本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，具體的說是涉及一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應用和成脂分化方法。

背景技術：

骨骼肌肌源性干細胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是成年動物或人肌肉組織中特有的間充質干細胞。作為中胚層起源的一種成體間充質干細胞具有自我更新能力和多項分化的潛能，可在體外分化為血細胞、骨細胞、內皮細胞、神經細胞等系的細胞。骨骼肌干細胞這種功能特性極大地吸引了來自基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學的研究者，給基礎科學的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學的模式，骨骼肌干細胞所具有的修復、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學提供了一個發(fā)展新療法的機會。

MDSCs具有潛在多向分化的干細胞特性，它不僅可以分化為肌肉組織細胞，還可以橫向分化為其他譜系的細胞。在地塞米松和胰島素、異丁基甲基黃嘌呤等誘導下分化為脂肪細胞。脂肪細胞作為美容修復軟組織缺損具有可塑性強、可適應不同缺損形狀的優(yōu)勢。MDSCs的成脂誘導潛能，可使其成為美容修復軟組織缺損的干細胞來源。

目前尚未有專門針對骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的相關內容，中國專利CN104830757A公開了一種間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，其以DMEM/F12為基礎培養(yǎng)基，其中包含F(xiàn)BS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛、胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和鹽酸法舒地爾；中國專利CN105462917A公開了一種牙周膜干細胞成脂分化誘導液，其同樣以DMEM/F12為基礎培養(yǎng)基，其中包含F(xiàn)BS、PRP、吲哚美辛、胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)；雖然上述的誘導培養(yǎng)基都是可以誘導間充質干細胞成脂分化，但是不同來源的干細胞之間由于微環(huán)境的差異，需要自己適宜的誘導分化環(huán)境，而現(xiàn)有的這些培養(yǎng)基在成脂分化率方面較低，并不是適合骨骼肌肌源性干細胞成脂分化。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應用和成脂分化方法，使得所述培養(yǎng)基能夠顯著提升骨骼肌肌源性干細胞成脂分化率。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的培養(yǎng)基，在基礎培養(yǎng)基中包含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、地塞米松、吡格列酮和FBS。

針對現(xiàn)有間充質干細胞成脂分化培養(yǎng)基在誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化時分化率較低的問題，本發(fā)明調整培養(yǎng)基組分，加入了吡格列酮替換現(xiàn)有培養(yǎng)基中的鹽酸法舒地爾、谷氨酰胺以及PRP等組分，達到了較高成脂分化率。

其中，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基在基礎培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5-15μM吡格列酮、體積分數10％的FBS。

同時，在本發(fā)明具體實施方式中培養(yǎng)基可選擇如下任意一項：

(1)在基礎培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

(2)在基礎培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

(3)在基礎培養(yǎng)基中包含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

作為優(yōu)選，所述基礎培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基。

由于本發(fā)明培養(yǎng)基能夠顯著提高骨骼肌肌源性干細胞成脂分化率，故本發(fā)明提出了所述培養(yǎng)基在誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化和/或制備誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化培養(yǎng)基中的應用。

此外，本發(fā)明還提供了一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的方法，將骨骼肌肌源性干細胞接種至本發(fā)明所述培養(yǎng)基中誘導分化。

其中，所述誘導分化為在5％二氧化碳、37℃下誘導分化21天；所述骨骼肌肌源性干細胞的接種密度優(yōu)選為2×10⁴cells/mL；

所述骨骼肌肌源性干細胞可按照本領域常規(guī)方法提取獲得，在本發(fā)明中是按照如下方法制備：

將肌肉組織剪成碎塊并清洗，然后加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混勻后置37℃恒溫搖床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊；消化結束后，1000r/min離心5min，棄上清；加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫搖床中消化15min，消化結束后，1000r/min離心5min，棄上清；加入PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清；加入3倍肌糜體積的PBS反復吹打后經200目濾網過濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清；含20％FBS的DMEM/F12重懸細胞，采用差速貼壁分離技術對MDSCs進行分離，然后進行正常培養(yǎng)、傳代。

所述差速貼壁分離技術具體如下：

將細胞懸液接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分數為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細胞記為PP1，其中未貼壁細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標記為PP3。以后每24h進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據細胞的生長情況進行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細胞生長以及形成集落后每日擴增情況，待細胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

傳代方法可參照如下：

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細胞記數，按8×10⁴cells/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

按照本發(fā)明所述成脂分化方法對骨骼肌肌源性干細胞進行分化，最終份成脂分化率在55％以上，最高可達到84％左右，而作為對照的現(xiàn)有誘導分化方法的分化率均未超過40％，兩者相比具有顯著性差異。同時，檢測成脂細胞標志性基因PPARγ-2、LPL表達水平，結果顯示，本發(fā)明方法分化的成脂細胞PPARγ-2、LPL表達水平遠高于對照方法分化的成脂細胞。

由以上技術方案可知，本發(fā)明優(yōu)化誘導分化培養(yǎng)基組分，以吡格列酮替換現(xiàn)有間充質干細胞中的常用組分，實現(xiàn)了骨骼肌肌源性干細胞成脂分化率的顯著提高效果。

附圖說明

圖1所示為MDSCs P2代40倍形態(tài)圖；

圖2所示為MDSCs P2代100倍形態(tài)圖；

圖3所示為對照組1油紅O染色圖；

圖4所示為對照組2油紅O染色圖；

圖5所示為對照組3油紅O染色圖；

圖6所示為對照組4油紅O染色圖；

圖7所示為實驗組1油紅O染色圖；

圖8所示為實驗組2油紅O染色圖；

圖9所示為實驗組3油紅O染色圖；

圖10所示為各組成脂分化率柱形圖；

圖11所示為各組PPARγ-2表達水平柱形圖；

圖12所示為各組LPL表達水平柱形圖。

具體實施方式

本發(fā)明實施例公開了一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應用和成脂分化方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內。本發(fā)明產品和應用已通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的培養(yǎng)基和方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。

以下就本發(fā)明所提供的一種誘導骨骼肌肌源性干細胞成脂分化的培養(yǎng)基及其應用和成脂分化方法做進一步說明。

實施例1：MDSCs原代分離和純化、傳代培養(yǎng)及鑒定

1、取材

取成人正常顳肌標本(取自于開顱手術患者，患者知情并自愿，標本采集通過正規(guī)醫(yī)院進行，并且不影響患者身體健康)，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗后轉入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎塊，然后移入50mL離心管中，PBS緩沖液吹打沖洗3次，靜置1分鐘后棄上層液及漂浮組織。

2、酶解

向上述獲得的肌肉碎塊加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混勻后置37℃恒溫搖床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊。消化結束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫搖床中消化15min，消化結束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清。加入約3倍肌糜體積的PBS反復吹打后經200目濾網過濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清。生長培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM/F12)重懸細胞。

3、分離與純化

采用差速貼壁分離技術對MDSCs進行分離。將細胞懸液接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分數為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細胞記為PP1，其中未貼壁細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標記為PP3。以后每24h進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據細胞的生長情況進行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細胞生長以及形成集落后每日擴增情況，待細胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

4、MDSCs的傳代培養(yǎng)

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細胞記數，按8×10⁴cells/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

5、MDSCs的鑒定

細胞爬片制作：將無菌蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，對數生長期細胞制備成細胞懸液，按5×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，生長培養(yǎng)基為含20％FBS的DMEM/F12，培養(yǎng)24-48小時，使細胞生長于蓋玻片上。

Desmin、Sca-1免疫細胞化學染色:將放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細胞鋪片5分鐘，重復3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復3次。分別滴加一抗兔抗人結蛋白(Desmin)抗體(1:200稀釋)、兔抗人Sca-1抗體(1:100稀釋)，37℃濕盒內孵育1小時，4℃過夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復染1分鐘，分化返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在鏡下觀察，以胞膜和/或胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性，將陽性的細胞用于后續(xù)誘導分化試驗(MDSCs P2代形態(tài)圖見圖1和圖2)。

實施例2：本發(fā)明所述成脂分化的方法

1、培養(yǎng)基

(1)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

(2)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

(3)在高糖DMEM培養(yǎng)基中包含0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分數10％的FBS；

2、誘導分化方法

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內，培養(yǎng)至細胞達到80％融合以上時，采用實施例3中各組成脂誘導液，誘導分化培養(yǎng)21d后對細胞進行油紅O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表達檢測。

實施例3：成脂分化對比試驗

為了驗證本發(fā)明成脂分化誘導的效果，同時設置4組對照組和3組實驗組，對實驗組和對照組進行油紅O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表達檢測。

對照組1為陰性對照組，為常規(guī)培養(yǎng)組，使用的培養(yǎng)液為：含體積分數10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組2為陽性對照組，為常規(guī)間充質干細胞成脂誘導配方，使用的成脂誘導液為0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組3為陽性對照組，參考CN105462917A中使用的成脂誘導液，配方為：0.1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、10mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、體積分數5％PRP、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組4為陽性對照組，參考CN104830757A使用的成脂誘導液，配方為：1μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、100nM胰島素、200μM吲哚美辛、10nM地塞米松、0.1μM鹽酸法舒地爾、體積分數1％谷氨酰胺、體積分數1％抗生素、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組1中使用的成脂誘導液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組2中使用的成脂誘導液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組3中使用的成脂誘導液為：0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/L胰島素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、體積分數10％FBS，余量為高糖DMEM培養(yǎng)液。

1、油紅O染色

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內，培養(yǎng)至細胞達到80％融合以上時，采用上述各組成脂誘導液，誘導分化培養(yǎng)21d對細胞進行油紅O染色。染色的具體方法為：

棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定15-20min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入油紅O染色液，室溫染色15-20min。結束后吸棄殘液，用37℃預熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，各組細胞染色效果如圖3-9。有染色結果可以大致看出，在本發(fā)明培養(yǎng)基誘導下，成脂細胞數量相對于對照組數量較多。

同時，對油紅O染色的細胞進行計數，計算出各組的分化率進行比較。倒置顯微鏡100倍放大視野下，每孔隨機記數3個視野，計算分化細胞占細胞總數的比例，每次平行計數3個孔，計算平均數。

誘導分化率＝染色陽性細胞數/細胞總數×100％。

各組誘導分化率結果如表1所示，對應柱形圖如圖10所示。

表1誘導分化率結果

注：*，※表示P﹤0.01。

結果顯示培養(yǎng)21d后，對照組1為陰性對照組，不含誘導因子，不對細胞進行成脂分化誘導，因此沒有著色，成脂分化率為零。實驗組1、3與各對照組均有顯著性差異(P﹤0.01，*)；實驗組2與其他各組均有顯著性差異(P﹤0.01，※)；實驗組2中的成脂分化率均值為84.06±1.52％，是常規(guī)誘導分化組(對照組2)的2.65倍，是CN105462917A和CN104830757A中使用的兩種配方的2倍以上。說明本發(fā)明所示的成脂分化誘導液對MDSCs成脂分化誘導的效果最好。

2、PPARγ-2和LPL的表達檢測

按照實驗組或對照組方法對MDSCs進行培養(yǎng)或成脂分化誘導，連續(xù)誘導培養(yǎng)14d和21d后對細胞進行PPARγ-2和LPL的表達檢測。

按TRIzol試劑盒說明書進行細胞總RNA提?。籑-MLV反轉錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說明書對PPARγ-2、LPL表達水平進行檢測。以GAPDH作為內參基因。以2^-△△Ct法進行定量分析。結果如圖11和12所示。

實驗結果表明，細胞誘導培養(yǎng)14d、21d后，在同一時間點，各誘導組與未誘導組(陰性對照組)比較，成脂細胞標志性基因PPARγ-2、LPL表達水平均有極顯著性差異(*，P﹤0.01)，實驗組1、3與各對照組比較，均有極顯著性差異(※，p﹤0.01)，實驗組2與其他各誘導組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利的保護范圍。