化三鐵，內(nèi)核表面包覆有聚合物，該聚合物表面包覆有二氧化硅層，所述磁珠的粒徑為50-100nm；

所述清洗液i包含有胍類化合物ii和乙醇；

所述清洗液ii為乙醇溶液；

所述洗脫液為tris堿或去離子水。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述保存液中的螯合劑i選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合，螯合劑i的濃度為3-7mmol/l；所述保存液中tris堿的濃度為5-15mmol/l。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述蛋白酶k溶液中蛋白酶k的濃度為18-22g/l。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述裂解液中的胍類化合物i選自鹽酸胍、異硫氰酸胍或其組合，濃度為1-6mol/l；氯化鈉的濃度為0.05-0.3mol/l；聚乙烯吡咯烷酮的百分比為0.5％-2％(w/v)；十六烷基三甲基溴化銨的百分比為0.5％-2％(w/v)；螯合劑ii選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合，濃度為3-7mmol/l。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述磁珠分散液為磁珠濃度為10-35g/l的去離子水溶液。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述清洗液i中的胍類化合物ii選自鹽酸胍、異硫氰酸胍或其組合，濃度為0.5-2mol/l；所述清洗液i中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40％-65％。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，所述清洗液ii中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％-90％。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，其中，當(dāng)所述洗脫液含有tris堿時(shí)，其tris堿的濃度為3-7mmol/l。

一種如上任一項(xiàng)所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒的使用方法，其包括以下步驟：

步驟一：將口腔樣本轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中，加入蛋白酶k溶液和裂解液，混勻；

步驟二：將上述樣本在58℃溫??；

步驟三：加入異丙醇和磁珠分散液，混勻；

步驟四：將反應(yīng)容器置于磁力架上，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟五：加入清洗液i，高速渦旋，確保磁珠充分混勻；將反應(yīng)容器置于磁力架上，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟六：加入清洗液ii，高速渦旋，確保與磁珠充分混勻；將反應(yīng)容器置于磁力架上，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，重復(fù)該步驟兩次；

步驟七：將棄去上清液后的反應(yīng)容器連同磁力架一起放入真空干燥箱中真空干燥；

步驟八：加入洗脫液，高速渦旋混勻，磁性分離去除磁珠，反應(yīng)容器中的上清液中即含有目標(biāo)基因組dna。

優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒的使用方法，其中，所述反應(yīng)容器為ep管、48孔板或96孔板。

本發(fā)明的有益效果是：

1、樣本采集方便，采集過程不會(huì)對人體造成傷害，被采集者無痛苦。

2、無需對樣本進(jìn)行過多前處理，即可開始提取唾液或拭子基因組dna。

3、dna提取純度高、回收率高。

4、無需使用苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑，對操作人員安全無毒副作用。

5、操作簡單，無需離心，工作效率高，適用于高通量實(shí)驗(yàn)。

6、所用磁珠的粒徑更小，比表面積更大，捕獲核酸的能力更強(qiáng)；并且磁珠中間層為聚合物，密度更小，使得磁珠的懸浮能力更強(qiáng)，有利于結(jié)合核酸。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中從唾液原液或唾液稀釋液中提取基因組dna產(chǎn)物的電泳膠圖(圖1(a)：從唾液原液中提取基因組dna；圖1(b)(1-6)：從唾液稀釋液中提取基因組dna)；采用市售的柱式法試劑盒從唾液稀釋液中提取基因組dna(圖1(b)(7-12))。

圖2為實(shí)施例2中從口腔拭子中提取基因組dna產(chǎn)物的的電泳膠圖。

圖3為實(shí)施例3中從唾液原液中高通量提取基因組dna產(chǎn)物的的電泳膠圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1

一種基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，包括：

保存液：7mmol/l的乙二胺四乙酸二鈉、15mmol/l的tris堿水溶液，ph值為7.0。具體配制方法：稱取1.82gtris堿和2.61g乙二胺四乙酸二鈉，加入800ml的去離子水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到1l，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0。

蛋白酶k溶液：22g/l的蛋白酶k溶液。具體配制方法：稱取2.20g蛋白酶k，加入80ml去離子水溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到100ml。

裂解液：6mol/l的鹽酸胍、0.3mol/l的氯化鈉、2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮、2％(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨和7mmol/l的乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液。具體配制方法：稱取573.18g鹽酸胍、17.53g氯化鈉、20g聚乙烯吡咯烷酮、20g十六烷基三甲基溴化銨和2.61g乙二胺四乙酸二鈉，加入500ml去離子水?dāng)嚢枞芙猓^續(xù)加入去離子水定容到1l。

磁珠分散液：35g/l的磁珠水溶液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵，粒徑為100nm。具體配制方法：稱取3.50g磁珠，加入到80ml去離子水中，超聲分散，繼續(xù)加去離子水定容到100ml，超聲分散均勻。

清洗液i：2mol/l的鹽酸胍和體積分?jǐn)?shù)為65％的乙醇水溶液。具體配制方法：稱取191.06g鹽酸胍，加入500ml體積分?jǐn)?shù)為65％的乙醇水溶液攪拌溶解，繼續(xù)加入體積分?jǐn)?shù)為65％的乙醇水溶液，定容至1l。

清洗液ii：體積分?jǐn)?shù)為90％乙醇水溶液。具體配制方法：量取900ml無水乙醇，加入100ml去離子水。

洗脫液：7mmol/l的tris堿或去離子水，ph值為8.0。具體配制方法：稱取0.85gtris堿，加入800ml去離子水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到1l，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至8.0。

使用上述試劑盒對3份唾液原液樣本平行樣和以唾液原液：唾液或拭子保存液分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:7或1:9稀釋后的唾液樣本基因組dna進(jìn)行提?。?/p>

步驟一：向200μl唾液樣本中加入20μl蛋白酶k溶液和300μl裂解液，使溶液渦旋混勻；

步驟二：將上述樣本58℃溫浴15min，渦旋混勻數(shù)次，12000rpm短暫離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的液滴，取全部上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mlep管內(nèi)；

步驟三：加入400μl異丙醇和100μl磁珠分散液，蓋上蓋子，劇烈搖晃數(shù)次，高速渦旋混合孵育5min；

步驟四：將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟五：加入800μl清洗液i，高速渦旋1min，確保磁珠充分混勻，清洗干凈。將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟六：加入600μl清洗液ii，高速渦旋1min，確保與磁珠充分混勻。將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，重復(fù)該步驟兩次；

步驟七：將棄去上清液后的ep管放置在磁力架上，ep管連同磁力架一起放入事先準(zhǔn)備好的45℃的真空干燥箱中，真空干燥8min；

步驟八：加入150μl洗脫液，高速渦旋混勻1min，將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，將ep管上清液轉(zhuǎn)移至新的ep管中，ep管上清液中即獲得目標(biāo)基因組dna。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對相同唾液稀釋樣本基因組dna，使用市售的柱式法試劑盒進(jìn)行了6份平行對照實(shí)驗(yàn)。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：對所得唾液基因組dna回收產(chǎn)物，分別取2μl上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示所獲得基因組dna產(chǎn)物條帶清晰，無拖尾和雜帶，表明提取的基因組dna完整性好，且無其它dna污染。圖1(a)表明，采用本試劑盒所得結(jié)果平行性好；圖1(b)表明采用本試劑盒所得基因組dna條帶亮度比同條件下的柱式法好。

od值檢測：使用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)對所得基因組dna回收產(chǎn)物進(jìn)行了od值檢測(見表1和表2)。結(jié)果顯示使用本方法對唾液基因組dna進(jìn)行提取得到的dna產(chǎn)物含量高且純度良好。由表2看出，采用本試劑盒提取的基因組dna濃度優(yōu)于對照柱式法試劑盒的提取濃度。

表1實(shí)施例1中從唾液原液平行樣中提取基因組dna產(chǎn)物的od檢測值

表2實(shí)施例1中從唾液稀釋樣本中提取基因組dna產(chǎn)物的od值檢測值

注：樣本1-6：本試劑盒及方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果；樣本7-12：柱式法實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例2

一種基于磁珠法提取口腔樣本基因組dna的試劑盒，包括：

保存液：3mmol/l的乙二胺四乙酸二鉀、5mmol/l的tris堿水溶液，ph值為7.0。具體配制方法：稱取0.61gtris堿和1.12g乙二胺四乙酸二鉀，加入800ml的去離子水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到1l，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0。

蛋白酶k溶液：18g/l的蛋白酶k溶液。具體配制方法：稱取1.80g蛋白酶k，加入80ml去離子水溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到100ml。

裂解液：1mol/l的異硫氰酸胍、0.05mol/l的氯化鈉、0.5％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮、0.5％(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨和3mmol/l的乙二胺四乙酸二鉀的混合溶液。具體配制方法：稱取118.16g異硫氰酸胍、2.92g氯化鈉、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g十六烷基三甲基溴化銨和1.12g乙二胺四乙酸二鉀，加入500ml去離子水?dāng)嚢枞芙?，繼續(xù)加入去離子水定容到1l。

磁珠分散液：10g/l的磁珠水溶液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵，粒徑為50nm。具體配制方法：稱取1.00g磁珠，加入到80ml去離子水中，超聲分散，繼續(xù)加去離子水定容到100ml，超聲分散均勻。

清洗液i：0.5mol/l的異硫氰酸胍和體積分?jǐn)?shù)為40％的異丙醇水溶液。具體配制方法：稱取59.08g異硫氰酸胍，加入500ml體積分?jǐn)?shù)為40％的異丙醇水溶液攪拌溶解，繼續(xù)加入體積分?jǐn)?shù)為40％的異丙醇水溶液，定容至1l。

清洗液ii：體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇水溶液。具體配制方法：量取700ml無水乙醇，加入300ml去離子水。

洗脫液：3mmol/l的tris堿或去離子水，ph值為8.0。具體配制方法：稱取0.36gtris堿，加入800ml去離子水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到1l，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至8.0。

使用上述試劑盒對口腔拭子基因組dna進(jìn)行提?。?/p>

步驟一：用剪刀將口腔拭子棉頭剪下或者將塑料的刮頭折斷，移至1.5mlep管中，加入200μl保存液、20μl蛋白酶k溶液和200μl裂解液，使溶液渦旋混勻；

步驟二：將上述樣本58℃溫浴15min，渦旋混勻數(shù)次，12000rpm短暫離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的液滴，取全部上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mlep管內(nèi)；

步驟三：加入300μl異丙醇和80μl磁珠分散液，蓋上蓋子，劇烈搖晃數(shù)次，高速渦旋混合孵育5min；

步驟四：將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟五：加入700μl清洗液i，高速渦旋1min，確保磁珠充分混勻，清洗干凈。將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液；

步驟六：加入700μl清洗液ii，高速渦旋1min，確保與磁珠充分混勻。將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，重復(fù)該步驟兩次；

步驟七：將棄去上清液后的ep管放置在磁力架上，ep管連同磁力架一起放入事先準(zhǔn)備好的45℃的真空干燥箱中，真空干燥8min；

步驟八：加入200μl洗脫液或去離子水，高速渦旋混勻1min，將ep管置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，將ep管上清液轉(zhuǎn)移至新的ep管中，ep管上清液中即獲得目標(biāo)基因組dna。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：對所得10份口腔拭子基因組dna回收產(chǎn)物，分別取2μl上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖(見圖2)顯示所獲得口腔拭子基因組dna產(chǎn)物條帶清晰，無拖尾和雜帶，表明提取的基因組dna完整性好，且無其它dna污染。

od值檢測：使用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)對10份口腔拭子基因組dna回收產(chǎn)物進(jìn)行了od值檢測(見表3)。檢測結(jié)果顯示使用本方法對口腔拭子基因組dna進(jìn)行提取得到的dna產(chǎn)物含量高且純度良好。

表3實(shí)施例2中從口腔拭子中提取基因組dna產(chǎn)物的od檢測值

實(shí)施例3

使用實(shí)施例1的試劑盒對27份唾液基因組dna進(jìn)行高通量提取實(shí)驗(yàn)：

步驟一：用多通道自動(dòng)移液器按順序向48孔板中加入200μl唾液樣本、20μl蛋白酶k溶液和300μl裂解液，平行27份樣品，渦旋混勻；

步驟二：將上述樣本置于58℃溫浴15min，期間輕輕晃動(dòng)數(shù)次；

步驟三：取出48孔板，用多通道自動(dòng)移液器向27個(gè)樣本孔中分別加入400μl異丙醇和100μl磁珠分散液，將48孔板置于渦旋混合儀上，高速渦旋混合孵育5min；

步驟四：將48孔板放置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，然后呈倒扣狀態(tài)置于吸水紙上，徹底去除殘留上清液；

步驟五：將48孔板從磁力架上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣本孔中分別加入800μl清洗液i，高速渦旋1min，確保磁珠充分混勻，清洗干凈。將48孔板置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，然后呈倒扣狀態(tài)置于吸水紙上，徹底去除殘留上清液；

步驟六：將48孔板從磁力架上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣本孔中分別加入600μl清洗液ii，高速渦旋1min，確保與磁珠充分混勻。將48孔板置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去上清液，然后呈倒扣狀態(tài)置于吸水紙上，徹底去除殘留上清液，重復(fù)該步驟兩次；

步驟七：將棄去上清液后的48孔板放置在磁力架上，一起放入事先準(zhǔn)備好的45℃的真空干燥箱中，真空干燥8min；

步驟八：取出48孔板，用多通道自動(dòng)移液器向樣本孔中分別加入150μl洗脫液或去離子水，高速渦旋混勻1min，將48孔板置于磁力架上，靜置30～90s，待磁珠被完全吸附后，用多通道自動(dòng)移液器轉(zhuǎn)移上清液至pcr板中，即獲得目標(biāo)基因組dna。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：對所得27份唾液基因組dna回收產(chǎn)物，分別取2μl上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖(見圖3)顯示所獲得唾液基因組dna產(chǎn)物平行性好，條帶清晰，無拖尾和雜帶，表明提取的基因組dna完整性好，且無其它dna污染。

od值檢測：使用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)對27份唾液基因組dna回收產(chǎn)物進(jìn)行了od值檢測(見表4)。檢測結(jié)果顯示使用本方法對唾液基因組dna進(jìn)行提取得到的dna產(chǎn)物含量高且純度良好，說明該試劑盒適用于高通量提取基因組dna。

表4實(shí)施例3中從唾液中高通量提取基因組dna產(chǎn)物的od檢測值

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。