技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是微生物篩選方法，特別是一種利用流式細(xì)胞術(shù)快速分選高山被孢霉原生質(zhì)體融合子的方法。
背景技術(shù)：
：：花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，英文縮寫為ara(arachidonicacid),又名aa。其在人體內(nèi)發(fā)揮多重作用，是多種循環(huán)二十烷酸衍生物的前體，如前列腺素、前列腺環(huán)素、血栓烷素和白細(xì)胞三烯等，其又具有酯化膽固醇、抑制血小板聚集、降低血液黏度、調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能、提高免疫力和促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育等功能。作為一種高效新型的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，aa應(yīng)用廣泛，需求逐年增加，國內(nèi)外花生四烯酸產(chǎn)業(yè)繼續(xù)呈現(xiàn)規(guī)?；瘮U(kuò)大的趨勢。工業(yè)上主要通過微生物發(fā)酵來獲取aa，高山被孢霉菌種因其油脂含量豐富、aa含量高和油脂組成合理而被普遍應(yīng)用于aa的發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵過程中，菌種選育是提高花生四烯酸產(chǎn)量的首要關(guān)鍵因素之一。傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變、自然雜交等育種技術(shù)存在工作量大，突變方向不定等弊端，近些年利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育微生物菌種逐漸成為研究熱點。相比其他育種技術(shù)，原生質(zhì)體融合技術(shù)具有獨特的優(yōu)點：突破了種間、屬間以及科間的不親和障礙，實現(xiàn)了遠(yuǎn)源雜交。盡管遺傳信息量大，但并不需要了解雙親詳細(xì)的遺傳背景，操作簡單，可定向選育具備雙親優(yōu)良性狀的融合子。融合子的篩選是原生質(zhì)體融合技術(shù)中的一個關(guān)鍵步驟，目前應(yīng)用較多的利用營養(yǎng)缺陷或者抗性標(biāo)記篩選融合子方法對菌株自身特性有一定要求，而且工作量較大，還易影響菌株本身的正常代謝及生理特性。本研究采用了流式細(xì)胞術(shù)篩選真菌原生質(zhì)體融合子，分別采用不同熒光染料細(xì)胞膜紅色熒光探針dil和細(xì)胞膜綠色熒光探針dio標(biāo)記雙親原生質(zhì)體，融合后利用流式細(xì)胞儀分選帶兩種熒光信號的融合子，檢測速度快、分選純度高，為融合子的篩選提供了一種有效手段。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是以高山被孢霉為研究對象，提出一種利用流式細(xì)胞術(shù)快速分選原生質(zhì)體融合子的方法。利用流式細(xì)胞術(shù)分選高山被孢霉或其他菌體原生質(zhì)體融合子，為融合子的篩選提供了一種有效手段。本發(fā)明的目的通過如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)：(1)高山被孢霉兩親本a、b菌株原生質(zhì)體的制備分別將pda斜面上生長5-7天的不同性狀的高山被孢霉兩親本菌絲刮下，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌1次并離心，取1mg離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，輕搖使離心后的菌絲體和酶解液充分混合，再置于28-32℃、轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫?fù)u床中，酶解4h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4℃，5000r/min離心10min，沉淀用0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體。所述混合酶解液中各酶的濃度分別為蝸牛酶10-20mg/ml、纖維素酶5-10mg/ml、溶菌酶0.2-0.8mg/ml、幾丁質(zhì)酶0.2-0.5mg/ml。最佳混合酶解液為蝸牛酶15mg/ml、纖維素酶6mg/ml、溶菌酶0.5mg/ml、幾丁質(zhì)酶0.2mg/ml。(2)分別使用不同顏色熒光染料對兩親本菌株原生質(zhì)體進(jìn)行熒光染色及融合處理將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlpbs中，并分別加入lμl的dil(細(xì)胞膜紅色熒光探針)和lμldio(細(xì)胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，35-40℃避光溫育20-60min。離心去除染色劑，并用pbs緩沖液洗滌2次后懸浮。取等量熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合進(jìn)行融合，于4℃，5000r/min離心10min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml35％peg6000，輕輕搖勻，于30℃靜置60min，離心后沉淀用0.5-1.0mol/lnacl洗滌2次并懸浮，獲得融合懸浮液；所述避光溫育時，最佳溫度37℃，最佳時間30min。(3)利用流式細(xì)胞儀分選融合子選擇已染色融合子懸浮液的1個細(xì)胞群，調(diào)節(jié)確定合適的放大電壓，以另外的未染色的融合原生質(zhì)體作為對照，選定紅色熒光信號強(qiáng)的區(qū)域p2，再選定同時綠色熒光信號也強(qiáng)的區(qū)域p3，分選出同時帶兩種熒光信號的融合子，即為融合成功的融合子，并將其收集于裝有3ml1mol/l山梨醇溶液的收集管中。(4)融合子再生將融合成功的融合子涂布再生平板進(jìn)行兩級再生，培養(yǎng)條件為28℃倒置培養(yǎng)2-5d，培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到pda固體培養(yǎng)基茄瓶中進(jìn)行再培養(yǎng)，待孢子大量萌發(fā)，刮取孢子制備孢子懸液，然后取5-10％孢子懸液接種于pda液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25-30℃，濕度30-60％、搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp的條件下培養(yǎng)2-4d，再將種子液按5-10％的接種量接入含有pda液體培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測aa產(chǎn)量。本發(fā)明所用的培養(yǎng)基及緩沖液：1.pda固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，瓊脂2％，kh2po40.05％，mgso40.025％，ph自然；2.pda液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，kh2po40.05％，mgso40.025％，ph自然；3.再生培養(yǎng)基：以1mol/l山梨醇配制的pda培養(yǎng)基；4.pbs：nah2po4·h2o2.14g、na2hpo42.26g溶于100ml水中，ph6.5,取上述配制好液體10ml，加入4.68gnacl后加水定容到100ml即得到pbs；5.熒光染色劑配制：分別取1mgdio和dil加入10mldmso獲得。本發(fā)明的優(yōu)點是：1.利用流式細(xì)胞術(shù)分選原生質(zhì)體融合子，檢測速度快、分選純度高，大大減少了融合子篩選的工作量。2.目前，尚未發(fā)現(xiàn)該方法應(yīng)用于高山被孢霉原生質(zhì)體融合子的篩選，為融合子篩選提供了一種新的有效手段。3、經(jīng)過本發(fā)明篩選的原生質(zhì)體融合子再生后，明顯地提高了高山被孢霉aa產(chǎn)量。附圖說明：圖1為流式細(xì)胞分選圖譜，p1為分選范圍細(xì)胞區(qū)域圖2為流式細(xì)胞分選圖譜，p2為紅色熒光信號強(qiáng)的原生質(zhì)體圖3為流式細(xì)胞分選圖譜，p3為p2中綠色熒光信號強(qiáng)的原生質(zhì)體圖4為流式細(xì)胞分選出融合子的再生情況，其中a為融合子再生3天形態(tài)，其中b為融合子再生5天形態(tài)具體實施方式：本發(fā)明所用菌株均由高山被孢霉mortierellaalpinacfcc88447(購于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心)紫外誘變后分離純化獲得，菌種以甘油管保存于-80℃冰箱內(nèi)，每6個月轉(zhuǎn)存一次。實施例1(1)兩親本菌株a和b的原生質(zhì)體的制備將pda斜面上生長5-7天的菌絲刮下，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌1次并離心，取1mg離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，輕搖使離心后的菌絲體和酶解液充分混合，再置于28-32℃，轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫?fù)u床中，酶解4h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4℃，5000r/min離心10min，沉淀用0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體；(2)兩親本菌株原生質(zhì)體熒光染色后融合處理將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlpbs中，并分別加入lμl的dil(細(xì)胞膜紅色熒光探針)和lμldio(細(xì)胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，40℃避光溫育20min，離心去除染色劑，并用pbs緩沖液洗滌2次后懸浮。取等量熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4℃，5000r/min離心10min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml35％peg6000，輕輕搖勻，于30℃靜置60min，離心后沉淀用0.5-1.0mol/lnacl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液。(3)流式細(xì)胞分選融合子建立并選定流式細(xì)胞分選融合子方案。選擇1個細(xì)胞群，調(diào)節(jié)確定合適的放大電壓。以未染色的融合原生質(zhì)體作為對照，選定紅色熒光信號強(qiáng)的區(qū)域p2，再選定同時綠色熒光信號也強(qiáng)的區(qū)域p3，即融合子。進(jìn)樣分選出同時帶兩種熒光信號的融合子，收集于裝有3ml1mol/l山梨醇溶液的收集管中，篩選到融合子占分選細(xì)胞總數(shù)的5％。實施例2(1)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備將pda斜面上生長5-7天的菌絲刮下，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌1次并離心，取1mg離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，輕搖使離心后的菌絲體和酶解液充分混合，再置于28-32℃，轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫?fù)u床中，酶解4h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4℃，5000r/min離心10min，沉淀用0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體；(2)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色后融合處理將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlpbs中，并分別加入lμl的dil(細(xì)胞膜紅色熒光探針)和lμldio(細(xì)胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，37℃避光溫育30min，離心去除染色劑，并用pbs緩沖液洗滌2次后懸浮。取等量熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4℃，5000r/min離心10min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml35％peg6000，輕輕搖勻，于35℃靜置60min，離心后沉淀用0.5-1.0mol/lnacl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液。(3)流式細(xì)胞分選融合子建立并選定流式細(xì)胞分選融合子方案。選擇1個細(xì)胞群，調(diào)節(jié)確定合適的放大電壓。以未染色的融合原生質(zhì)體作為對照，選定紅色熒光信號強(qiáng)的區(qū)域p2，再選定同時綠色熒光信號也強(qiáng)的區(qū)域p3，即融合子。進(jìn)樣分選出同時帶兩種熒光信號的融合子，收集于裝有3ml1mol/l山梨醇溶液的收集管中，篩選到融合子占分選細(xì)胞總數(shù)的10％。實施例2的檢測結(jié)果見表1表1高山被孢霉親本株a、b及融合成功菌株的產(chǎn)量對比菌株生物量油脂含量aa含量(％)aa產(chǎn)量a33.6735.2545.445.39b29.5844.8539.275.21融合菌株31.5743.2846.256.32實施例3(1)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備將pda斜面上生長5-7天的菌絲刮下，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌1次并離心，取1mg離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，輕搖使離心后的菌絲體和酶解液充分混合，再置于28-32℃、轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫?fù)u床中，酶解4h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4℃，5000r/min離心10min，沉淀用0.5-1.0mol/lnacl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體；(2)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色后融合處理將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlpbs中，并分別加入lμl的dil(細(xì)胞膜紅色熒光探針)和lμldio(細(xì)胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，35℃避光溫育60min。離心去除染色劑，并用pbs緩沖液洗滌2次后懸浮。取等量熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4℃，5000r/min離心10min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml35％peg6000，輕輕搖勻，于30℃靜置60min，離心后沉淀用0.5-1.0mol/lnacl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液。(3)流式細(xì)胞分選融合子建立并選定流式細(xì)胞分選融合子方案，選擇1個細(xì)胞群，調(diào)節(jié)確定合適的放大電壓。以未染色的融合原生質(zhì)體作為對照，選定紅色熒光信號強(qiáng)的區(qū)域p2，再選定同時綠色熒光信號也強(qiáng)的區(qū)域p3，即融合子。進(jìn)樣分選出同時帶兩種熒光信號的融合子，收集于裝有3ml1mol/l山梨醇溶液的收集管中，篩選到融合子占分選細(xì)胞總數(shù)的7％。實施例1-3所述的原生質(zhì)體熒光染色融合后進(jìn)行流式細(xì)胞分選過程，經(jīng)比較得到最適的熒光染色條件：37℃下避光染色30min。對流式篩選到的融合子涂布再生平板，接種接發(fā)酵驗證產(chǎn)量，進(jìn)一步挑選高產(chǎn)菌株。當(dāng)前第1頁12